Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

저자는 원고 검토에 도움을 준 Huq Muhammad Aminul 박사에게 감사를 표합니다.

본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 아이치 의과대학 임상시험심사위원회(2017-H341, 2019-H137)의 승인을 받았다. 각 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.
1. 시약 준비
참고: 샌드위치 ELISA 분석을 수행하기 위해 시약은 아래에 설명된 대로 준비됩니다.
<ol><li>코팅 버퍼:<ol><li>0.1 mol/L 탄산염-중탄산염 완충액을 만들기 위해 무수 탄?...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

본 발명자들은 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 배양 동안 MPO 또는 NE가 포획 항체의 한 부위에 결합하는 샌드위치 ELISA 방법을 설명하였다. 세척 후, "샌드위치"는 샘플을 퍼옥시다아제-관련 항-DNA 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션함으로써 완성된다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거한 후, 발색 ABTS 과산화효소 기질을 첨가하여 결합된 퍼옥시다제 접합체를 검출하고, 이는 405nm에?...

이 기사에서는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 DNA 1,2와 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)의 복합체를 검출함으로써 생물학적 체액에서 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다. NET은 호중구 과립 3,4에서 유래한 항균 프로테아제로 장식된 DNA 골격으로 구성됩니다. MPO-DNA와 NE-DNA 복합체는 모두 NET의 중요하고 특정한 구성 요소이며 NET 3,4의 분해 산물로서 세포외 공간으로 방출됩니다.
NET은 항균 방어3에서 중요한 생리학적 역할 외에도 혈전 형성6의촉진과 패혈증7의 악화를 포함하여 다양한 병리학적 효과4,5를 가지고있다. 이에 따라 최근 NET이 주목받고 있다. 그럼에도 불구하고 NET의 생체 내 정량화는 민감하고 신뢰할 수 있는 정량 분석 방법이 없기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다.
형광 현미경 8,9 및 유세포 분석(flow cytometry)10에 의한 NET의 직접 측정과 순환 cell-free DNA, 뉴클레오솜 및 시트룰린화 히스톤 H3의 간접 측정을 포함하여 몇 가지 방법을 사용할 수 있지만, 각 방법에는 고유한 장점과 한계가 있습니다11. 면역형광 현미경 방법은 NET에 특이적이며 국소화 및 NET 형성 정도를 명확하게 보여주지만 샘플은 생검 조직 및 분비 물질로 제한됩니다. 또한, 이 방법은 숙련된 연구원이 수행해야 하며 결과를 얻는 데 오랜 시간이 필요합니다. 유세포 분석을 통해 NET 관련 구성 요소의 순환 수준을 측정하는 것은 쉽고 결과를 빠르게 제공합니다. 그러나 이 방법은 NET12에만 국한되지 않습니다.
우리13 및 기타 1,2는 MPO 또는 NE에 대한 특이적 항체를 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로 사용하는 변형된 ELISA 기술을 사용하여 인간 혈장에서 순환하는 NET 성분, MPO-접합 또는 NE-접합 DNA를 측정하기 위한 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 분석법을 개발했습니다. 이 분석은 또한 생체 외에서 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) 자극에 반응하여 활성화된 호중구에 의해 방출되는 세포 배양 상청액의 NET 성분을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

