Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105601 ، 2018YFA0107102) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970333،31901044،) ، وبرنامج أستاذ التعيين الخاص في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (GZ2020008).

1. ثقافة الخلية والمرور
ملاحظة: يتم وصف البروتوكول باستخدام الخلايا الليفية الجنينية للفأر المستزرعة بشكل روتيني (MEFs) كمثال.
<ol><li>خلايا MEF المستنبتة في أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 10 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ومراقبة الخلا...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة لتقييم ومراقبة العملية الديناميكية للميتوفاجي في الخلايا الحية ، بما في ذلك البلعمة الذاتية ، والليزوزومات ، والانشطار الميتوكوندريا ، من خلال التلوين المشترك مع الميتوكوندريا الخلوية والأصباغ الليزوزومية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد الميتو?...

الميتوكوندريا هي مراكز القوة لجميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا 1,2. بالإضافة إلى إنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية ، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في عمليات أخرى مثل الطاقة الحيوية ، وتوازن الكالسيوم ، وتوليد الجذور الحرة ، وموت الخلايا المبرمج ، والتوازن الخلوي3،4،5. نظرا لأن الميتوكوندريا تولد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من مجمعات متعددة في سلسلة نقل الإلكترون ، يتم تحفيزها باستمرار عن طريق الإجهاد التأكسدي المحتمل ، والذي يمكن أن يؤدي في النهاية إلى تلف هيكلي واختلال وظيفي عندما ينهار نظام الدفاع المضاد للأكسدة 6,7. تم العثور على خلل الميتوكوندريا للمساهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية ، والتنكس العصبي ، وأمراض القلب والأوعية الدموية8. لذلك ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة سكان الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة. الميتوكوندريا هي عضيات بلاستيكية وديناميكية للغاية. يتم التحكم في مورفولوجيتها ووظيفتها من خلال آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا ، بما في ذلك التعديلات اللاحقة للترجمة (PTM) لبروتينات الميتوكوندريا ، والتولد الحيوي للميتوكوندريا ، والاندماج ، والانشطار ، والميتوفاجي9،10. ينتج عن انشطار الميتوكوندريا بوساطة البروتين 1 المرتبط بالدينامين (DRP1) ، وهو GTPase من عائلة البروتينات الديناميكية الفائقة ، ميتوكوندريا صغيرة ومستديرة ويعزل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا ، والتي يمكن تطهيرها وتحللها بواسطة الميتوفاجي11,12.
Mitophagy هي عملية خلوية تؤدي بشكل انتقائي إلى تحلل الميتوكوندريا عن طريق الالتهام الذاتي ، وعادة ما تحدث في الميتوكوندريا التالفة بعد الإصابة أو الشيخوخة أو الإجهاد. بعد ذلك ، يتم تسليم هذه الميتوكوندريا إلى الليزوزومات للتحلل10. وبالتالي ، فإن الميتوفاجي هي عملية تقويضية تساعد في الحفاظ على كمية ونوعية الميتوكوندريا في حالة صحية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. يلعب دورا حاسما في استعادة التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية والإجهاد الطبيعية13,14. تتميز الخلايا بآلية ميتوفاجي معقدة ، والتي تسببها إشارات مختلفة من الإجهاد الخلوي والتغيرات التنموية. تصنف المسارات التنظيمية Mitophagy على أنها تعتمد على يوبيكويتين أو تعتمد على المستقبلات15,16 ؛ يتم التوسط في الالتهام الذاتي المعتمد على ubiquitin بواسطة كيناز PINK1 وتجنيد يوبيكويتين ligase Parkin E3 إلى الميتوكوندريا 17,18 ، بينما يتضمن الالتهام الذاتي المعتمد على المستقبلات ربط مستقبلات الالتهام الذاتي بسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة LC3 التي تتوسط الميتوفاجي استجابة لتلف الميتوكوندريا19.
المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) هو الطريقة الأكثر استخداما ، ولا يزال أحد أفضل الطرق ، لمراقبة واكتشاف الميتوفاجي20. السمات المورفولوجية للميتوفاجي هي البلعمة الذاتية أو التحلل الذاتي التي تشكلت عن طريق اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، والتي يمكن ملاحظتها من صور المجهر الإلكتروني21. ومع ذلك ، فإن ضعف المجهر الإلكتروني (EM) هو عدم القدرة على مراقبة العمليات الديناميكية للميتوفاجي ، مثل إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، وانشطار الميتوكوندريا ، واندماج البلعمة الذاتية والليزوزومات ، في الخلية الحية20. وبالتالي ، فإن تقييم الميتوفاجي من خلال تصوير العضيات الحية هو طريقة بديلة جذابة لأبحاث الميتوكوندريا. تستخدم تقنية التصوير بالخلايا الحية الموصوفة هنا صبغتين فلوريتين لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزومات. عندما يحدث الميتوفاجي ، فإن الميتوكوندريا التالفة أو الزائدة التي تجتاحها البلعمة الذاتية تكون ملطخة باللون الأخضر بواسطة صبغة الميتوكوندريا ، بينما تلطخ الصبغة الحمراء الليزوزومات. يؤدي اندماج هذه البلعمة الذاتية والليزوزومات ، المشار إليها باسم التحلل الذاتي ، إلى تداخل التألق الأخضر والأحمر وظهوره كنقاط صفراء ، مما يشير إلى حدوث الميتوفاجي22. تحتوي صبغة الميتوكوندريا الخلوية (MitoTracker Green) على مجموعة كلوروميثيل كلوروميثيل معتدلة التفاعل مع الثيول لتسمية الميتوكوندريا23. لتسمية الميتوكوندريا ، يتم تحضين الخلايا ببساطة بالصبغة ، التي تنتشر بشكل سلبي عبر غشاء البلازما وتتراكم في الميتوكوندريا النشطة. يمكن لصبغة الميتوكوندريا هذه تلطيخ الخلايا الحية بسهولة ، وهي أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد. صبغة الليزوزوم (LysoTracker Red) هي مسبار حمضي فلوري يستخدم لوضع العلامات على العضيات الحمضية وتتبعها في الخلايا الحية. تظهر هذه الصبغة انتقائية عالية للعضيات الحمضية ويمكنها تسمية الخلايا الحية بشكل فعال بتركيزات نانومولية24.
يتم هنا عرض إجراءات استخدام هذه الأصباغ الفلورية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ وتصور الميتوكوندريا والليزوزومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. يمكن استخدامه أيضا لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات ، وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

