Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist finansieret af National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) og programmet for professor i særlig udnævnelse ved Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

1. Cellekultur og passaging
BEMÆRK: Protokollen er beskrevet ved hjælp af rutinemæssigt dyrkede museembryonale fibroblaster (MEF'er) som et eksempel.
<ol><li>Kultur MEF-celler i 10 cm cellekulturretter med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM). Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 og overvåges cellerne under et mikroskop ved 100x forstørrelse.</li>
	<li>Udfør rutinemæssig cellepasning.<ol><li>Når cellerne når 80% -90% sammenløb (hver 3. dag), vaskes...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Protokollen beskrevet her giver en metode til evaluering og overvågning af den dynamiske proces af mitofagi i levende celler, der involverer autofagosomer, lysosomer og mitokondriefission gennem co-farvning med cellepermeant mitokondrier og lysosomfarvestoffer. Metoden kan også bruges til at identificere mitokondrier og vurdere mitokondriel morfologi. Begge farvestoffer, der anvendes i denne undersøgelse, bør beskyttes mod lys, flere fryse-optøningscyklusser bør undgås, og farvestofferne bør så vidt muligt opbev...

Mitokondrier er kraftcentrene i næsten alle eukaryote celler 1,2. Ud over ATP-produktion gennem oxidativ phosphorylering spiller mitokondrier en afgørende rolle i andre processer såsom bioenergetik, calciumhomeostase, fri radikalgeneration, apoptose og cellulær homeostase 3,4,5. Da mitokondrier genererer reaktive iltarter (ROS) fra flere komplekser i elektrontransportkæden, stimuleres de konstant af potentiel oxidativ stress, hvilket i sidste ende kan føre til strukturel skade og dysfunktion, når antioxidantforsvarssystemet kollapser 6,7. Mitokondrie dysfunktion har vist sig at bidrage til mange sygdomme, herunder metaboliske lidelser, neurodegeneration og hjerte-kar-sygdom8. Derfor er det afgørende at opretholde sunde mitokondriepopulationer og deres rette funktion. Mitokondrier er meget plastiske og dynamiske organeller; deres morfologi og funktion styres af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer, herunder posttranslationelle modifikationer (PTM) af mitokondrieproteiner, mitokondriel biogenese, fusion, fission og mitofagi 9,10. Mitokondriefission medieret af dynaminrelateret protein 1 (DRP1), en GTPase af dynaminsuperfamilien af proteiner, resulterer i små og runde mitokondrier og isolerer de dysfunktionelle mitokondrier, som kan ryddes og nedbrydes ved mitofagi11,12.
Mitofagi er en cellulær proces, der selektivt nedbryder mitokondrier ved autofagi, der normalt forekommer i beskadigede mitokondrier efter skade, aldring eller stress. Derefter leveres disse mitokondrier til lysosomer til nedbrydning10. Mitofagi er således en katabolisk proces, der hjælper med at opretholde mængden og kvaliteten af mitokondrier i en sund tilstand i en bred vifte af celletyper. Det spiller en afgørende rolle i genoprettelsen af cellulær homeostase under normale fysiologiske og stressforhold13,14. Celler er kendetegnet ved en kompleks mitofagimekanisme, som induceres af forskellige signaler om cellulær stress og udviklingsændringer. Mitofagi regulatoriske veje er klassificeret som ubiquitin-afhængige eller receptorafhængige15,16; den ubiquitinafhængige autofagi medieres af kinasen PINK1 og rekrutteringen af ubiquitin ligase Parkin E3 til mitokondrierne 17,18, mens receptorafhængig autofagi involverer binding af autofagireceptorer til den mikrotubuli-associerede proteinlyskæde LC3, der medierer mitofagi som reaktion på mitokondrieskader19.