미생물과 같은 특정 자극은 호중구가 호중구 세포외 트랩(NET)을 방출하게 하는데, 이는 기본적으로 골수과산화효소(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)와 같은 과립 단백질과 세포질 및 세포골격 단백질이 있는 DNA로 구성된 거미줄과 같은 구조입니다. 최근 NET에 대한 관심이 높아졌지만 임상 환경에서 NET을 측정하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 분석 방법은 없습니다. 이 기사에서는 순환 NET의 두 가지 구성 요소인 MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석에 대해 설명하며, 이는 NET의 특정 구성 요소이며 NET의 분해 산물로 세포외 공간으로 방출됩니다. 상기 분석은 포획 항체 및 DNA 특이적 검출 항체로서 MPO 또는 NE에 대한 특이적 단일클론 항체를 사용한다. MPO 또는 NE는 MPO-DNA 또는 NE-DNA 복합체를 함유하는 샘플의 초기 인큐베이션 동안 포획 항체의 한 부위에 결합한다. 이 분석은 우수한 선형성과 높은 분석 간 및 분석 내 정밀도를 보여줍니다. 우리는 급성 호흡 곤란 증후군을 동반하는 COVID-19 환자 16 명에게 사용했으며 MPO-DNA 및 NE-DNA의 혈장 농도가 건강한 대조군에서 얻은 혈장보다 유의하게 높다는 것을 발견했습니다. 이 검출 분석은 인간 혈장 및 배양 상청액에서 NET의 특성을 조사하기 위한 신뢰할 수 있고 매우 민감하며 유용한 방법입니다.

