Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
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이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), 중국 국립 자연 과학 재단 (81970333,31901044,) 및 상하이 고등 교육 기관 특별 임명 교수 프로그램 (GZ2020008).

1. 세포 배양 및 계대 배양
참고: 프로토콜은 일상적으로 배양되는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 예로 사용하여 설명됩니다.
<ol><li>MEF 세포를 10 mL의 Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)로 10cm 세포 배양 접시에서 배양합니다. 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션하고, 세포를 100x 배율로 현미경으로 모니터링하였다.</li>
	<li>일상적인 세포 계대를 수행합니다.<ol><li>?...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 세포 투과성 미토콘드리아 및 리소좀 염료와의 공동 염색을 통해 자가포식, 리소좀 및 미토콘드리아 분열을 포함하는 살아있는 세포에서 미토파지의 동적 과정을 평가하고 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 또한 미토콘드리아를 식별하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 두 염료는 빛으로부터 보호되어야하며, 여러 ...

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포의 발전소입니다 1,2. 산화적 인산화를 통한 ATP 생산 외에도 미토콘드리아는 생물 에너지, 칼슘 항상성, 자유 라디칼 생성, 세포 사멸 및 세포 항상성 3,4,5와 같은 다른 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아는 전자 수송 사슬의 여러 복합체에서 활성 산소 종 (ROS)을 생성하기 때문에 잠재적 인 산화 스트레스에 의해 지속적으로 자극되어 항산화 방어 시스템이 붕괴 될 때 결국 구조적 손상과 기능 장애를 유발할 수 있습니다 6,7. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 장애, 신경 변성 및 심혈관 질환을 비롯한 많은 질병에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다8. 따라서 건강한 미토콘드리아 개체군과 적절한 기능을 유지하는 것이 중요합니다. 미토콘드리아는 매우 가소성적이고 역동적 인 세포 기관입니다. 이들의 형태와 기능은 미토콘드리아 단백질의 번역 후 변형 (PTM), 미토콘드리아 생물 발생, 융합, 핵분열 및 미토파지 9,10을 포함한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의해 제어됩니다. 다이나민 관련 단백질 1 (DRP1)에 의해 매개되는 미토콘드리아 분열은 다이나민 수퍼 패밀리의 GTPase로 작고 둥근 미토콘드리아를 생성하고 기능 장애 미토콘드리아를 분리하며, 이는 미토파지11,12에 의해 제거되고 분해 될 수 있습니다.
Mitophagy는 자가포식에 의해 미토콘드리아를 선택적으로 분해하는 세포 과정으로, 일반적으로 손상, 노화 또는 스트레스 후 손상된 미토콘드리아에서 발생합니다. 이어서, 이들 미토콘드리아는 분해10을 위해 리소좀으로 전달된다. 따라서 미토파지는 다양한 세포 유형에서 미토콘드리아의 양과 질을 건강한 상태로 유지하는 데 도움이 되는 이화 과정입니다. 그것은 정상적인 생리적 및 스트레스 조건 하에서 세포 항상성의 회복에 결정적인 역할을합니다13,14. 세포는 세포 스트레스와 발달 변화의 다른 신호에 의해 유도되는 복잡한 미토파지 메커니즘을 특징으로합니다. 미토파지 조절 경로는 유비퀴틴 의존성 또는 수용체 의존성15,16으로 분류됩니다. 유비퀴틴 의존성 자가포식은 키나아제 PINK1 및 유비퀴틴 리가아제 Parkin E3의 미토콘드리아 17,18로의 동원에 의해 매개되는 반면, 수용체-의존성 자가포식은 미토콘드리아 손상에 반응하여 미토포식을 매개하는 미세소관 관련 단백질 경쇄 LC3에 대한 자가포식 수용체의 결합을 포함합니다19.
투과 전자 현미경 (TEM)은 가장 일반적으로 사용되는 방법이며 여전히 mitophagy20을 관찰하고 검출하는 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 미토파지의 형태학적 특징은 자가포식소체와 리소좀의 융합에 의해 형성된 자가포식체 또는 자가소좀이며, 이는 전자 현미경 이미지(21)로부터 관찰될 수 있다. 그러나, 전자 현미경(EM)의 약점은 살아있는 세포(20)에서 미토콘드리아 탈분극, 미토콘드리아 분열, 및 자가포식과 리소좀의 융합과 같은 미토포지의 동적 과정을 모니터링할 수 없다는 것이다. 따라서 살아있는 세포 기관 이미징을 통해 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 매력적인 대안 방법입니다. 여기에 설명된 라이브 셀 이미징 기술은 두 가지 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아와 리소좀을 염색합니다. 미토파지가 발생하면 자가포식소체에 의해 휩싸인 손상되거나 불필요한 미토콘드리아는 미토콘드리아 염료에 의해 녹색으로 염색되고 빨간색 염료는 리소좀을 염색합니다. 자가포식소체라고 하는 이러한 자가포식체와 리소좀의 융합은 녹색과 빨간색 형광이 겹쳐져 노란색 점으로 나타나 미토파지22의 발생을 나타냅니다. 세포 투과성 미토콘드리아 염료(MitoTracker Green)는 미토콘드리아23을 표지하기 위해 약한 티올 반응성 클로로메틸 잔기를 포함합니다. 미토콘드리아에 라벨을 붙이기 위해 세포는 단순히 염료와 함께 배양되며, 염료는 원형질막을 가로 질러 수동적으로 확산되어 활성 미토콘드리아에 축적됩니다. 이 미토콘드리아 염료는 살아있는 세포를 쉽게 염색 할 수 있으며 알데히드 고정 또는 죽은 세포를 염색하는 데 덜 효과적입니다. 리소좀 염료(LysoTracker Red)는 살아있는 세포에서 산성 소기관을 표지하고 추적하는 데 사용되는 형광 유산 탐침입니다. 이 염료는 산성 세포 기관에 대해 높은 선택성을 나타내며 나노몰 농도에서 살아있는 세포를 효과적으로 표지할 수 있습니다24.
살아있는 세포에서 이러한 형광 염료를 사용하는 절차, 즉 염료 로딩 및 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화가 여기에 나와 있습니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

