Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
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Ce travail a été partiellement financé par le National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), la National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) et le Program for Professor of Special Appointment at Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

1. Culture cellulaire et passage
REMARQUE: Le protocole est décrit en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en culture de routine comme exemple.
<ol><li>Culture de cellules MEF dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100x.</li>
	<li>Effectuer le passage de cellule de routine.<ol><li>Lorsq...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Le protocole décrit ici fournit une méthode d’évaluation et de surveillance du processus dynamique de mitophagie dans les cellules vivantes, impliquant les autophagosomes, les lysosomes et la fission mitochondriale, par co-coloration avec des mitochondries perméables aux cellules et des colorants lysosomes. La méthode peut également être utilisée pour identifier les mitochondries et évaluer la morphologie mitochondriale. Les deux colorants utilisés dans cette étude doivent être protégés de la lumière, le...

Les mitochondries sont les centrales électriques de presque toutes les cellules eucaryotes 1,2. En plus de la production d’ATP par phosphorylation oxydative, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans d’autres processus tels que la bioénergétique, l’homéostasie du calcium, la génération de radicaux libres, l’apoptose et l’homéostasie cellulaire 3,4,5. Comme les mitochondries génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) à partir de multiples complexes dans la chaîne de transport d’électrons, elles sont constamment stimulées par un stress oxydatif potentiel, ce qui peut éventuellement entraîner des dommages structurels et un dysfonctionnement lorsque le système de défense antioxydant s’effondre 6,7. Il a été constaté que le dysfonctionnement mitochondrial contribue à de nombreuses maladies, notamment les troubles métaboliques, la neurodégénérescence et les maladies cardiovasculaires8. Par conséquent, il est crucial de maintenir des populations mitochondriales saines et leur bon fonctionnement. Les mitochondries sont des organites hautement plastiques et dynamiques; Leur morphologie et leur fonction sont contrôlées par des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale, y compris les modifications post-traductionnelles (PTM) des protéines mitochondriales, la biogenèse mitochondriale, la fusion, la fission et la mitophagie 9,10. La fission mitochondriale médiée par la protéine 1 liée à la dynamine (DRP1), une GTPase de la superfamille des protéines dynamin, donne des mitochondries petites et rondes et isole les mitochondries dysfonctionnelles, qui peuvent être éliminées et dégradées par la mitophagie11,12.
La mitophagie est un processus cellulaire qui dégrade sélectivement les mitochondries par autophagie, se produisant généralement dans les mitochondries endommagées à la suite d’une blessure, du vieillissement ou du stress. Par la suite, ces mitochondries sont livrées aux lysosomes pour dégradation10. Ainsi, la mitophagie est un processus catabolique qui aide à maintenir la quantité et la qualité des mitochondries dans un état sain dans un large éventail de types de cellules. Il joue un rôle crucial dans la restauration de l’homéostasie cellulaire dans des conditions physiologiques et de stress normales13,14. Les cellules sont caractérisées par un mécanisme de mitophagie complexe, qui est induit par différents signaux de stress cellulaire et de changements développementaux. Les voies de régulation de la mitophagine sont classées comme dépendantes de l’ubiquitine ou des récepteurs15,16; l’autophagie dépendante de l’ubiquitine est médiée par la kinase PINK1 et le recrutement de l’ubiquitine ligase Parkin E3 dans les mitochondries 17,18, tandis que l’autophagie dépendante des récepteurs implique la liaison des récepteurs de l’autophagie à la chaîne légère de protéines associée aux microtubules LC3 qui intervient dans la mitophagie en réponse aux dommages mitochondriaux19.
