Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,), og programmet for professor i spesiell avtale ved Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

1. Cellekultur og passasje
MERK: Protokollen er beskrevet ved hjelp av rutinemessig dyrkede mus embryonale fibroblaster (MEFs) som et eksempel.
<ol><li>Kultur MEF-celler i 10 cm cellekulturretter med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 og overvåk cellene under et mikroskop ved 100x forstørrelse.</li>
	<li>Utfør rutinemessig cellepassasje.<ol><li>Når cellene når 80% -90% sammenløp (hver 3. dag), vask cellene med 2 ml Du...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Protokollen beskrevet her gir en metode for evaluering og overvåking av den dynamiske prosessen med mitofagi i levende celler, som involverer autofagosomer, lysosomer og mitokondriell fisjon, gjennom farging med cellepermeant mitokondrier og lysosomfarger. Metoden kan også brukes til å identifisere mitokondrier og vurdere mitokondriell morfologi. Begge fargestoffene som brukes i denne studien bør beskyttes mot lys, flere fryse-tine sykluser bør unngås, og fargestoffene bør lagres i engangsbruk aliquots så mye som...

Mitokondrier er kraftverkene til nesten alle eukaryote celler 1,2. I tillegg til ATP-produksjon gjennom oksidativ fosforylering, spiller mitokondrier en viktig rolle i andre prosesser som bioenergetikk, kalsiumhomeostase, generering av frie radikaler, apoptose og cellulær homeostase 3,4,5. Som mitokondrier genererer reaktive oksygenarter (ROS) fra flere komplekser i elektrontransportkjeden, blir de stadig stimulert av potensielt oksidativt stress, noe som til slutt kan føre til strukturell skade og dysfunksjon når antioksidantforsvaret kollapser 6,7. Mitokondriell dysfunksjon har vist seg å bidra til mange sykdommer, inkludert metabolske forstyrrelser, nevrodegenerasjon og kardiovaskulær sykdom8. Derfor er det avgjørende å opprettholde sunne mitokondrielle populasjoner og deres riktige funksjon. Mitokondrier er svært plastiske og dynamiske organeller; deres morfologi og funksjon styres av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer, inkludert posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) av mitokondrielle proteiner, mitokondriell biogenese, fusjon, fisjon og mitophagy 9,10. Mitokondriell fisjon mediert av dynaminrelatert protein 1 (DRP1), en GTPase av dynamin-superfamilien av proteiner, resulterer i små og runde mitokondrier og isolerer de dysfunksjonelle mitokondriene, som kan fjernes og nedbrytes av mitofagi11,12.
Mitophagy er en cellulær prosess som selektivt nedbryter mitokondrier ved autofagi, som vanligvis forekommer i skadede mitokondrier etter skade, aldring eller stress. Deretter leveres disse mitokondriene til lysosomer for nedbrytning10. Dermed er mitofagi en katabolsk prosess som bidrar til å opprettholde mengden og kvaliteten på mitokondrier i en sunn tilstand i et bredt spekter av celletyper. Det spiller en avgjørende rolle i restaureringen av cellulær homeostase under normale fysiologiske og stressforhold13,14. Celler er preget av en kompleks mitofagimekanisme, som induseres av forskjellige signaler om cellulær stress og utviklingsendringer. Mitophagy regulatoriske veier er klassifisert som ubiquitin-avhengige eller reseptoravhengige15,16; den ubiquitinavhengige autofagien medieres av kinase PINK1 og rekrutteringen av ubiquitinligase Parkin E3 til mitokondriene 17,18, mens reseptoravhengig autofagi innebærer binding av autofagireseptorer til den mikrotubuli-assosierte proteinlyskjeden LC3 som formidler mitofagi som respons på mitokondriell skade19.
Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) er den mest brukte metoden, og fortsatt en av de beste metodene, for å observere og oppdage mitofagi20. De morfologiske egenskapene til mitofagi er autofagosomer eller autolysosomer dannet ved fusjon av autofagosomer med lysosomer, som kan observeres fra elektronmikroskopibilder21. Svakheten ved elektronmikroskopi (EM) er imidlertid manglende evne til å overvåke de dynamiske prosessene for mitofagi, som mitokondriell depolarisering, mitokondriell fisjon og fusjon av autofagosomer og lysosomer, i levende celle20. Dermed er evaluering av mitofagi gjennom avbildning av levende organeller en attraktiv alternativ metode for mitokondriell forskning. Levende celleavbildningsteknikken beskrevet her bruker to fluorescerende fargestoffer for å flekke mitokondrier og lysosomer. Når mitofagi oppstår, blir skadede eller overflødige mitokondrier oppslukt av autofagosomer farget grønt av mitokondrielt fargestoff, mens det røde fargestoffet flekker lysosomene. Fusjonen av disse autofagosomer og lysosomer, referert til som autolysosomer, fører til at grønn og rød fluorescens overlapper og manifesterer seg som gule prikker, og indikerer dermed forekomsten av mitophagy22. Den celle-permeant mitokondrier fargestoff (MitoTracker Green) inneholder en mildt tiol-reaktiv klormetyl del å merke mitokondrier23. For å merke mitokondrier inkuberes celler ganske enkelt med fargestoffet, som diffunderer passivt over plasmamembranen og akkumuleres i aktive mitokondrier. Dette mitokondrierfargestoffet kan lett flekke levende celler, og er mindre effektivt i farging av aldehydfaste eller døde celler. Lysosomfargestoffet (LysoTracker Red) er en fluorescerende acidotrop sonde som brukes til merking og sporing av sure organeller i levende celler. Dette fargestoffet utviser en høy selektivitet for sure organeller og kan effektivt merke levende celler ved nanomolare konsentrasjoner24.
Prosedyrene for bruk av disse fluorescerende fargestoffene i levende celler, inkludert lasting av fargestoffer og visualisering av mitokondrier og lysosomer, presenteres her. Denne metoden kan hjelpe forskere med å observere mitofagi ved hjelp av levende cellefluorescerende mikroskopi. Det kan også brukes til å kvantifisere mitokondrier og lysosomer, og vurdere mitokondriell morfologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Mitokondrier, som er cellens kraftverk, spiller viktige roller i bioenergetikk, generering av frie radikaler, kalsiumhomeostase og apoptose. Mitofagi er den primære mekanismen for mitokondriell kvalitetskontroll og studeres vanligvis ved hjelp av mikroskopisk observasjon, men in vivo mitophagy-analyser er vanskelige å utføre. Evaluering av mitofagi ved å avbilde levende organeller er en alternativ og nødvendig metode for mitokondriell forskning. Denne protokollen beskriver prosedyrene for bruk av celle-permeant grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff MitoTracker Green og rød-fluorescerende lysosom fargestoff LysoTracker Red i levende celler, inkludert lasting av fargestoffer, visualisering av mitokondrier og lysosom, og forventede resultater. Detaljerte trinn for evaluering av mitofagi i levende celler, samt tekniske notater om mikroskopprogramvareinnstillinger, er også gitt. Denne metoden kan hjelpe forskere med å observere mitofagi ved hjelp av levende cellefluorescerende mikroskopi. I tillegg kan den brukes til å kvantifisere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriell morfologi.