세포의 발전소 인 미토콘드리아는 생체 에너지, 자유 라디칼 생성, 칼슘 항상성 및 세포 사멸에 중요한 역할을합니다. Mitophagy는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘이며 일반적으로 현미경 관찰을 사용하여 연구되지만 생체 내 미토파지 분석은 수행하기가 어렵습니다. 살아있는 세포 소기관을 이미징하여 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 대안적이고 필요한 방법입니다. 이 프로토콜은 염료의 로딩, 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화 및 예상 결과를 포함하여 살아있는 세포에서 세포 투과성 녹색-형광 미토콘드리아 염료 MitoTracker Green 및 적색 형광 리소좀 염료 LysoTracker Red를 사용하는 절차를 설명합니다. 살아있는 세포에서 미토파지 평가를 위한 자세한 단계와 현미경 소프트웨어 설정에 대한 기술 참고 사항도 제공됩니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

MitoTracker Green은 미토콘드리아에 정확하게 국한될 수 있는 녹색 형광 미토콘드리아 염색입니다. 염료는 살아있는 세포를 쉽게 염색할 수 있으며 알데히드 고정 또는 죽은 세포를 염색하는 데 덜 효과적입니다(그림 2). 적색 형광 리소좀 염료 LysoTracker Red는 산성 리소좀 소기관을 표지하고 추적할 수 있으며 살아있는 세포만 염색할 수 있습니다(그림 2). ?...

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Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

