Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Huq Muhammad Aminul per l'assistenza fornita nella revisione del manoscritto.

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dai comitati di revisione istituzionali dell'Università di Medicina di Aichi (2017-H341, 2019-H137). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante.
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Per eseguire il test ELISA a sandwich, i reagenti vengono preparati come descritto di seguito.
<ol><li>Tampone di rivestimento:<ol><li>Per ...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Abbiamo descritto un metodo ELISA a sandwich in cui MPO o NE si legano a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Dopo il lavaggio, il "sandwich" viene completato incubando i campioni con un anticorpo monoclonale anti-DNA associato alla perossidasi. Dopo la rimozione dell'anticorpo secondario non legato, il coniugato della perossidasi legata viene rilevato mediante l'aggiunta di un substrato cromogenico di perossidasi ABTS, che produce un prodotto...

Questo articolo delinea un metodo per quantificare la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET) nei fluidi biologici utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per rilevare complessi di mieloperossidasi (MPO) ed elastasi neutrofila (NE) con DNA 1,2. I NET sono composti da una spina dorsale di DNA decorata con proteasi antimicrobiche originate da granuli di neutrofili 3,4. Sia i complessi MPO-DNA che NE-DNA sono componenti importanti e specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET 3,4.
Oltre al loro importante ruolo fisiologico nella difesa antimicrobica3, i NET hanno anche vari effetti patologici4,5, tra cui la promozione della trombogenesi6 e il peggioramento della sepsi7. Di conseguenza, le NET hanno recentemente attirato l'attenzione. Ciononostante, la quantificazione in vivo dei NET si è dimostrata impegnativa a causa della mancanza di un metodo di analisi quantitativa sensibile e affidabile.
Sono disponibili alcuni metodi, tra cui la misurazione diretta dei NET mediante microscopia a fluorescenza8,9 e citometria a flusso 10 e la misurazione indiretta del DNA libero circolante, dei nucleosomi e dell'istone citrullinato H3, ma ogni metodo presenta i propri vantaggi e limiti11. Sebbene il metodo microscopico a immunofluorescenza sia specifico per i NET e mostri chiaramente la localizzazione e il grado di formazione dei NET, i campioni sono limitati al tessuto bioptico e ai materiali secreti. Inoltre, questo metodo deve essere eseguito da ricercatori qualificati e richiede molto tempo per ottenere risultati. Misurare i livelli circolanti di componenti correlati al NET mediante citometria a flusso è facile e fornisce risultati rapidi; tuttavia, il metodo non è specifico per NET12.
Noi13 e altri1,2 abbiamo sviluppato un test altamente sensibile e affidabile per misurare i componenti circolanti del NET, DNA coniugato con MPO o coniugato con NE, nel plasma umano con una tecnica ELISA modificata che utilizza anticorpi specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. Questo saggio può anche essere utilizzato ex vivo per identificare i componenti NET nei surnatanti delle colture cellulari rilasciati dai neutrofili attivati in risposta alla stimolazione del forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Alcuni stimoli, come i microrganismi, inducono i neutrofili a rilasciare trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono fondamentalmente strutture simili a ragnatele composte da DNA con proteine granulari, come la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila (NE), e proteine citoplasmatiche e citoscheletriche. Sebbene l'interesse per i NET sia aumentato di recente, non è disponibile alcun metodo di analisi sensibile e affidabile per la misurazione dei NET in ambito clinico. Questo articolo descrive un saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificato per misurare quantitativamente due componenti dei NET circolanti, i complessi MPO-DNA e NE-DNA, che sono componenti specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET. Il test utilizza anticorpi monoclonali specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. MPO o NE si lega a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Questo test mostra una buona linearità e un'elevata precisione tra saggi e intrados. Lo abbiamo usato in 16 pazienti con COVID-19 con sindrome da distress respiratorio acuto e abbiamo scoperto che le concentrazioni plasmatiche di MPO-DNA e NE-DNA erano significativamente più alte rispetto al plasma ottenuto da controlli sani. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET nel plasma umano e nei surnatanti di coltura.

Questo metodo ha utilizzato un ELISA a sandwich con anticorpi monoclonali anti-MPO, anti-NE e anti-DNA per misurare il DNA associato a MPO e NE (Figura 1). In questo metodo, i pozzetti di una piastra per microtitolazione sono stati rivestiti con un anticorpo monoclonale specifico per MPO o NE specifico per catturare MPO associato al DNA e NE associato al DNA, nonché MPO e NE non associati al DNA. Per calcolare il coefficiente di variabilità (CV) intra-test, sono state eseguite misurazioni ...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

