Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for hjelp til å gjennomgå manuskriptet.

Denne studien ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av institusjonelle gjennomgangsnemnder ved Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra hver enkelt deltaker.
1. Forberedelse av reagens
MERK: For å utføre sandwich ELISA-analysen, fremstilles reagensene som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Belegg buffer:<ol><li>For å lage en 0,1 mol/l karbonat-bikarbonatbuffer, veier ...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode der MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Etter vask blir "sandwich" fullført ved å inkubere prøvene med et peroksidase-assosiert anti-DNA monoklonalt antistoff. Etter fjerning av ubundet sekundært antistoff detekteres det bundne peroksidasekonjugatet ved tilsetning av et kromogent ABTS-peroksidasesubstrat, som gir et løselig sluttprodukt som kan leses spektrofotome...

Denne artikkelen skisserer en metode for å kvantifisere dannelse av nøytrofil ekstracellulær felle (NET) i biologiske væsker ved å bruke sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å oppdage komplekser av myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) med DNA 1,2. NET er sammensatt av en DNA-ryggrad dekorert med antimikrobielle proteaser som stammer fra nøytrofile granulater 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er viktige og spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET 3,4.
I tillegg til deres viktige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3, har NET også forskjellige patologiske effekter4,5, inkludert fremme av trombogenese6 og forverring av sepsis7. Følgelig har NET fått oppmerksomhet nylig. Likevel har in vivo-kvantifiseringen av NET vist seg utfordrende på grunn av mangelen på en sensitiv, pålitelig kvantitativ analysemetode.
Noen få metoder er tilgjengelige, inkludert direkte måling av NET ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling av sirkulerende cellefritt DNA, nukleosomer og citrullinert histon H3, men hver metode har sine egne fordeler og begrensninger11. Selv om immunfluorescensmikroskopisk metode er spesifikk for NET og tydelig viser lokalisering og grad av NET-dannelse, er prøvene begrenset til biopsivev og utskilte materialer. Dessuten må denne metoden utføres av dyktige forskere og krever lang tid for at resultatene skal oppnås. Måling av sirkulerende nivåer av NET-relaterte komponenter ved flowcytometri er enkelt og gir resultater raskt; Metoden er imidlertid ikke spesifikk for NET12.
Vi13 og andre1,2 har utviklet en svært sensitiv og pålitelig analyse for å måle de sirkulerende NET-komponentene, MPO-konjugert eller NE-konjugert DNA, i humant plasma med en modifisert ELISA-teknikk som bruker spesifikke antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. Denne analysen kan også brukes ex vivo for å identifisere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigjort av aktiverte nøytrofiler som respons på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Visse stimuli, som mikroorganismer, forårsaker at nøytrofiler frigjør nøytrofile ekstracellulære feller (NET), som i utgangspunktet er nettlignende strukturer sammensatt av DNA med granulproteiner, som myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE), og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selv om interessen for NET har økt den siste tiden, finnes det ingen sensitiv og pålitelig analysemetode for måling av NET i kliniske settinger. Denne artikkelen beskriver en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse for kvantitativt å måle to komponenter av sirkulerende NET, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET. Analysen bruker spesifikke monoklonale antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Denne analysen viser god linearitet og høy inter-assay og intra-assay presisjon. Vi brukte det hos 16 pasienter med COVID-19 med tilhørende akutt lungesviktsyndrom og fant at plasmakonsentrasjonene av MPO-DNA og NE-DNA var signifikant høyere enn i plasma oppnådd fra friske kontroller. Denne deteksjonsanalysen er en pålitelig, svært sensitiv og nyttig metode for å undersøke egenskapene til NET i humane plasma- og kultursupernatanter.

Denne metoden brukte en sandwich ELISA med anti-MPO, anti-NE og anti-DNA monoklonale antistoffer for å måle MPO-assosiert og NE-assosiert DNA (figur 1). I denne metoden ble brønnene til en mikrotiterplate belagt med et MPO-spesifikt eller NE-spesifikt monoklonalt antistoff for å fange DNA-assosiert MPO og DNA-assosiert NE, samt ikke-DNA-assosiert MPO og NE. For å beregne variabilitetskoeffisienten (CV) ble det utført dupliserte målinger innenfor samme plate for 30 prøver samlet inn f...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Vi presenterer en protokoll for en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyseteknikk for kvantitativt å måle to komponenter av nøytrofile ekstracellulære fellerestere, myeloperoksidase konjugert-DNA og nøytrofile elastase konjugerte DNA-komplekser, avledet fra aktiverte nøytrofiler.

Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET har fått oppmerksomhet den siste tiden, men kvantifisering av NET in vivo har vist seg å være utfordrende. Denne protokollen gir en ønskelig, svært sensitiv og verdifull metode for å undersøke egenskapene til NET i kliniske omgivelser. Denne teknikken bør strekke seg for å evaluere alvorlighetsgraden av sepsis eller septisk ARDS, akutt respiratorisk nødsyndrom.Det er allment akseptert at regulering av dumper eller skadeassosierte molekylære mønstre er en nøkkel til å forbedre den kliniske tilstanden til sepsis. Den største fordelen med denne metoden inkluderer nøyaktig kvantifisering av sirkulerende NET-rester som myeloperoksidase-DNA og nøytrofil elastase-DNA på kort tid. Det anbefales å spinne prøvene før analysen og unngå gjentatt tining.Det er viktig å følge inkubasjonstidene som angitt i protokollen. Begynn med å fortynne ferskt isolerte polymorfonukleære nøytrofiler til 10.000 celler per milliliter i fenolrødfri RPMI 1640. Sikt dem i 35 millimeter kulturretter.For å indusere nøytrofile ekstracellulære feller eller NET, må du først stimulere polymorfonukleære nøytrofiler med 25 nanomolar PMA. Deretter fordøyer du delvis de ekstracellulære fellene ved å tilsette 0,6 mikrogram per milliliter DNase I, og inkuber blandingen i 50 minutter ved romtemperatur. Legg nå til fem millimolar EDTA for å stoppe DNase-aktiviteten, og samle mediet som inneholder de syntetiserte NET-ene.Sentrifuge for å fjerne celleavfallet. Samle supernatantene fra fire sunne kontroller. Bland oppbevar dem ved minus 80 grader Celsius for videre bruk.Pipette 100 mikroliter fortynnet anti-myeloperoksidase inneholdende 0,05 mikrogram antistoff i en ELISA-plate. Dekk nå platen med et klebende plastdeksel for å forhindre prøvefordampning, og inkuber prøven over natten ved fire grader Celsius for å tillate binding av fangstantistoffene. Neste dag kastes den fortynnede antistoffoppløsningen fra brønnene og pipetter 300 mikroliter vaskeoppløsning i hver brønn.Trykk tallerkenen tørr på et papirhåndkle for å fjerne overflødig PBS. Blokker hver brønn på platen med 200 mikroliter av blokkeringsbufferen. Dekk det med et selvklebende plastdeksel, og hindre brønnene ved å inkubere det.Etter å ha kastet blokkeringsløsningen fra brønnene og vasket platen tre til fire ganger, tørk den tørr på et papirhåndkle. Deretter pipetter 25 mikroliter plasma inn i alle brønner unntatt blankt. Og fortynn den med 75 mikroliter PBS, noe som gjør det endelige brønnvolumet 100 mikroliter.Deretter tilsettes 100 mikroliter PBS til den tomme brønnen. Bland prøvene ved å plassere platen på en shaker i 10 sekunder ved 250 o / min ved romtemperatur. Tilsett to mikroliter 100 fullt fortynnet DNase I til alle brønner, og legg den forseglede platen på shakeren i 10 sekunder for å blande prøvene grundig.Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Legg til en mikroliter 0,5 molar EDTA til hver brønn for å stoppe DNase-reaksjonen. Legg deretter den forseglede platen på shakeren i 15 sekunder for å blande prøvene grundig.Til slutt, inkuber platen over natten ved fire grader Celsius for å la proteinkomponentene i NET feste seg til fangstantistoffene. Neste dag kastes løsningen fra brønnene. Etter flere brønnvasker pipetter 100 mikroliter av det fortynnede peroksidase-konjugerte anti-DNA-deteksjonsantistoffet i hver brønn.Inkuber platen i 1 1/2 time, og kast deretter løsningen i brønnene. Etter å ha vasket brønnene tre ganger, pipetter 100 mikroliter ABTS-substratløsning i hver brønn, og inkuber den forseglede platen på en shaker i mørket. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 mikroliter to-molar svovelsyre.Bland brønninnholdet ved å banke forsiktig på platesidene. Deretter kobler du mikroplateleseren til datamaskinen og starter programvaren. Opprett et nytt eksperiment på statuslinjen, og gi det et navn.Sett deretter plateavlesningsparametrene ved å velge Absorbans som lesetype, Endepunkt som lesemodus og to som bølgelengder. Sett deretter lambda en som 405 nanometer, lambda to som 490 nanometer. Nå velger du Av-status for både Automix og Blanking mens du beholder AutoCalibration som On.Then velger du Les hele platen under Strips.Til slutt angir du Kolonnebølgelengdeprioritet med Normal som Transporthastighet, og deretter velger du Av under AutoRead. Plasser platen godt i instrumentskuffen og lukk den. Klikk på Les slik at platen leses umiddelbart.Les absorbansen til hver brønn ved 405 nanometer, og utfør automatisk subtraksjon av analysemediumabsorbansen fra alle ukjente prøver. Pålitelige standard kalibreringskurver ble oppnådd for både MPO-DNA og NE-DNA når absorbansverdiene ikke oversteg henholdsvis 0,93 og 0,9. Den høyeste OD ble oppnådd når 0,6 mikrogram per milliliter DNase I ble påført.Variabilitetskoeffisientene mellom analysene for kompleksene hos friske kontroller var henholdsvis 1,871 og 0,987, mens COVID-19-pasientene viste variabilitetskoeffisienter på henholdsvis 2,532 og 2,010. De gjennomsnittlige variabilitetskoeffisientene mellom analysene for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 6,524 og 4,389. Fangstantistoffenes spesifisitet mot MPO-DNA- og NE-DNA-kompleksene viste at iso-type kontrollantistoffene reagerte lite på kompleksene.Prosentandelen av begge kompleksene var høyere i plasma fra pasienter med COVID-19 i forhold til de friske kontrollene. DNase fordøyelsestid bør optimaliseres, ellers vil overdreven fordøyelse redusere absorbansen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklede menneske Nøytrofile Ekstracellulære Traps (NET) Isolasjon og håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel Fluorescens analyse for Kvantifisering av Canine nøytrofile ekstracellulær felle utløsning

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisert image-basert kvantifisering av nøytrofile ekstracellulære feller bruke NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

En høy gjennomstrømming analysen vurdere og kvantifisere nøytrofile ekstracellulære felle formasjon

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifikasjon av nøytrofile ekstracellulære feller i parafininnebygd feline arteriell trombi ved hjelp av immunofluorescens mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk og kompositorisk analyse av nøytrofile ekstracellulære feller indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...