이 방법은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하는 데 도움이 됩니다. Mitophagy는 미토콘드리아 항상성과 세포 기능의 다양한 측면을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 이 기술은 미토콘드리아 관련 질병의 치료에 대한 새로운 접근법을 제공 할 수 있습니다.이 절차는 그리 복잡하지 않습니다. 선명한 이미지를 캡처하는 것은 미토콘드리아와 리소좀의 오버레이를 계산하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 세포를 Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 DMEM 10밀리리터와 함께 10cm 세포 배양 접시에서 배양합니다.섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양하고 100X 배율로 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 세포가 80-90 % 컨플루언시에 도달하면 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 2 밀리리터로 씻어냅니다. 그런 다음 0.05 % 트립신 EDTA 2 밀리리터를 1 분 동안 첨가하여 세포를 해리시킨 다음 DMEM 2 밀리리터를 첨가하여 반응을 중지시킵니다.세포 현탁액을 100G에서 3분 동안 원심분리하고 펠릿을 1밀리리터 DMEM에 재현탁합니다. 자동 세포 계수기 및 세포 계수 챔버 슬라이드를 사용하여 세포를 계수하고 10 밀리리터의 DMEM이 포함된 새로운 10cm 세포 배양 접시에 6번째 세포에 1.5배 10배를 접종합니다. 미토파지 분석을 위해, 기재된 바와 같이 세포 현탁액을 제조하고, 세포 현탁액을 신선한 DMEM의 밀리리터당 10 내지 5번째 세포로 희석한다.희석 된 세포 현탁액 2 밀리리터를 20 밀리미터 공초점 접시에 넣고 접시를 십자가로 흔든다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 저장 용액을 희석하여 염료의 작업 용액을 준비하십시오.2 밀리리터의 DMEM에 0.2 밀리몰 미토콘드리아 염료 및 50 마이크로 몰 리소좀 염료의 각각 2 마이크로 리터를 첨가하여 0.2 마이크로 몰 미토콘드리아 염료 및 50 나노 몰 리소좀 염료의 작동 농도를 얻는다. 컨포칼 배양 접시에서 배지를 제거하고 염색 용액 1밀리리터를 추가하여 세포를 덮습니다. 세포 배양 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에 20-30분 동안 두십시오.컨포칼 현미경 이미징 소프트웨어의 파라미터를 설정합니다. 이중 여기 이미지의 경우 488나노미터 및 543나노미터에서 순차 여기를 사용하고 각각 505 - 545나노미터 및 560나노미터 이상에서 방출을 수집합니다. 인큐베이터에서 염료가 들어있는 배양 배지 접시를 제거하고 1 밀리리터의 Krebs-Henseleit 또는 KH 버퍼를 접시에 첨가하십시오.미토파지를 유도하기 위해, 실온에서 10분 동안 KH 완충액 중 1개의 마이크로몰에서 FCCP로 세포를 처리하고 즉시 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하기 진행한다. 63X 오일 렌즈 상단에 적당량의 오일을 바릅니다. 샘플을 컨포칼 현미경의 샘플 스테이지에 놓고 대물 렌즈 바로 위로 이동합니다.이미징 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 찾기 탭을 클릭하여 샘플을 찾습니다. 실험에 사용할 녹색 필터 집합을 선택합니다. 거친 조정 손잡이를 사용하여 대물 렌즈를 위아래로 움직여 빠르게 초점을 맞춥니다.접안 렌즈를 통해 세포 샘플을 명확하게 볼 수있게되면 단일 세포 영역을 검색하고 초점을 맞추고 시야의 중심으로 이동합니다. 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 획득 탭을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 미리 보려면 488나노미터 채널과 프레임 해상도 1024 x 1024만 선택합니다.왼쪽 상단 모서리에 있는 라이브 탭을 클릭하여 라이브 스캔을 시작합니다. 시야를 가장 선명하게 조정하고 슬라이더를 왼쪽 또는 오른쪽으로 움직여 레이저 출력을 조정합니다. 과다 노출을 방지하기 위해 게인 설정을 600 미만으로 유지하십시오.핀홀 값을 156으로, 게인 값을 545로, 디지털 오프셋 값을 0으로 조정합니다. 최상의 시야를 선택하고 두 채널을 확인한 다음 프레임 해상도 1024 x 1024를 선택합니다. 스냅(Snap)을 클릭하여 2D 이미지를 획득하고 획득한 이미지를 저장합니다.이 연구에서 FFCP는 컨포칼 이미징을 위해 MEF 세포에서 미토파지를 촉발하는 데 사용되었습니다. 미토콘드리아를 나타내는 녹색 형광 미토콘드리아 염료로 염색하고 리소좀을 나타내는 적색 형광 리소좀 염료로 염색한 세포의 대표 이미지가 여기에 나와 있습니다. 손상된 녹색으로 염색된 미토콘드리아가 붉게 염색된 리소좀에 휩싸이면 녹색과 빨간색 형광이 겹쳐져 노란색의 공동 국소화된 미토콘드리아 리소좀이 드러납니다.노란색 점은 진행중인 미토파지를 나타내는 이러한 공동 국소화 된 미토콘드리아 리소좀에 해당하므로 미토파지의 범위를 평가하기 위해 계산할 수 있습니다. 미토콘드리아 및 리소좀 염색을 위한 염료 작업 용액의 준비와 컨포칼 현미경으로 이미징할 때 적절한 세포 밀도를 유지하는 것이 기억해야 할 핵심 단계입니다. 이 절차는 또한 미토콘드리아 역학을 평가하는 데 중요한 미토콘드리아 수와 형태를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.Mitophagy는 다양한 인간 질병과 밀접한 관련이 있으며이 기술은 Mitophagy와 인간 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

연구

생물학

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

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라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...