이 방법은 MPO 관련 및 NE 관련 DNA를 측정하기 위해 항-MPO, 항-NE 및 항-DNA 단클론 항체와 함께 샌드위치 ELISA를 사용했습니다(그림 1). 이 방법에서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 MPO-특이적 또는 NE-특이적 단일클론 항체로 코팅하여 DNA-연관 MPO 및 DNA-연관 NE 뿐만 아니라, 비-DNA-연관 MPO 및 NE를 포획하였다. 분석 내 가변성 계수(CV)를 계산하기 위해 COVID-19 환자와 건강한 대조군...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET은 최근 주목을 받고 있지만 생체 내에서 NET을 정량화하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 임상 환경에서 NET의 특성을 조사하기 위한 바람직하고 매우 민감하며 가치 있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 패혈증 또는 패혈성 ARDS의 중증도, 급성 호흡 곤란 증후군을 평가하기 위해 확장되어야 합니다.덤프 또는 손상 관련 분자 패턴을 조절하는 것이 패혈증의 임상 상태를 개선하는 열쇠라는 것이 널리 받아들여지고 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 골수과산화효소-DNA 및 호중구 엘라스타제-DNA와 같은 순환하는 NET 잔여물을 단시간에 정확하게 정량화하는 것입니다. 분석 전에 샘플을 회전시키고 반복적인 해동을 피하는 것이 좋습니다.프로토콜에 주어진 잠복기를 따르는 것이 중요합니다. 갓 분리된 다형핵 호중구를 페놀 레드가 없는 RPMI 1640에서 밀리리터당 10, 000 세포로 희석하는 것으로 시작하십시오. 35 밀리미터 배양 접시에 체로 치십시오.호중구 세포외 트랩 또는 NET을 유도하려면 먼저 25나노몰 PMA로 다형핵 호중구를 자극합니다. 이어서, DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로그램을 첨가하여 세포외 트랩을 부분적으로 소화시키고, 혼합물을 실온에서 50분 동안 인큐베이션한다. 이제 5밀리몰 EDTA를 추가하여 DNase 활성을 중지하고 합성된 NET이 포함된 배지를 수집합니다.세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리기. 4개의 건강한 대조군에서 상층액을 수집합니다. 믹스 추가 사용을 위해 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.0.05 마이크로 그램의 항체를 함유 한 희석 된 항 -골수과산화 효소 100 마이크로 리터를 ELISA 플레이트에 피펫으로 넣습니다. 이제 시료 증발을 방지하기 위해 접착식 플라스틱 덮개로 플레이트를 덮고 섭씨 4도에서 밤새 시료를 배양하여 포획 항체가 결합할 수 있도록 합니다. 다음날, 희석된 항체 용액을 웰로부터 버리고, 300 마이크로리터의 세척 용액을 각각의 웰에 피펫팅한다.종이 타월로 접시를 두드려 물기를 제거하여 여분의 PBS를 제거합니다. 플레이트의 각 웰을 200 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 블로킹한다. 접착 플라스틱 덮개로 덮고 부화하여 우물을 막습니다.우물에서 차단 용액을 버리고 플레이트를 3-4 번 세척 한 후 종이 타월로 두드려 말립니다. 다음으로, 블랭크를 제외한 모든 웰에 25 마이크로리터의 혈장을 피펫팅한다. 이를 75 마이크로리터의 PBS로 희석하여, 최종 웰 부피를 100 마이크로리터로 만든다.그런 다음 블랭크 웰에 100 마이크로 리터의 PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 250rpm으로 10초 동안 진탕기에 올려놓음으로써 샘플을 혼합한다. 100 완전히 희석된 DNase I 2마이크로리터를 모든 웰에 첨가하고, 밀봉된 플레이트를 10초 동안 쉐이커에 올려 샘플을 완전히 혼합한다.실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 각 웰에 1마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 DNase 반응을 중지시킨다. 그런 다음 밀봉된 플레이트를 셰이커에 15초 동안 올려 샘플을 완전히 혼합합니다.마지막으로, 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양하여 NET의 단백질 성분이 포획 항체에 부착되도록 합니다. 다음날, 우물에서 용액을 버리십시오. 여러 웰 세척 후, 희석된 퍼옥시다아제 접합 항-DNA 검출 항체 100 마이크로리터를 각 웰에 피펫팅한다.플레이트를 1 1/2 시간 동안 배양 한 다음 용액을 웰에 버립니다. 웰을 3회 세척한 후, 100 마이크로리터의 ABTS 기질 용액을 각 웰 내로 피펫팅하고, 밀봉된 플레이트를 암실에서 진탕기 상에서 인큐베이션한다. 50 마이크로 리터의 2 몰 황산을 첨가하여 반응을 중지하십시오.접시 측면을 조심스럽게 두드려 우물 내용물을 섞습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어 응용 프로그램을 시작합니다. 상태 표시줄에서 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다.그런 다음 Absorbance를 판독 유형으로, Endpoint를 판독 모드로, two를 파장으로 선택하여 플레이트 판독 파라미터를 설정합니다. 다음으로 람다 1을 405 나노 미터로, 람다 2를 490 나노 미터로 설정합니다. 이제 AutoCalibration을 On으로 유지하면서 Automix와 Blanking 모두에 대해 Off 상태를 선택합니다.그런 다음 Strips에서 Read entire plate를 선택합니다.마지막으로 Normal(보통)을 Carriage Speed(캐리지 속도)로 Column Wavelength Priority(열 파장 우선 순위)를 설정한 다음 AutoRead(자동 읽기)에서 Off(끄기)를 선택합니다. 플레이트를 악기 서랍에 잘 넣고 닫습니다. 읽기를 클릭하면 플레이트를 즉시 읽을 수 있습니다.405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 판독하고, 모든 미지의 샘플에서 분석 배지 흡광도의 자동 뺄셈을 수행합니다. 흡광도 값이 각각 0.93 및 0.9를 초과하지 않았을 때 MPO-DNA 및 NE-DNA 모두에 대해 신뢰할 수 있는 표준 검량선이 얻어졌다. 가장 높은 OD는 DNase I의 밀리리터 당 0.6 마이크로 그램이 적용되었을 때 얻어졌다.건강한 대조군의 복합체에 대한 분석 간 변동 계수는 각각 1.871 및 0.987이었고, COVID-19 환자는 각각 2.532 및 2.010의 변동 계수를 보였다. MPO-DNA 및 NE-DNA에 대한 평균 분석간 가변성 계수는 각각 6.524 및 4.389였다. MPO-DNA 및 NE-DNA 복합체에 대한 포획 항체의 특이성은 이소형 대조군 항체가 복합체에 거의 반응하지 않는다는 것을 보여주었습니다.두 복합체의 비율은 건강한 대조군에 비해 COVID-19 환자의 혈장에서 더 높았습니다. DNase 소화 시간을 최적화해야 하며, 그렇지 않으면 과도한 소화는 흡광도를 감소시킵니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...