Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), dalla National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) e dal Program for Professor of Special Appointment presso le Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

1. Coltura cellulare e passaggio
NOTA: Il protocollo è descritto utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) coltivati di routine come esempio.
<ol><li>Colture di cellule MEF in piastre di coltura cellulare da 10 cm con 10 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco. Incubare a 37 °C e 5% di CO2 e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 100x.</li>
	<li>Eseguire il passaggio cellulare di routine.<ol><li>Quando le cellule raggiungono l...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per valutare e monitorare il processo dinamico della mitofagia nelle cellule viventi, che coinvolge autofagosomi, lisosomi e fissione mitocondriale, attraverso la co-colorazione con mitocondri e coloranti lisosomi. Il metodo può anche essere utilizzato per identificare i mitocondri e valutare la morfologia mitocondriale. Entrambi i coloranti utilizzati in questo studio dovrebbero essere protetti dalla luce, dovrebbero essere evitati cicli multipli di gelo-scongelamento e i ...

I mitocondri sono le centrali elettriche di quasi tutte le cellule eucariotiche 1,2. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri svolgono un ruolo vitale in altri processi come la bioenergetica, l'omeostasi del calcio, la generazione di radicali liberi, l'apoptosi e l'omeostasi cellulare 3,4,5. Poiché i mitocondri generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) da più complessi nella catena di trasporto degli elettroni, sono costantemente stimolati da potenziale stress ossidativo, che può eventualmente portare a danni strutturali e disfunzioni quando il sistema di difesa antiossidante collassa 6,7. È stato scoperto che la disfunzione mitocondriale contribuisce a molte malattie, tra cui disturbi metabolici, neurodegenerazione e malattie cardiovascolari8. Pertanto, è fondamentale mantenere sane le popolazioni mitocondriali e la loro corretta funzione. I mitocondri sono organelli altamente plastici e dinamici; la loro morfologia e funzione sono controllate da meccanismi di controllo della qualità mitocondriale, comprese le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine mitocondriali, la biogenesi mitocondriale, la fusione, la fissione e la mitofagia 9,10. La fissione mitocondriale mediata dalla proteina 1 correlata alla dinamina (DRP1), una GTPasi della superfamiglia di proteine della dinamina, provoca mitocondri piccoli e rotondi e isola i mitocondri disfunzionali, che possono essere eliminati e degradati dalla mitofagia11,12.
La mitofagia è un processo cellulare che degrada selettivamente i mitocondri per autofagia, di solito si verifica nei mitocondri danneggiati a seguito di lesioni, invecchiamento o stress. Successivamente, questi mitocondri vengono consegnati ai lisosomi per la degradazione10. Pertanto, la mitofagia è un processo catabolico che aiuta a mantenere la quantità e la qualità dei mitocondri in uno stato sano in una vasta gamma di tipi di cellule. Svolge un ruolo cruciale nel ripristino dell'omeostasi cellulare in normali condizioni fisiologiche e di stress13,14. Le cellule sono caratterizzate da un complesso meccanismo mitofagia, che è indotto da diversi segnali di stress cellulare e cambiamenti dello sviluppo. Le vie regolatorie della mitofagia sono classificate come ubiquitina-dipendenti o recettore-dipendenti15,16; l'autofagia ubiquitina-dipendente è mediata dalla chinasi PINK1 e dal reclutamento dell'ubiquitina ligasi Parkin E3 nei mitocondri 17,18, mentre l'autofagia recettore-dipendente comporta il legame dei recettori dell'autofagia alla catena leggera LC3 della proteina associata ai microtubuli che media la mitofagia in risposta al danno mitocondriale19.
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo più comunemente usato, e ancora uno dei metodi migliori, per osservare e rilevare la mitofagia20. Le caratteristiche morfologiche della mitofagia sono autofagosomi o autolisosomi formati dalla fusione di autofagosomi con lisosomi, che possono essere osservati da immagini al microscopio elettronico21. La debolezza della microscopia elettronica (EM), tuttavia, è l'incapacità di monitorare i processi dinamici della mitofagia, come la depolarizzazione mitocondriale, la fissione mitocondriale e la fusione di autofagosomi e lisosomi, nella cellula vivente20. Pertanto, la valutazione della mitofagia attraverso l'imaging degli organelli viventi è un metodo alternativo interessante per la ricerca mitocondriale. La tecnica di imaging delle cellule vive qui descritta utilizza due coloranti fluorescenti per colorare mitocondri e lisosomi. Quando si verifica la mitofagia, i mitocondri danneggiati o superflui inghiottiti dagli autofagosomi sono macchiati di verde dal colorante mitocondriale, mentre il colorante rosso colora i lisosomi. La fusione di questi autofagosomi e lisosomi, indicati come autolisosomi, fa sì che la fluorescenza verde e rossa si sovrapponga e si manifesti come punti gialli, indicando così la presenza di mitofagia22. Il colorante mitocondriale permeato dalle cellule (MitoTracker Green) contiene una porzione di clorometil leggermente tiolo-reattiva per etichettare i mitocondri23. Per marcare i mitocondri, le cellule vengono semplicemente incubate con il colorante, che si diffonde passivamente attraverso la membrana plasmatica e si accumula nei mitocondri attivi. Questo colorante mitocondriale può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule morte o fissate con aldeidi. Il colorante lisosoma (LysoTracker Red) è una sonda acidotropica fluorescente utilizzata per l'etichettatura e il monitoraggio degli organelli acidi nelle cellule vive. Questo colorante presenta un'elevata selettività per gli organelli acidi e può marcare efficacemente le cellule vive a concentrazioni nanomolari24.
Le procedure per l'utilizzo di questi coloranti fluorescenti nelle cellule viventi, compreso il caricamento dei coloranti e la visualizzazione di mitocondri e lisosomi, sono presentate qui. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Può anche essere usato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