La microscopie électronique à transmission (MET) est la méthode la plus couramment utilisée, et toujours l’une des meilleures, pour observer et détecter la mitophagie20. Les caractéristiques morphologiques de la mitophagie sont les autophagosomes ou autolysosomes formés par la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, ce qui peut être observé à partir d’images de microscopie électronique21. La faiblesse de la microscopie électronique (EM), cependant, est l’incapacité de surveiller les processus dynamiques de la mitophagie, tels que la dépolarisation mitochondriale, la fission mitochondriale et la fusion des autophagosomes et des lysosomes, dans la cellule vivante20. Ainsi, l’évaluation de la mitophagie par imagerie des organites vivants est une méthode alternative intéressante pour la recherche mitochondriale. La technique d’imagerie de cellules vivantes décrite ici utilise deux colorants fluorescents pour colorer les mitochondries et les lysosomes. Lorsque la mitophagie se produit, les mitochondries endommagées ou superflues englouties par les autophagosomes sont colorées en vert par le colorant mitochondrial, tandis que le colorant rouge colore les lysosomes. La fusion de ces autophagosomes et lysosomes, appelés autolysosomes, provoque le chevauchement de la fluorescence verte et rouge et se manifeste par des points jaunes, indiquant ainsi l’apparition de la mitophagie22. Le colorant mitochondrial perméable aux cellules (MitoTracker Green) contient une fraction chlorométhyle légèrement réactive au thiol pour marquer les mitochondries23. Pour marquer les mitochondries, les cellules sont simplement incubées avec le colorant, qui diffuse passivement à travers la membrane plasmique et s’accumule dans les mitochondries actives. Ce colorant mitochondrial peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules aldéhydes ou mortes. Le colorant lysosome (LysoTracker Red) est une sonde acidotrope fluorescente utilisée pour marquer et suivre les organites acides dans les cellules vivantes. Ce colorant présente une sélectivité élevée pour les organites acides et peut marquer efficacement les cellules vivantes à des concentrations nanomolaires24.
Les procédures d’utilisation de ces colorants fluorescents dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants et la visualisation des mitochondries et des lysosomes, sont présentées ici. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. Il peut également être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes, et évaluer la morphologie mitochondriale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Les mitochondries, étant les centrales électriques de la cellule, jouent un rôle important dans la bioénergétique, la génération de radicaux libres, l’homéostasie du calcium et l’apoptose. La mitophagie est le principal mécanisme de contrôle de la qualité mitochondriale et est généralement étudiée à l’aide d’observations microscopiques, mais les tests de mitophagie in vivo sont difficiles à réaliser. L’évaluation de la mitophagie par imagerie d’organites vivants est une méthode alternative et nécessaire pour la recherche mitochondriale. Ce protocole décrit les procédures d’utilisation du colorant mitochondrial vert-fluorescent MitoTracker Green et du colorant lysosome rouge-fluorescent LysoTracker Red dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants, la visualisation des mitochondries et du lysosome, et les résultats attendus. Des étapes détaillées pour l’évaluation de la mitophagie dans les cellules vivantes, ainsi que des notes techniques sur les paramètres du logiciel de microscope, sont également fournies. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. En outre, il peut être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes et évaluer la morphologie mitochondriale.