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er den mest almindeligt anvendte metode og stadig en af de bedste metoder til at observere og detektere mitofagi20. De morfologiske træk ved mitofagi er autofagosomer eller autolysosomer dannet ved fusion af autofagosomer med lysosomer, som kan observeres fra elektronmikroskopibilleder21. Svagheden ved elektronmikroskopi (EM) er imidlertid manglende evne til at overvåge de dynamiske processer af mitofagi, såsom mitokondriel depolarisering, mitokondriefission og fusion af autofagosomer og lysosomer i den levende celle20. Således er evaluering af mitofagi gennem billeddannelse af levende organeller en attraktiv alternativ metode til mitokondrieforskning. Den levende cellebilleddannelsesteknik, der er beskrevet her, bruger to fluorescerende farvestoffer til at plette mitokondrier og lysosomer. Når mitofagi opstår, farves beskadigede eller overflødige mitokondrier opslugt af autofagosomer grønt af mitokondriefarvestoffet, mens det røde farvestof pletter lysosomerne. Fusionen af disse autofagosomer og lysosomer, kaldet autolysosomer, får den grønne og røde fluorescens til at overlappe og manifestere sig som gule prikker, hvilket indikerer forekomsten af mitofagi22. Det cellepermente mitokondriefarvestof (MitoTracker Green) indeholder en mildt thiol-reaktiv chlormethyldel til mærkning af mitokondrier23. For at mærke mitokondrier inkuberes celler simpelthen med farvestoffet, som diffunderer passivt over plasmamembranen og akkumuleres i aktive mitokondrier. Dette mitokondrifarvestof kan let plette levende celler og er mindre effektivt til farvning af aldehydfikserede eller døde celler. Lysosomfarvestoffet (LysoTracker Red) er en fluorescerende acidotrop sonde, der anvendes til mærkning og sporing af sure organeller i levende celler. Dette farvestof udviser en høj selektivitet for sure organeller og kan effektivt mærke levende celler ved nanomolære koncentrationer24.
Procedurerne for anvendelse af disse fluorescerende farvestoffer i levende celler, herunder indlæsning af farvestoffer og visualisering af mitokondrier og lysosomer, præsenteres her. Denne metode kan hjælpe forskere med at observere mitofagi ved hjælp af levende celle fluorescerende mikroskopi. Det kan også bruges til at kvantificere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriel morfologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Mitokondrier, der er cellens kraftcentre, spiller vigtige roller i bioenergetik, fri radikalgeneration, calciumhomeostase og apoptose. Mitofagi er den primære mekanisme for mitokondrie kvalitetskontrol og studeres generelt ved hjælp af mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy assays er vanskelige at udføre. Evaluering af mitofagi ved billeddannelse af levende organeller er en alternativ og nødvendig metode til mitokondrieforskning. Denne protokol beskriver procedurerne for anvendelse af det cellepermeant grøn-fluorescerende mitokondrifarvestof MitoTracker Green og det rød-fluorescerende lysosomfarvestof LysoTracker Red i levende celler, herunder indlæsning af farvestofferne, visualisering af mitokondrierne og lysosomet og forventede resultater. Detaljerede trin til evaluering af mitofagi i levende celler samt tekniske noter om mikroskopsoftwareindstillinger leveres også. Denne metode kan hjælpe forskere med at observere mitofagi ved hjælp af levende celle fluorescerende mikroskopi. Derudover kan den bruges til at kvantificere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriemorfologi.

