Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Huq Muhammad Aminul för att ha hjälpt till med att granska manuskriptet.

Denna studie genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje deltagare.
1. Beredning av reagens
OBS: För att utföra sandwich ELISA-analysen bereds reagenserna enligt beskrivningen nedan.
<ol><li>Buffert för beläggning:<ol><li>För att göra en 0,1 mol/l karbonat-bikarbonatbuffe...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Vi har beskrivit en sandwich ELISA-metod där MPO eller NE binder till ett ställe av infångningsantikroppen under den initiala inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Efter tvättning avslutas "sandwichen" genom att proverna inkuberas med en peroxidasassocierad monoklonal anti-DNA-antikropp. Efter avlägsnande av obundna sekundära antikroppar detekteras det bundna peroxidaskonjugatet genom tillsats av ett kromogent ABTS-peroxidassubstrat, vilket ger en löslig slutprodukt som kan avläsas ...

Denna artikel beskriver en metod för att kvantifiera neutrofil extracellulär fällbildning (NET) i biologiska vätskor genom att använda sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) för att detektera komplex av myeloperoxidas (MPO) och neutrofil elastas (NE) med DNA 1,2. NET består av en DNA-ryggrad dekorerad med antimikrobiella proteaser som härrör från neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- och NE-DNA-komplex är viktiga och specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära rummet som nedbrytningsprodukter av NET 3,4.
Förutom sin viktiga fysiologiska roll i det antimikrobiella försvaret3 har NET också olika patologiska effekter4,5, inklusive främjande av trombogenes6 och försämring av sepsis7. Följaktligen har NET fått uppmärksamhet nyligen. Icke desto mindre har in vivo-kvantifieringen av NET visat sig vara utmanande på grund av bristen på en känslig, tillförlitlig kvantitativ analysmetod.
Ett fåtal metoder finns tillgängliga, inklusive direkt mätning av NET med fluorescensmikroskopi8,9 och flödescytometri 10 och indirekt mätning av cirkulerande cellfritt DNA, nukleosomer och citrullinerad histon H3, men varje metod har sina egna fördelar och begränsningar11. Även om den immunofluorescensmikroskopiska metoden är specifik för NET och tydligt visar lokalisering och grad av NET-bildning, är proverna begränsade till biopsivävnad och utsöndrade material. Dessutom behöver denna metod utföras av skickliga forskare och kräver lång tid för att resultat ska erhållas. Att mäta cirkulerande nivåer av NET-relaterade komponenter med flödescytometri är enkelt och ger snabba resultat. Metoden är dock inte specifik för NET12.
Vi13 och andra1,2 har utvecklat en mycket känslig och tillförlitlig analys för att mäta de cirkulerande NET-komponenterna, MPO-konjugerat eller NE-konjugerat DNA, i human plasma med en modifierad ELISA-teknik som använder specifika antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. Denna analys kan också användas ex vivo för att identifiera NET-komponenter i cellodlingssupernatanter som frisätts av aktiverade neutrofiler som svar på phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) stimulering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Vissa stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler att frigöra neutrofila extracellulära fällor (NET), som i grunden är nätliknande strukturer som består av DNA med granulära proteiner, såsom myeloperoxidas (MPO) och neutrofila elastas (NE), och cytoplasmatiska och cytoskelettala proteiner. Även om intresset för NET har ökat på senare tid finns det ingen känslig och tillförlitlig analysmetod för att mäta NET i kliniska miljöer. Denna artikel beskriver en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys för att kvantitativt mäta två komponenter av cirkulerande NET, MPO-DNA och NE-DNA-komplex, som är specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära utrymmet som nedbrytningsprodukter av NET. Analysen använder specifika monoklonala antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. MPO eller NE binder till ett ställe för infångningsantikroppen under den första inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Denna analys visar god linjäritet och hög precision mellan och inom analysen. Vi använde det på 16 patienter med covid-19 med åtföljande akut andnödssyndrom och fann att plasmakoncentrationerna av MPO-DNA och NE-DNA var signifikant högre än i plasma från friska kontroller. Denna detektionsanalys är en tillförlitlig, mycket känslig och användbar metod för att undersöka egenskaperna hos NET i humanplasma och odlingssupernatanter.

Denna metod använde en sandwich-ELISA med monoklonala anti-MPO-, anti-NE- och anti-DNA-antikroppar för att mäta MPO-associerat och NE-associerat DNA (Figur 1). I denna metod belades brunnarna i en mikrotiterplatta med en MPO-specifik eller NE-specifik monoklonal antikropp för att fånga DNA-associerad MPO och DNA-associerad NE, såväl som icke-DNA-associerad MPO och NE. För att beräkna intraanalyskoefficienten för variabilitet (CV) utfördes dubbla mätningar inom samma platta för 3...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Vi presenterar ett protokoll för en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analysteknik för att kvantitativt mäta två komponenter av neutrofila extracellulära fällrester, myeloperoxidaskonjugerat DNA och neutrofilelastaskonjugerade DNA-komplex, härledda från aktiverade neutrofiler.

Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET har väckt uppmärksamhet på senare tid, men det har visat sig vara svårt att kvantifiera NET in vivo. Detta protokoll ger en önskvärd, mycket känslig och värdefull metod för att undersöka egenskaperna hos NET i kliniska miljöer. Denna teknik bör utvidgas till att utvärdera svårighetsgraden av sepsis eller septisk ARDS, akut andnödssyndrom.Det är allmänt accepterat att reglering av dumpningar eller skaderelaterade molekylära mönster är en nyckel till att förbättra det kliniska tillståndet vid sepsis. Den största fördelen med denna metod inkluderar noggrann kvantifiering av cirkulerande NET-rester som myeloperoxidas-DNA och neutrofilt elastas-DNA på kort tid. Det är tillrådligt att centrifugera proverna före analys och undvika upprepad upptining.Det är viktigt att följa de inkubationstider som anges i protokollet. Börja med att späda ut nyisolerade polymorfonukleära neutrofiler till 10 000 celler per milliliter i fenolrödfri RPMI 1640. Sikta dem i 35-millimeters odlingsformar.För att inducera neutrofila extracellulära fällor eller NET stimuleras först de polymorfonukleära neutrofilerna med 25 nanomolär PMA. Smält sedan de extracellulära fällorna delvis genom att tillsätta 0,6 mikrogram per milliliter DNas I och inkubera blandningen i 50 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt nu fem millimolar EDTA för att stoppa DNase-aktiviteten och samla upp mediet som innehåller de syntetiserade NET.Centrifugera för att ta bort cellresterna. Samla in supernatanterna från fyra friska kontroller. Blanda och förvara dem vid minus 80 grader Celsius för vidare användning.Pipettera över 100 mikroliter utspätt antimyeloperoxidas innehållande 0,05 mikrogram av antikroppen till en ELISA-platta. Täck nu plattan med ett självhäftande plastskydd för att förhindra provavdunstning och inkubera provet över natten vid fyra grader Celsius för att tillåta bindning av infångningsantikropparna. Nästa dag kasserar du den utspädda antikroppslösningen från brunnarna och pipetterar 300 mikroliter tvättlösning i varje brunn.Knacka plattan torr på en pappershandduk för att ta bort överflödig PBS. Blockera varje brunn på plattan med 200 mikroliter av blockeringsbufferten. Täck den med ett självhäftande plastlock och blockera brunnarna genom att inkubera den.Efter att ha kasserat den blockerande lösningen från brunnarna och tvättat plattan tre till fyra gånger, knacka den torr på en pappershandduk. Pipettera sedan 25 mikroliter plasma i alla brunnar utom ämnet. Och späd ut den med 75 mikroliter PBS, vilket gör den slutliga brunnsvolymen 100 mikroliter.Tillsätt sedan 100 mikroliter PBS till den tomma brunnen. Blanda proverna genom att placera plattan på en shaker i 10 sekunder vid 250 rpm vid rumstemperatur. Tillsätt två mikroliter 100 fullt utspädd DNas I till alla brunnar och placera den förseglade plattan på shakern i 10 sekunder för att blanda proverna ordentligt.Inkubera i 15 minuter i rumstemperatur. Tillsätt en mikroliter 0,5 molar EDTA till varje brunn för att stoppa DNase-reaktionen. Placera sedan den förseglade plattan på shakern i 15 sekunder för att blanda proverna ordentligt.Inkubera slutligen plattan över natten vid fyra grader Celsius så att proteinkomponenterna i NET kan fästa vid infångningsantikropparna. Nästa dag, kassera lösningen från brunnarna. Efter flera brunnstvättar, pipettera 100 mikroliter av den utspädda peroxidaskonjugerade anti-DNA-detektionsantikroppen i varje brunn.Inkubera plattan i 1 1/2 timme och kassera sedan lösningen i brunnarna. Efter att ha tvättat brunnarna tre gånger, pipettera 100 mikroliter ABTS-substratlösning i varje brunn och inkubera den förseglade plattan på en shaker i mörkret. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 mikroliter tvåmolär svavelsyra.Blanda väl innehållet genom att försiktigt knacka på plattans sidor. Anslut sedan mikroplattläsaren till datorn och starta programvaran. Skapa ett nytt experiment i statusfältet och namnge det.Ställ sedan in plattavläsningsparametrarna genom att välja Absorbans som lästyp, Slutpunkt som läsläge och två som våglängder. Ställ sedan in lambda ett som 405 nanometer, lambda två som 490 nanometer. Välj nu status Av för både Automix och Blanking samtidigt som du behåller AutoCalibration som På. Välj sedan Läs hela plattan under Remsor.Slutligen anger du Kolumnvåglängdsprioritet med Normal som vagnhastighet och väljer sedan Av under Läs automatiskt. Placera plattan väl i instrumentlådan och stäng den. Klicka på Läs så att skylten läses direkt.Läs av absorbansen för varje brunn vid 405 nanometer och utför automatisk subtraktion av analysmedieabsorbansen från alla okända prover. Tillförlitliga standardkalibreringskurvor erhölls för både MPO-DNA och NE-DNA när absorbansvärdena inte översteg 0,93 respektive 0,9. Den högsta OD erhölls när 0,6 mikrogram per milliliter DNas I applicerades.Variabilitetskoefficienterna mellan analyserna för komplexen i friska kontroller var 1,871 respektive 0,987, medan covid-19-patienterna uppvisade variabilitetskoefficienter på 2,532 respektive 2,010. De genomsnittliga variabilitetskoefficienterna mellan analyserna för MPO-DNA och NE-DNA var 6,524 respektive 4,389. Infångningsantikropparnas specificitet mot MPO-DNA- och NE-DNA-komplexen visade att iso-typkontrollantikropparna reagerade lite på komplexen.Andelen av båda komplexen var högre i plasma från patienter med covid-19 jämfört med de friska kontrollerna. Nedbrytningstiden bör optimeras, annars kommer överdriven matsmältning att minska absorbansen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Förenklad Human Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) Isolering och Hantering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel fluorescensanalys för kvantifiering av Canine neutrofila Extracellulär Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

En hög genomströmning analysen att bedöma och kvantifiera neutrofila extracellulära fälla bildandet

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifiering av neutrofila extracellulära fällor i paraffinin embedded felintens arteriell trombi med immunofluorescensmikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk och kompositionell analys av neutrofila extracellulära fällor inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...