MitoTracker Green est une coloration mitochondriale verte-fluorescente capable de se localiser avec précision dans les mitochondries. Le colorant peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules mortes ou fixées à l’aldéhyde (Figure 2). Le colorant lysosome fluorescent rouge LysoTracker Red est capable de marquer et de suivre les organites lysosomales acides et ne peut colorer que les cellules vivantes (Figure 2...

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Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

La mitophagie est le principal mécanisme du contrôle de la qualité mitochondriale. Cependant, l’évaluation de la mitophagie in vivo est entravée par le manque de tests quantitatifs fiables. Un protocole d’observation de la mitophagie dans les cellules vivantes est présenté ici à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable de cellules et d’un colorant lysosome fluorescent rouge.

Visualisation de la mitophagie avec des colorants fluorescents pour les mitochondries et le lysosome

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Cette méthode permet d’observer la mitophagie dans les cellules vivantes à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable et d’un colorant lysosome fluorescent rouge. La mitophagie joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie des mitochondries et de divers aspects de la fonction cellulaire. Cette technique pourrait fournir une nouvelle approche pour le traitement des maladies liées aux mitochondries.Cette procédure n’est pas très compliquée. La capture d’images claires est très importante pour compter la superposition de mitochondries et de lysosomes. Pour commencer, cultivez des cellules embryonnaires de fibroblastes embryonnaires ou de MEF de souris dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres avec 10 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco ou DMEM.Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100X. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, lavez-les avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Ajoutez ensuite deux millilitres d’EDTA à 0,05% de trypsine pendant une minute pour dissocier les cellules, suivis de deux millilitres de DMEM pour arrêter la réaction.Centrifuger la suspension cellulaire à 100 G pendant trois minutes et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de DMEM. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et de lames de chambre de comptage de cellules et inoculez 1,5 fois 10 aux sixièmes cellules dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM. Pour le test de mitophagie, préparer une suspension cellulaire comme décrit et diluer la suspension cellulaire à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de DMEM frais.Ajouter deux millilitres de la suspension cellulaire diluée à un plat confocal de 20 millimètres et agiter le plat en croix. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Préparer les solutions de travail des colorants en diluant les solutions mères.Ajouter deux microlitres chacun de colorant mitochondrial 0,2 millimolaire et 50 colorant lysosome micromolaire à deux millilitres de DMEM pour obtenir une concentration de travail de 0,2 colorant mitochondrial micromolaire et 50 colorant lysosome nanomolaire. Retirer le milieu de la capsule de culture confocale et ajouter un millilitre de solution de coloration pour couvrir les cellules. Placez la boîte de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes.Définissez les paramètres du logiciel d’imagerie par microscopie confocale. Pour les images à double excitation, utilisez une excitation séquentielle à 488 nanomètres et 543 nanomètres et collectez les émissions à 505 à 545 nanomètres et supérieures à 560 nanomètres respectivement. Retirez le milieu de culture contenant le colorant de l’incubateur et ajoutez un millilitre de tampon Krebs-Henseleit ou KH à la boîte.Pour induire la mitophagie, traiter les cellules avec FCCP à une micromolaire dans un tampon KH pendant 10 minutes à température ambiante et procéder immédiatement à l’imagerie des cellules à l’aide du microscope confocale. Appliquez une quantité appropriée d’huile sur le dessus de la lentille d’huile 63X. Placez l’échantillon sur l’étage d’échantillonnage du microscope confocal et déplacez-le directement au-dessus de la lentille de l’objectif.Utilisez le logiciel d’imagerie pour trouver l’échantillon en cliquant sur l’onglet Localiser dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel. Sélectionnez un jeu de filtres vert pour l’expérience. Utilisez le bouton de réglage grossier pour effectuer rapidement la mise au point en déplaçant l’objectif de haut en bas.Une fois que l’échantillon de cellule est clairement visible à travers l’oculaire, recherchez et concentrez la zone des cellules individuelles et déplacez-la vers le centre du champ de vision. Cliquez sur l’onglet Acquisition dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel pour acquérir des images. Sélectionnez uniquement le canal de 488 nanomètres et la résolution d’image 1024 par 1024 pour la prévisualisation.Cliquez sur l’onglet En direct dans le coin supérieur gauche pour lancer une analyse en direct. Ajustez le champ de vision au maximum et réglez la puissance laser en déplaçant le curseur vers la gauche ou la droite. Maintenez le réglage de gain en dessous de 600 pour éviter la surexposition.Ajustez la valeur du sténopé à 156, la valeur du gain à 545 et la valeur du décalage numérique à zéro. Sélectionnez le meilleur champ de vision, vérifiez les deux canaux et choisissez la résolution d’image 1024 par 1024. Cliquez sur Snap pour acquérir des images 2D et enregistrer les images acquises.Dans cette étude, FFCP a été utilisé pour déclencher la mitophagie dans les cellules MEF pour l’imagerie confocale. Des images représentatives de cellules colorées avec le colorant mitochondrial fluorescent vert montrant les mitochondries et colorées avec le colorant lysosome fluorescent rouge montrant le lysosome sont montrées ici. Lorsque les mitochondries colorées en vert endommagées sont englouties par des lysosomes colorés en rouge, la fluorescence verte et rouge se chevauche pour révéler des lysosomes mitochondries co-localisés jaunes.Les points jaunes correspondent à ces lysosomes mitochondriaux co-localisés représentant la mitophagie en cours et peuvent donc être comptés pour évaluer l’étendue de la mitophagie. La préparation d’une solution de travail de colorants pour la coloration des mitochondries et des lysosomes et le maintien d’une confluence cellulaire appropriée lors de l’imagerie par microscopie confocale sont des étapes clés à retenir. Cette procédure peut également être utilisée pour analyser le nombre et la morphologie mitochondriales, ce qui est important pour évaluer la dynamique mitochondriale.La mitophagie est étroitement associée à une variété de maladies humaines et cette technique peut être utilisée pour explorer le lien entre la mitophagie et les maladies humaines.

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