الميتوكوندريا ، كونها مراكز القوة في الخلية ، تلعب أدوارا مهمة في الطاقة الحيوية ، وتوليد الجذور الحرة ، وتوازن الكالسيوم ، وموت الخلايا المبرمج. Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا ويتم دراستها بشكل عام باستخدام الملاحظة المجهرية ، ولكن من الصعب إجراء فحوصات الميتوفاجي في الجسم الحي . يعد تقييم الميتوفاجي عن طريق تصوير العضيات الحية طريقة بديلة وضرورية لأبحاث الميتوكوندريا. يصف هذا البروتوكول إجراءات استخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية MitoTracker Green وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية LysoTracker Red في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ ، وتصور الميتوكوندريا والليزوزوم ، والنتائج المتوقعة. كما يتم توفير خطوات مفصلة لتقييم الميتوفاجي في الخلايا الحية ، بالإضافة إلى ملاحظات فنية حول إعدادات برنامج المجهر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

MitoTracker Green عبارة عن صبغة ميتوكوندريا خضراء فلورية قادرة على توطين الميتوكوندريا بدقة. يمكن للصبغة أن تلطخ الخلايا الحية بسهولة وتكون أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد (الشكل 2). صبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري LysoTracker Red قادرة على وضع العلامات على العضيات...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن تقييم الميتوفاجي في الجسم الحي يعوقه عدم وجود مقايسات كمية موثوقة. يظهر هنا بروتوكول لمراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري.