I NET hanno attirato l'attenzione di recente, ma la quantificazione dei NET in vivo si è dimostrata difficile. Questo protocollo fornisce un metodo auspicabile, altamente sensibile e prezioso per studiare le caratteristiche dei NET in ambito clinico. Questa tecnica dovrebbe estendersi per valutare la gravità della sepsi o dell'ARDS settica, sindrome da distress respiratorio acuto.È ampiamente accettato che la regolazione delle discariche o dei pattern molecolari associati al danno sia la chiave per migliorare le condizioni cliniche della sepsi. Il più grande vantaggio di questo metodo è la quantificazione accurata dei residui NET circolanti come la mieloperossidasi-DNA e l'elastasi-DNA neutrofilo in breve tempo. Si consiglia di centrifugare i campioni prima del saggio ed evitare lo scongelamento ripetuto.È importante seguire i tempi di incubazione indicati nel protocollo. Iniziare diluendo neutrofili polimorfonucleati appena isolati a 10.000 cellule per millilitro in RPMI 1640 privo di rosso fenolo. Setacciateli in piastre di coltura da 35 millimetri.Per indurre trappole extracellulari di neutrofili o NET, stimolare prima i neutrofili polimorfonucleati con 25 PMA nanomolari. Quindi digerire parzialmente le trappole extracellulari aggiungendo 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I e incubare la miscela per 50 minuti a temperatura ambiente. Ora, aggiungi EDTA a cinque millimolari per fermare l'attività DNasi e raccogli il mezzo contenente i NET sintetizzati.Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli i surnatanti da quattro controlli sani. Mescolali conservali a meno 80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo.Pipettare 100 microlitri di anti-mieloperossidasi diluita contenente 0,05 microgrammi di anticorpo in una piastra ELISA. A questo punto, coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva per evitare l'evaporazione del campione e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius per consentire il legame degli anticorpi di cattura. Il giorno successivo, scartare la soluzione anticorpale diluita dai pozzetti e pipettare 300 microlitri di soluzione di lavaggio in ciascun pozzetto.Asciugare la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il PBS in eccesso. Bloccare ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di tampone di bloccaggio. Coprilo con una copertura di plastica adesiva e ostruisci i pozzetti incubandolo.Dopo aver eliminato la soluzione bloccante dai pozzetti e aver lavato la piastra tre o quattro volte, asciugarla su un tovagliolo di carta. Successivamente, pipettare 25 microlitri di plasma in tutti i pozzetti tranne il bianco. E diluirlo con 75 microlitri di PBS, portando il volume finale del pozzetto a 100 microlitri.Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS al pozzetto bianco. Miscelare i campioni posizionando la piastra su uno shaker per 10 secondi a 250 giri/min a temperatura ambiente. Aggiungere due microlitri di DNasi I 100 completamente diluita in tutti i pozzetti e posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 10 secondi per mescolare accuratamente i campioni.Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un microlitro di EDTA 0,5 molare a ciascun pozzetto per arrestare la reazione DNasi. Quindi posizionare la piastra sigillata sull'agitatore per 15 secondi per miscelare accuratamente i campioni.Infine, incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius per consentire ai componenti proteici dei NET di attaccarsi agli anticorpi di cattura. Il giorno dopo, scartare la soluzione dai pozzi. Dopo diversi lavaggi del pozzetto, pipettare 100 microlitri dell'anticorpo anti-DNA diluito coniugato con perossidasi in ciascun pozzetto.Incubare la piastra per 1 ora e mezza, quindi scartare la soluzione nei pozzetti. Dopo aver lavato i pozzetti tre volte, pipettare 100 microlitri di soluzione di substrato ABTS in ciascun pozzetto e incubare la piastra sigillata su uno shaker al buio. Arrestare la reazione aggiungendo 50 microlitri di acido solforico bimolare.Mescolare il contenuto del pozzetto picchiettando con cura i lati della piastra. Quindi, collegare il lettore di micropiastre al computer e avviare l'applicazione software. Dalla barra di stato, crea un nuovo esperimento e assegnagli un nome.Quindi impostare i parametri di lettura della piastra selezionando Assorbanza come tipo di lettura, Punto finale come modalità di lettura e due come lunghezze d'onda. Quindi, imposta lambda uno a 405 nanometri, lambda due a 490 nanometri. A questo punto, selezionare lo stato Off sia per Automix che per Blanking mantenendo l'AutoCalibration come On.Quindi selezionare Leggi l'intera piastra in Strips.Infine, impostare la priorità della lunghezza d'onda della colonna con Normale come Velocità del carrello, quindi selezionare Disattivato in Lettura automatica. Posizionare bene la piastra nel cassetto degli strumenti e chiuderla. Fare clic su Leggi in modo che la targa venga letta immediatamente.Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto a 405 nanometri ed eseguire la sottrazione automatica dell'assorbanza del mezzo di analisi da tutti i campioni sconosciuti. Sono state ottenute curve di calibrazione standard affidabili sia per MPO-DNA che per NE-DNA quando i valori di assorbanza non superavano rispettivamente 0,93 e 0,9. L'OD più alto è stato ottenuto quando sono stati applicati 0,6 microgrammi per millilitro di DNasi I.I coefficienti di variabilità tra i test per i complessi nei controlli sani erano rispettivamente 1,871 e 0,987, mentre i pazienti COVID-19 hanno mostrato coefficienti di variabilità rispettivamente di 2,532 e 2,010. I coefficienti medi di variabilità tra i saggi per MPO-DNA e NE-DNA erano rispettivamente 6,524 e 4,389. La specificità degli anticorpi di cattura ai complessi MPO-DNA e NE-DNA ha mostrato che gli anticorpi di controllo iso-tipo reagivano poco ai complessi.La percentuale di entrambi i complessi era più alta nel plasma dei pazienti con COVID-19 rispetto ai controlli sani. Il tempo di digestione della DNasi deve essere ottimizzato, altrimenti un'eccessiva digestione ridurrà l'assorbanza.

Research

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Immunology and Infection

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