Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Os autores agradecem ao Dr. Huq Muhammad Aminul pela assistência na revisão do manuscrito.

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelos comitês de revisão institucional da Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante.
1. Preparação dos reagentes
NOTA: Para realizar o ensaio ELISA sanduíche, os reagentes são preparados conforme descrito abaixo.
<ol><li>Tampão de revestimento:<ol><li>Para fazer um tampão carbon...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Descrevemos um método de ELISA sanduíche no qual MPO ou NE se liga a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Após a lavagem, o "sanduíche" é completado incubando as amostras com um anticorpo monoclonal anti-DNA associado à peroxidase. Após a remoção do anticorpo secundário não ligado, o conjugado peroxidase ligado é detectado pela adição de um substrato cromogênico ABTS peroxidase, que produz um produto final solúvel que pode ser lid...

Este artigo descreve um método para quantificar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET) em fluidos biológicos usando ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA) para detectar complexos de mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE) com DNA 1,2. As NETs são compostas por uma espinha dorsal de DNA decorada com proteases antimicrobianas originárias de grânulos de neutrófilos 3,4. Tanto o MPO-DNA quanto o NE-DNA complexos são componentes importantes e específicos das NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação das NETs 3,4.
Além de seu importante papel fisiológico na defesa antimicrobiana3, os TNEs também apresentam vários efeitos patológicos4,5, incluindo a promoção da trombogênese6 e o agravamento da sepse7. Nesse sentido, as NETs vêm ganhando atenção recentemente. No entanto, a quantificação in vivo de NETs tem se mostrado desafiadora devido à falta de um método de ensaio quantitativo sensível e confiável.
Alguns métodos estão disponíveis, incluindo a medida direta de NETs por microscopia de fluorescência8,9 e citometria de fluxo10 e a medida indireta de DNA livre de células circulantes, nucleossomos e histona citrulinada H3, mas cada método tem suas próprias vantagens elimitações11. Embora o método microscópico de imunofluorescência seja específico para NETs e mostre claramente a localização e o grau de formação de NETs, as amostras são limitadas a tecido de biópsia e materiais secretados. Além disso, esse método precisa ser realizado por pesquisadores capacitados e requer muito tempo para que os resultados sejam obtidos. A medição dos níveis circulantes de componentes relacionados à NET por citometria de fluxo é fácil e fornece resultados rapidamente; no entanto, o método não é específico para NETs12.
Nós13 e outros1,2 desenvolvemos um ensaio altamente sensível e confiável para medir os componentes NET circulantes, DNA conjugado com MPO ou NE, em plasma humano com uma técnica de ELISA modificada que usa anticorpos específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção específico para DNA. Este ensaio também pode ser usado ex vivo para identificar componentes NET em sobrenadantes de cultura celular liberados por neutrófilos ativados em resposta à estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Certos estímulos, como microrganismos, fazem com que os neutrófilos liberem armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são basicamente estruturas semelhantes a teias compostas por DNA com proteínas de grânulos, como mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE), e proteínas citoplasmáticas e citoesqueléticas. Embora o interesse em NETs tenha aumentado recentemente, nenhum método de ensaio sensível e confiável está disponível para medir NETs em ambientes clínicos. Este artigo descreve um ensaio imunoenzimático modificado em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de NETs circulantes, complexos MPO-DNA e NE-DNA, que são componentes específicos de NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação de NETs. O ensaio utiliza anticorpos monoclonais específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção DNA-específico. MPO ou NE liga-se a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Este ensaio apresenta boa linearidade e alta precisão interensaio e intraensaio. Nós o usamos em 16 pacientes com COVID-19 com a síndrome do desconforto respiratório agudo associada e descobrimos que as concentrações plasmáticas de MPO-DNA e NE-DNA eram significativamente mais altas do que no plasma obtido de controles saudáveis. Este ensaio de detecção é um método confiável, altamente sensível e útil para investigar as características das NETs em sobrenadantes de plasma e cultura humanos.