تصور Mitophagy مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

تساعد هذه الطريقة على مراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء. يلعب الميتوفاجي دورا مهما في الحفاظ على توازن الميتوكوندريا والجوانب المختلفة للوظيفة الخلوية. يمكن أن توفر هذه التقنية نهجا جديدا لعلاج الأمراض المرتبطة بالميتوكوندريا.هذا الإجراء ليس معقدا للغاية. يعد التقاط صور واضحة أمرا مهما للغاية لحساب تراكب الميتوكوندريا والليزوزومات. للبدء ، استزرع الخلايا الليفية الجنينية للفأر أو خلايا MEF في طبق زراعة الخلايا 10 سم مع 10 ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco أو DMEM.احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ومراقبة الخلايا تحت المجهر بتكبير 100X. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء، اغسلها بملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو. ثم أضف ملليلتر من 0.05٪ تربسين EDTA لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا ، متبوعا بملليلتر من DMEM لإيقاف التفاعل.الطرد المركزي تعليق الخلية في 100 غرام لمدة ثلاث دقائق وإعادة تعليق بيليه في واحد ملليلتر DMEM. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وشرائح غرفة عد الخلايا وقم بتلقيح 1.5 في 10 إلى الخلايا السادسة في طبق زراعة خلايا جديد يبلغ طوله 10 سنتيمترات يحتوي على 10 ملليلتر من DMEM. بالنسبة لمقايسة الميتوفاجي ، قم بإعداد معلق خلوي كما هو موصوف وقم بتخفيف تعليق الخلية إلى واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من DMEM الطازج.أضف ملليلتر من معلق الخلية المخفف إلى طبق متحد البؤر 20 ملم وهز الطبق في صليب. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. إعداد حلول العمل من الأصباغ عن طريق تخفيف حلول المخزون.أضف اثنين ميكرولتر لكل من صبغة الميتوكوندريا 0.2 مليمولار وصبغة الليزوزوم الدقيقة 50 إلى ملليلتر من DMEM للحصول على تركيز عمل قدره 0.2 صبغة ميتوكوندريا ميكرومولية وصبغة ليزوزوم نانومولية 50. أخرج الوسط من طبق الثقافة متحد البؤر وأضف ملليلتر واحد من محلول التلوين لتغطية الخلايا. ضع طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة.اضبط معلمات برنامج التصوير المجهري متحد البؤر. بالنسبة لصور الإثارة المزدوجة ، استخدم الإثارة المتسلسلة عند 488 نانومتر و 543 نانومتر واجمع الانبعاثات عند 505 إلى 545 نانومتر وأكبر من 560 نانومتر على التوالي. قم بإزالة الطبق المتوسط الذي يحتوي على الصبغة من الحاضنة وأضف ملليلتر واحد من Krebs-Henseleit أو KH buffer إلى الطبق.للحث على الميتوفاجي ، عالج الخلايا باستخدام FCCP في ميكرومولار واحد في محلول KH لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وانتقل على الفور إلى تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر. ضع كمية مناسبة من الزيت على الجزء العلوي من عدسة الزيت 63X. ضع العينة على مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر وحركها مباشرة فوق العدسة الشيئية.استخدم برنامج التصوير للعثور على العينة بالنقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج. اختر مجموعة فلاتر خضراء للتجربة. استخدم مقبض الضبط الخشن للتركيز البؤري بسرعة عن طريق تحريك العدسة الشيئية لأعلى ولأسفل.بعد أن تكون عينة الخلية مرئية بوضوح من خلال العدسة ، ابحث عن منطقة الخلايا المفردة وقم بتركيزها وانقلها إلى مركز مجال الرؤية. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج للحصول على الصور. حدد فقط قناة 488 نانومتر ودقة الإطار 1024 × 1024 للمعاينة.انقر فوق علامة التبويب Live في الزاوية اليسرى العليا لبدء الفحص المباشر. اضبط مجال الرؤية إلى أكثر حدة واضبط طاقة الليزر عن طريق تحريك شريط التمرير إلى اليسار أو اليمين. حافظ على إعداد الكسب أقل من 600 لتجنب التعرض الزائد.اضبط قيمة الثقب على 156 ، واكتسب القيمة إلى 545 وقيمة الإزاحة الرقمية إلى الصفر. حدد أفضل مجال رؤية ، وتحقق من القناتين واختر دقة الإطار 1024 × 1024. انقر فوق Snap للحصول على صور 2D وحفظ الصور التي تم الحصول عليها.في هذه الدراسة ، تم استخدام FFCP لتحفيز الميتوفاجي في خلايا MEF للتصوير متحد البؤر. تظهر هنا صور تمثيلية لخلايا ملطخة بصبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية التي تظهر الميتوكوندريا وملطخة بصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية التي تظهر الليزوزوم. عندما تجتاح الميتوكوندريا التالفة ذات اللون الأخضر الليزوزومات الملطخة باللون الأحمر ، يتداخل التألق الأخضر والأحمر للكشف عن الليزوزومات الصفراء الموضعية المشتركة.تتوافق النقاط الصفراء مع هذه الجسيمات الحالة الميتوكوندريا الموضعية التي تمثل الميتوفاجي المستمر ، وبالتالي يمكن حسابها لتقييم مدى الميتوفاجي. يعد تحضير محلول عملي من الأصباغ لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزوم والحفاظ على التقاء الخلايا المناسب عند التصوير باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر من الخطوات الرئيسية التي يجب تذكرها. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لتحليل عدد الميتوكوندريا والتشكل وهو أمر مهم لتقييم ديناميكيات الميتوكوندريا.يرتبط Mitophagy ارتباطا وثيقا بمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ويمكن استخدام هذه التقنية لاستكشاف العلاقة بين الميتوفاجي والأمراض البشرية.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

قياس ميتوفاجي الحساسة بالتدفق الخلوي استخدام تعتمد على درجة الحموضة "مراسل الفلورسنت" طن متري-كيما

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

تطبيق غشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتصوير الخلايا الحية من الفطريات الخيطية

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...