Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Хука Мухаммада Аминула за помощь в рецензировании рукописи.

Данное исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено институциональными наблюдательными советами Медицинского университета Айти (2017-H341, 2019-H137). От каждого участника было получено письменное информированное согласие.
1. Приготов?...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Нами описан метод сэндвич-ИФА, при котором МПО или НЭ связываются с одним сайтом захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. После промывки «бутерброд» завершается инкубацией образцов с пероксидаза-ассоциированным анти-ДНК моноклона?...

В статье описан метод количественной оценки образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ) в биологических жидкостях с помощью сэндвич-ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА) для выявления комплексов миелопероксидазы (МПО) и нейтрофильной эластазы (НЭ) с ДНК 1,2. НВЛ состоят из ДНК-каркаса, украшенного антимикробными протеазами, происходящими из гранул нейтрофилов 3,4. Комплексы МПО-ДНК и НЭ-ДНК являются важными и специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ 3,4.
Помимо своей важной физиологической роли в противомикробной защите3, НВЛ также оказывают различные патологические эффекты4,5, включая стимулирование тромбогенеза6 и ухудшение сепсиса7. Соответственно, в последнее время НЭО привлекают к себе внимание. Тем не менее, количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей из-за отсутствия чувствительного и надежного метода количественного анализа.
Существует несколько методов, в том числе прямое измерение НВЛ с помощью флуоресцентной микроскопии8,9 и проточной цитометрии 10, а также косвенное измерение циркулирующей внеклеточной ДНК, нуклеосом и цитруллинированного гистонов H3, но каждый метод имеет свои преимущества и ограничения11. Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный микроскопический метод специфичен для НВЛ и четко показывает локализацию и степень образования НВЛ, образцы ограничиваются биопсийной тканью и секретируемыми материалами. Более того, этот метод должен выполняться квалифицированными исследователями и требует длительного времени для получения результатов. Измерение циркулирующих уровней компонентов, связанных с НВЛ, с помощью проточной цитометрии является простым и быстрым получением результатов; однако этот метод не является специфичным для NETs12.
Мы13 и другие1,2 разработали высокочувствительный и надежный анализ для измерения циркулирующих компонентов НВЛ, МПО-конъюгированной или NE-конъюгированной ДНК, в плазме крови человека с помощью модифицированной методики ИФА, которая использует специфические антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. Этот анализ также может быть использован ex vivo для идентификации компонентов НВЛ в супернатантах клеточных культур, высвобождаемых активированными нейтрофилами в ответ на стимуляцию форболом-12-миристат-13-ацетатом (ПМА).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Некоторые раздражители, такие как микроорганизмы, заставляют нейтрофилы высвобождать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые в основном представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из ДНК с гранулярными белками, такими как миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза (НЭ), а также цитоплазматические и цитоскелетные белки. Несмотря на то, что интерес к НВЛ в последнее время возрос, не существует чувствительного и надежного метода анализа для измерения НВЛ в клинических условиях. В данной статье описан модифицированный сэндвич-фермент-связанный иммуносорбентный анализ для количественного измерения двух компонентов циркулирующих НВЛ, комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК, которые являются специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ. В анализе используются специфические моноклональные антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. МПО или НЭ связывается с одним участком захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. Этот анализ показывает хорошую линейность и высокую межпробирную и внутрипробную точность. Мы использовали его у 16 пациентов с COVID-19 с сопутствующим острым респираторным дистресс-синдромом и обнаружили, что плазменные концентрации МПО-ДНК и НЭ-ДНК были достоверно выше, чем в плазме, полученной от здоровых контрольных групп. Этот детектирующий анализ является надежным, высокочувствительным и полезным методом для исследования характеристик НВЛ в плазме крови и надосадочной жидкости культуры.

В этом методе использовали сэндвич-ИФА с моноклональными антителами к МПО, анти-НЭ и анти-ДНК для измерения МПО-ассоциированной и НЭ-ассоциированной ДНК (рис. 1). В этом методе лунки микротитровой пластины покрывали МПО-специфическим или НЭ-специфическим моноклональным ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Представлен протокол модифицированного метода иммуноферментного анализа для количественного измерения двух компонентов остатков внеклеточной ловушки нейтрофилов: конъюгированной ДНК миелопероксидазы и конъюгированных ДНК нейтрофильной эластазы, полученных из активированных нейтрофилов.

Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

НВЛ привлекли к себе внимание в последнее время, но количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей. Этот протокол представляет собой желательный, высокочувствительный и ценный метод для исследования характеристик НЭО в клинических условиях. Этот метод следует распространить на оценку тяжести сепсиса или септического ОРДС, острого респираторного дистресс-синдрома.Широко признано, что регулирование свалок или молекулярных паттернов, связанных с повреждением, является ключом к улучшению клинического состояния сепсиса. Самым большим преимуществом этого метода является точное количественное определение циркулирующих остатков НВЛ, таких как ДНК миелопероксидазы и ДНК нейтрофильной эластазы, за короткое время. Рекомендуется отжимать образцы перед анализом и избегать повторного размораживания.Важно соблюдать сроки инкубации, указанные в протоколе. Начните с разведения свежеизолированных полиморфноядерных нейтрофилов до 10 000 клеток на миллилитр в RPMI 1640, не содержащем фенола красного. Просейте их в 35-миллиметровую посуду для культур.Чтобы индуцировать нейтрофильные внеклеточные ловушки или НВЛ, сначала стимулируют полиморфноядерные нейтрофилы 25 наномолярными ПМА. Затем частично переваривают внеклеточные ловушки, добавляя 0,6 микрограмма на миллилитр ДНКазы I, и инкубируют смесь в течение 50 минут при комнатной температуре. Теперь добавьте пятимиллимолярную ЭДТА, чтобы остановить активность ДНКазы, и соберите среду, содержащую синтезированные НВЛ.Центрифуга для удаления клеточного мусора. Соберите надосадочную жидкость из четырех здоровых контрольных групп. Перемешайте, храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования.Пипетку 100 мкл разбавленной антимиелопероксидазы, содержащей 0,05 мкг антитела, в ИФА-планшет. Теперь накройте планшет клейкой пластиковой крышкой, чтобы предотвратить испарение образца, и инкубируйте образец в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы обеспечить связывание захваченных антител. На следующий день разбавленный раствор антител выбросьте из лунок, а в каждую лунку запипеткой закапайте 300 микролитров промывочного раствора.Постучите по тарелке насухо бумажным полотенцем, чтобы удалить излишки PBS. Закройте каждую лунку пластины 200 микролитрами блокирующего буфера. Накройте его клейкой пластиковой крышкой и закройте лунки, инкубируя его.Выбросив блокирующий раствор из лунок и промыв пластину три-четыре раза, постучите ее насухо бумажным полотенцем. Далее пипеткой закапывают 25 микролитров плазмы во все лунки, кроме заготовки. И разбавляем его 75 микролитрами ПБС, делая окончательный объем лунки 100 микролитров.Затем добавьте в лунку заготовки 100 микролитров ПБС. Смешайте образцы, поместив пластину на шейкер на 10 секунд при 250 об/мин при комнатной температуре. Добавьте два микролитра 100 полностью разбавленной ДНКазы I во все лунки и поместите запечатанную пластину на шейкер на 10 секунд, чтобы тщательно перемешать образцы.Выдерживать 15 минут при комнатной температуре. Добавьте один микролитр 0,5 молярной ЭДТА в каждую лунку, чтобы остановить реакцию ДНКазы. Затем поместите запечатанную пластину на шейкер на 15 секунд, чтобы тщательно перемешать образцы.Наконец, инкубируйте планшет в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы позволить белковым компонентам НВЛ прикрепиться к захватным антителам. На следующий день выбросьте раствор из лунок. После многократной промывки лунок пипеткой 100 микролитров разбавленного пероксидазы-конъюгированного антитела к обнаружению ДНК в каждую лунку.Выдержите планшет в течение 1 1/2 часа, а затем выбросьте раствор в лунки. После трехкратной промывки лунок в каждую лунку закапать пипеткой 100 микролитров раствора субстрата АБТС, а запечатанную пластину инкубировать на шейкере в темноте. Остановите реакцию, добавив 50 микролитров двухмолярной серной кислоты.Перемешайте содержимое лунки, осторожно постукивая по стенкам тарелки. Далее подключите считыватель микропланшетов к компьютеру и запустите программное приложение. В строке состояния создайте новый эксперимент и присвойте ему имя.Затем задайте параметры считывания пластины, выбрав Absorbance (Поглощение) в качестве типа считывания, Endpoint (Конечная точка) в качестве режима чтения и two (Длина) в качестве длины волны. Затем установите лямбда-единицу равной 405 нм, лямбда-2 — 490 нанометров. Теперь выберите состояние «Выкл.» для автомикса и гашения, оставив автокалибровку включенной.Затем выберите «Читать всю пластину» в разделе «Полоски».Наконец, установите Приоритет длины волны столбца с Нормальным в качестве Скорость каретки, а затем выберите Выкл в разделе Авточтение. Поместите пластину в ящик для инструментов и закройте ее. Нажмите «Прочитать», чтобы табличка была прочитана немедленно.Считайте поглощение каждой лунки на длине волны 405 нм и выполните автоматическое вычитание поглощения среды анализа из всех неизвестных образцов. Достоверные стандартные градуировочные кривые были получены как для MPO-ДНК, так и для NE-ДНК, когда значения абсорбции не превышали 0,93 и 0,9 соответственно. Наибольший ОД был получен при применении 0,6 мкг на миллилитр ДНКазы I.Коэффициенты межтестовой вариабельности комплексов в здоровых контрольных группах составили 1,871 и 0,987 соответственно, в то время как у пациентов с COVID-19 коэффициенты вариабельности составили 2,532 и 2,010 соответственно. Средние коэффициенты межтестовой вариабельности для МПО-ДНК и НЭ-ДНК составили 6,524 и 4,389 соответственно. Специфичность захватных антител к комплексам MPO-ДНК и NE-ДНК показала, что контрольные антитела изотипа слабо реагировали на комплексы.Процентное содержание обоих комплексов было выше в плазме крови пациентов с COVID-19 по сравнению со здоровыми контрольными группами. Время расщепления ДНКазы должно быть оптимизировано, в противном случае чрезмерное переваривание снизит абсорбцию.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Высок объём Assay оценить и количественно нейтрофилов внеклеточного ловушку формирования

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...