I mitocondri, essendo le centrali elettriche della cellula, svolgono ruoli importanti nella bioenergetica, nella generazione di radicali liberi, nell'omeostasi del calcio e nell'apoptosi. La mitofagia è il meccanismo primario del controllo della qualità mitocondriale ed è generalmente studiata utilizzando l'osservazione microscopica, tuttavia i saggi di mitofagia in vivo sono difficili da eseguire. La valutazione della mitofagia mediante imaging di organelli vivi è un metodo alternativo e necessario per la ricerca mitocondriale. Questo protocollo descrive le procedure per l'utilizzo del colorante mitocondriale fluorescente verde MitoTracker Green e del colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red nelle cellule vive, compreso il caricamento dei coloranti, la visualizzazione dei mitocondri e del lisosoma e i risultati attesi. Vengono inoltre forniti passaggi dettagliati per la valutazione della mitofagia in cellule vive, nonché note tecniche sulle impostazioni del software del microscopio. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.

MitoTracker Green è una colorazione mitocondriale verde-fluorescente che è in grado di localizzarsi con precisione nei mitocondri. Il colorante può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule fissate o morte con aldeide (Figura 2). Il colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red è in grado di marcare e tracciare organelli lisosomiali acidi e può solo macchiare cellule vive (Figura 2). L'imaging al micros...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.

Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Questo metodo aiuta ad osservare la mitofagia nelle cellule viventi usando un colorante mitocondriale verde-fluorescente a cellule e un colorante lisosoma rosso-fluorescente. La mitofagia svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dei mitocondri e di vari aspetti della funzione cellulare. Questa tecnica potrebbe fornire un nuovo approccio al trattamento delle malattie legate ai mitocondri.Questa procedura non è molto complicata. Catturare immagini chiare è molto importante per contare la sovrapposizione di mitocondri e lisosomi. Per iniziare, coltura di fibroblasti embrionali di topo o cellule MEF in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri con 10 millilitri di Modified Eagle Medium o DMEM di Dulbecco.Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento 100X. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, lavarle con due millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco. Quindi aggiungere due millilitri di 0,05% di tripsina EDTA per un minuto per dissociare le cellule, seguito da due millilitri di DMEM per fermare la reazione.Centrifugare la sospensione cellulare a 100 G per tre minuti e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico delle cellule e vetrini della camera di conteggio delle cellule e inoculare 1,5 volte 10 alla sesta cellula in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 centimetri contenente 10 millilitri di DMEM. Per il test della mitofagia, preparare una sospensione cellulare come descritto e diluire la sospensione cellulare a una volta 10 alla quinta cellula per millilitro di DMEM fresco.Aggiungere due millilitri della sospensione cellulare diluita a un piatto confocale da 20 millimetri e agitare il piatto in una croce. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Preparare soluzioni di lavoro dei coloranti diluendo le soluzioni di stock.Aggiungere due microlitri ciascuno di colorante mitocondriale 0,2 millimolare e colorante lisosoma 50 micromolari a due millilitri di DMEM per ottenere una concentrazione operativa di 0,2 colorante mitocondriale micromolare e 50 colorante lisosoma nanomolare. Rimuovere il mezzo dal piatto di coltura confocale e aggiungere un millilitro della soluzione colorante per coprire le cellule. Posizionare il piatto di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 20-30 minuti.Impostare i parametri del software di imaging per microscopia confocale. Per le immagini a doppia eccitazione, utilizzare l'eccitazione sequenziale a 488 nanometri e 543 nanometri e raccogliere l'emissione rispettivamente da 505 a 545 nanometri e superiore a 560 nanometri. Rimuovere il piatto di terreno di coltura contenente il colorante dall'incubatore e aggiungere un millilitro di tampone Krebs-Henseleit o KH al piatto.Per indurre la mitofagia, trattare le cellule con FCCP a un micromolare nel tampone KH per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere immediatamente all'immagine delle cellule utilizzando il microscopio confocale. Applicare una quantità appropriata di olio sulla parte superiore della lente dell'olio 63X. Posizionare il campione sullo stadio del campione del microscopio confocale e spostarlo direttamente sopra la lente dell'obiettivo.Utilizzare il software di imaging per trovare il campione facendo clic sulla scheda Trova nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia del software. Seleziona un set di filtri verde per l'esperimento. Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per mettere a fuoco rapidamente spostando l'obiettivo verso l'alto e verso il basso.Dopo che il campione di cellule è chiaramente visibile attraverso l'oculare, cercare e focalizzare l'area delle singole cellule e spostarla al centro del campo visivo. Fare clic sulla scheda Acquisizione nell'angolo in alto a sinistra dell'interfaccia del software per acquisire immagini. Selezionare solo il canale a 488 nanometri e la risoluzione del fotogramma 1024x1024 per l'anteprima.Fare clic sulla scheda Live nell'angolo in alto a sinistra per avviare una scansione dal vivo. Regolare il campo visivo al massimo e regolare la potenza del laser spostando il cursore a sinistra o a destra. Mantieni l'impostazione del guadagno al di sotto di 600 per evitare sovraesposizioni.Regolate il valore stenopeico su 156, il valore di guadagno su 545 e il valore di offset digitale su zero. Seleziona il miglior campo visivo, controlla i due canali e scegli la risoluzione del fotogramma 1024 per 1024. Fare clic su Snap per acquisire immagini 2D e salvare le immagini acquisite.In questo studio, FFCP è stato utilizzato per innescare la mitofagia nelle cellule MEF per l'imaging confocale. Qui sono mostrate immagini rappresentative di cellule colorate con il colorante mitocondriale fluorescente verde che mostra i mitocondri e colorate con il colorante lisosoma fluorescente rosso che mostra il lisosoma. Quando i mitocondri colorati di verde danneggiati vengono inghiottiti da lisosomi colorati di rosso, la fluorescenza verde e rossa si sovrappongono per rivelare lisosomi mitocondriali co-localizzati gialli.I punti gialli corrispondono a questi lisosomi mitocondriali co-localizzati che rappresentano la mitofagia in corso e quindi possono essere contati per valutare l'estensione della mitofagia. La preparazione di una soluzione di lavoro di coloranti per la colorazione dei mitocondri e del lisosoma e il mantenimento di un'appropriata confluenza cellulare durante l'imaging con microscopia confocale sono passi chiave da ricordare. Questa procedura può anche essere utilizzata per analizzare il numero e la morfologia mitocondriale che è importante per valutare la dinamica mitocondriale.La mitofagia è strettamente associata a una varietà di malattie umane e questa tecnica può essere utilizzata per esplorare la connessione tra mitofagia e malattie umane.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Ricerca

Biologia

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...