MitoTracker Green er en grøn-fluorescerende mitokondrieplet, der er i stand til nøjagtigt at lokalisere til mitokondrier. Farvestoffet kan let plette levende celler og er mindre effektivt til farvning af aldehydfikserede eller døde celler (figur 2). Det rød-fluorescerende lysosomfarvestof LysoTracker Red er i stand til at mærke og spore sure lysosomale organeller og kan kun plette levende celler (figur 2). Konfokal mikroskopbilleddannelse muliggør visualis...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitofagi er den primære mekanisme for mitokondrie kvalitetskontrol. Evalueringen af mitophagy in vivo hindres imidlertid af manglen på pålidelige kvantitative assays. Præsenteret her er en protokol til observation af mitofagi i levende celler ved hjælp af et cellepermeant grøn-fluorescerende mitokondrier farvestof og et rød-fluorescerende lysosomfarvestof.

Visualisering af mitofagi med fluorescerende farvestoffer til mitokondrier og lysosomer

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Denne metode hjælper med at observere mitofagi i levende celler ved hjælp af et cellepermeant grøn-fluorescerende mitokondrier farvestof og et rød-fluorescerende lysosomfarvestof. Mitofagi spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af mitokondrier homeostase og forskellige aspekter af cellulær funktion. Denne teknik kan give en ny tilgang til behandling af mitokondrier-relaterede sygdomme.Denne procedure er ikke særlig kompliceret. Optagelse af klare billeder er meget vigtigt for at tælle overlejringen af mitokondrier og lysosomer. Til at begynde med skal du dyrke museembryonale fibroblast- eller MEF-celler i en 10 centimeter cellekulturskål med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle Medium eller DMEM.Inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid og overvåger cellerne under et mikroskop ved 100X forstørrelse. Når cellerne når 80 til 90% sammenløb, vaskes dem med to milliliter Dulbeccos fosfatbufferede saltvand. Tilsæt derefter to milliliter 0,05% trypsin EDTA i et minut for at adskille cellerne efterfulgt af to milliliter DMEM for at stoppe reaktionen.Centrifugering af cellesuspensionen ved 100 G i tre minutter og resuspender pelleten i en milliliter DMEM. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller og celletællingskammer glider og pod 1,5 gange 10 til de sjette celler i en ny 10 centimeter cellekulturskål indeholdende 10 milliliter DMEM. Til mitophagy-analysen fremstilles en cellesuspension som beskrevet og fortyndes cellesuspensionen til en gang 10 til de femte celler pr. Milliliter frisk DMEM.Tilsæt to milliliter af den fortyndede cellesuspension til en 20 millimeter konfokal skål og ryst skålen i et kryds. Inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 timer. Forbered arbejdsopløsninger af farvestofferne ved at fortynde stamopløsningerne.Tilsæt to mikroliter hver af 0,2 millimolar mitokondriel farvestof og 50 mikromolar lysosomfarvestof til to milliliter DMEM for at opnå en arbejdskoncentration på 0,2 mikromolære mitokondriefarvestof og 50 nanomolært lysosomfarvestof. Fjern mediet fra den konfokale kulturskål, og tilsæt en milliliter af farvningsopløsningen for at dække cellerne. Anbring cellekulturskålen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 20 til 30 minutter.Indstil parametrene for den konfokale mikroskopibilleddannelsessoftware. For dobbelt excitationsbilleder skal du bruge sekventiel excitation ved 488 nanometer og 543 nanometer og indsamle emission ved henholdsvis 505 til 545 nanometer og større end 560 nanometer. Fjern den kulturmediumskål, der indeholder farvestoffet, fra inkubatoren og tilsæt en milliliter Krebs-Henseleit eller KH-buffer til skålen.For at inducere mitofagi skal du behandle cellerne med FCCP ved en mikromolar i KH-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur og straks fortsætte med at afbilde cellerne ved hjælp af det konfokale mikroskop. Påfør en passende mængde olie på toppen af 63X olielinsen. Prøven anbringes på prøvestadiet i det konfokale mikroskop, og den flyttes direkte over objektivlinsen.Brug billedbehandlingssoftwaren til at finde eksemplet ved at klikke på fanen Find i øverste venstre hjørne af softwaregrænsefladen. Vælg et grønt filtersæt til eksperimentet. Brug den grove justeringsknap til hurtigt at fokusere ved at flytte objektivet op og ned.Når celleprøven er tydeligt synlig gennem okularet, skal du søge og fokusere området for enkeltceller og flytte det til midten af synsfeltet. Klik på fanen Anskaffelse i øverste venstre hjørne af softwaregrænsefladen for at hente billeder. Vælg kun 488 nanometerkanalen og rammeopløsningen 1024 x 1024 for at få vist et eksempel.Klik på fanen Live i øverste venstre hjørne for at starte en live scanning. Juster synsfeltet til det skarpeste, og juster lasereffekten ved at flytte skyderen til venstre eller højre. Hold forstærkningsindstillingen under 600 for at undgå overeksponering.Juster pinhole-værdien til 156, gevinstværdien til 545 og den digitale offset-værdi til nul. Vælg det bedste synsfelt, kontroller de to kanaler, og vælg rammeopløsningen 1024 ved 1024. Klik på Fastgør for at hente 2D-billeder og gemme de erhvervede billeder.I denne undersøgelse blev FFCP brugt til at udløse mitofagi i MEF-celler til konfokal billeddannelse. Repræsentative billeder af celler farvet med det grøn-fluorescerende mitokondrifarvestof, der viser mitokondrier og farvet med det rød-fluorescerende lysosomfarvestof, der viser lysosom, vises her. Når beskadigede grønfarvede mitokondrier opsluges af rødfarvede lysosomer, overlapper den grønne og røde fluorescens hinanden for at afsløre gule co-lokaliserede mitokondrierlysosomer.De gule prikker svarer til disse co-lokaliserede mitokondrier lysosomer, der repræsenterer igangværende mitofagi og kan således tælles for at evaluere omfanget af mitofagi. Forberedelse af en arbejdsløsning af farvestoffer til mitokondrier og lysosomfarvning og opretholdelse af passende cellekonfluens ved billeddannelse med konfokal mikroskopi er vigtige trin at huske. Denne procedure kan også bruges til at analysere mitokondrieantal og morfologi, hvilket er vigtigt for at vurdere mitokondriedynamik.Mitofagi er tæt forbundet med en række menneskelige sygdomme, og denne teknik kan bruges til at udforske forbindelsen mellem mitofagi og menneskelige sygdomme.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisering Bakterier i Nematoder anvendelse af fluorescensmikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Konfokal Imaging af Single Mitochondriale Superoxide Blinker i intakte hjerte eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide til Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting med fejlfinding Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Følsomme måling af Mitophagy ved Flow flowcytometri ved hjælp af pH-afhængige fluorescerende Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Anvendelse af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeder af filamentøse svampe

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...