Esse método utilizou um ELISA sanduíche com anticorpos monoclonais anti-MPO, anti-NE, e anti-DNA para medir o DNA associado à MPO e ao NE-associado (Figura 1). Neste método, os poços de uma placa de microtitulação foram revestidos com um anticorpo monoclonal específico para MPO ou NE-específico para capturar MPO associado ao DNA e NE, bem como MPO e NEs não associados ao DNA. Para calcular o coeficiente de variabilidade intra-ensaio (CV), medidas duplicadas foram realizadas dentro ...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs têm atraído atenção recente, mas quantificar NETs in vivo tem se mostrado desafiador. Esse protocolo fornece um método desejável, altamente sensível e valioso para investigar as características dos TNEs em ambientes clínicos. Essa técnica deve se estender para avaliar a gravidade da sepse ou SDRA séptica, síndrome do desconforto respiratório agudo.É amplamente aceito que a regulação de dumps ou padrões moleculares associados a danos é a chave para melhorar a condição clínica da sepse. A maior vantagem deste método inclui a quantificação precisa de remanescentes de NET circulantes como mieloperoxidase-DNA e DNA elastase-neutrófilo em um curto espaço de tempo. É aconselhável girar as amostras antes do ensaio e evitar descongelamentos repetidos.É importante seguir os tempos de incubação conforme indicado no protocolo. Comece diluindo neutrófilos polimorfonucleares recém-isolados para 10.000 células por mililitro em RPMI 1640 livre de fenol vermelho. Peneire-os em pratos de cultura de 35 milímetros.Para induzir armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs, primeiro estimular os polimorfonucleares neutrófilos com PMA 25 nanomolares. Em seguida, digerir parcialmente as armadilhas extracelulares adicionando 0,6 microgramas por mililitro de DNase I e incubar a mistura por 50 minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione EDTA de cinco milimolares para interromper a atividade da DNase e colete o meio que contém as NETs sintetizadas.Centrífuga para remover os detritos celulares. Colete os sobrenadantes de quatro controles saudáveis. Misture-os a menos 80 graus Celsius para uso posterior.Pipetar 100 microlitros de antimieloperoxidase diluída contendo 0,05 microgramas do anticorpo para uma placa de ELISA. Agora, cubra a placa com uma tampa plástica adesiva para evitar a evaporação da amostra e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ligação dos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução de anticorpos diluída dos poços e pipete 300 microlitros de solução de lavagem em cada poço.Toque o prato seco em um papel toalha para remover o excesso de PBS. Bloqueie cada poço da placa com 200 microlitros do tampão de bloqueio. Cubra-o com uma tampa plástica adesiva e obstrua os poços incubando-o.Depois de descartar a solução de bloqueio dos poços e lavar o prato de três a quatro vezes, seque-o em um papel toalha. Em seguida, pipetar 25 microlitros de plasma em todos os poços, exceto o branco. E diluir com 75 microlitros de PBS, fazendo com que o volume final do poço seja de 100 microlitros.Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS ao poço em branco. Misturar as amostras colocando a placa num agitador durante 10 segundos a 250 rpm à temperatura ambiente. Adicione dois microlitros de 100 DNase I totalmente diluída em todos os poços e coloque a placa selada no agitador por 10 segundos para misturar bem as amostras.Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicione um microlitro de EDTA 0,5 molar a cada poço para interromper a reação da DNase. Em seguida, coloque a placa selada no agitador por 15 segundos para misturar bem as amostras.Finalmente, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que os componentes proteicos das NETs se liguem aos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução dos poços. Após várias lavagens de poços, pipetar 100 microlitros do anticorpo anti-detecção de DNA conjugado com peroxidase diluído em cada poço.Incubar a placa por 1 hora e meia e, em seguida, descartar a solução nos poços. Depois de lavar os poços três vezes, pipetar 100 microlitros de solução de substrato ABTS em cada poço e incubar a placa selada em um agitador no escuro. Pare a reação adicionando 50 microlitros de ácido sulfúrico de dois molares.Misture o conteúdo do poço batendo cuidadosamente nas laterais da placa. Em seguida, conecte o leitor de microplacas ao computador e inicie o aplicativo de software. Na barra de status, crie um novo experimento e nomeie-o.Em seguida, defina os parâmetros de leitura da placa selecionando Absorbância como o tipo de leitura, Ponto de extremidade como o modo de leitura e dois como os comprimentos de onda. Em seguida, defina lambda um como 405 nanômetros, lambda dois como 490 nanômetros. Agora, selecione o status Desativado para Automix e Blanking, mantendo a AutoCalibração como On.Em seguida, selecione Ler chapa inteira em Tiras.Finalmente, defina a Prioridade do Comprimento de Onda da Coluna com Normal como a Velocidade do Carro e selecione Desativado em Leitura Automática. Coloque bem a placa na gaveta do instrumento e feche-a. Clique em Ler para que a placa seja lida imediatamente.Leia a absorbância de cada poço a 405 nanômetros e realize a subtração automática da absorbância do meio de ensaio de todas as amostras desconhecidas. Curvas padrão confiáveis de calibração foram obtidas para MPO-DNA e NE-DNA quando os valores de absorbância não excederam 0,93 e 0,9, respectivamente. A maior DO foi obtida quando se aplicou 0,6 microgramas por mililitro de DNase I.Os coeficientes de variabilidade interensaio para os complexos em controles saudáveis foram 1,871 e 0,987, respectivamente, enquanto os pacientes COVID-19 mostraram coeficientes de variabilidade de 2,532 e 2,010, respectivamente. Os coeficientes médios de variabilidade interensaio para MPO-DNA e NE-DNA foram 6,524 e 4,389, respectivamente. A especificidade dos anticorpos de captura para os complexos MPO-DNA e NE-DNA mostrou que os anticorpos de controle do isotipo reagiram pouco aos complexos.A porcentagem de ambos os complexos foi maior no plasma de pacientes com COVID-19 em relação aos controles saudáveis. O tempo de digestão da DNase deve ser otimizado, caso contrário, a digestão excessiva reduzirá a absorbância.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Imunologia e Infecção

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...