MitoTracker Green er en grønn-fluorescerende mitokondriell flekk som er i stand til å lokalisere nøyaktig til mitokondrier. Fargestoffet kan lett farge levende celler og er mindre effektivt i farging av aldehydfaste eller døde celler (figur 2). Det rødfluorescerende lysosomfargestoffet LysoTracker Red er i stand til å merke og spore sure lysosomale organeller og kan bare flekke levende celler (figur 2). Konfokalmikroskopavbildning tillater visualisering av...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitophagy er den primære mekanismen for mitokondriell kvalitetskontroll. Evalueringen av mitofagi in vivo hindres imidlertid av mangelen på pålitelige kvantitative analyser. Presentert her er en protokoll for observasjon av mitophagy i levende celler ved hjelp av et celle-permeant grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff og en rød-fluorescerende lysosom fargestoff.

Visualisering av mitofagi med fluorescerende fargestoffer for mitokondrier og lysosom

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Denne metoden bidrar til å observere mitofagi i levende celler ved hjelp av en celle permeant grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff og en rød-fluorescerende lysosom fargestoff. Mitophagy spiller en viktig rolle i å opprettholde mitokondrier homeostase og ulike aspekter av cellulær funksjon. Denne teknikken kan gi en ny tilnærming til behandling av mitokondrier-relaterte sykdommer.Denne prosedyren er ikke veldig komplisert. Å ta klare bilder er svært viktig for å telle overlegget av mitokondrier og lysosomer. For å begynne, kultur mus embryonale fibroblast- eller MEF-celler i en 10 centimeter cellekulturskål med 10 milliliter Dulbeccos modifiserte Eagle Medium eller DMEM.Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid og overvåke cellene under et mikroskop ved 100X forstørrelse. Når cellene når 80 til 90% sammenløp, vask dem med to milliliter Dulbeccos fosfatbufrede saltvann. Deretter legger du til to milliliter 0,05% trypsin EDTA i ett minutt for å dissosiere cellene, etterfulgt av to milliliter DMEM for å stoppe reaksjonen.Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 G i tre minutter og resuspenderer pelleten i en milliliter DMEM. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller og celletellingskammer og inokulere 1,5 ganger 10 til de sjette cellene til en ny 10 centimeter cellekulturskål som inneholder 10 milliliter DMEM. For mitophagy-analysen, lag en cellesuspensjon som beskrevet og fortynn cellesuspensjonen til en gang 10 til de femte cellene per milliliter fersk DMEM.Tilsett to milliliter av den fortynnede cellesuspensjonen til en 20 millimeter konfokal tallerken og rist parabolen i et kryss. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 24 timer. Forbered arbeidsløsninger av fargestoffene ved å fortynne lagerløsningene.Tilsett to mikroliter hver av 0, 2 millimolar mitokondrielt fargestoff og 50 mikromolar lysosomfargestoff til to milliliter DMEM for å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 0, 2 mikromolar mitokondrielt fargestoff og 50 nanomolar lysosomfargestoff. Fjern mediet fra konfokalkulturskålen og tilsett en milliliter av fargeløsningen for å dekke cellene. Plasser cellekulturskålen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 20 til 30 minutter.Still inn parametrene til programvaren for konfokal mikroskopiavbildning. For doble eksitasjonsbilder, bruk sekvensiell eksitasjon ved 488 nanometer og 543 nanometer og samle utslipp ved henholdsvis 505 til 545 nanometer og større enn 560 nanometer. Fjern kulturmediumskålen som inneholder fargestoffet fra inkubatoren og tilsett en milliliter Krebs-Henseleit eller KH-buffer til parabolen.For å indusere mitofagi, behandle cellene med FCCP ved en mikromolar i KH-buffer i 10 minutter ved romtemperatur og fortsett umiddelbart å avbilde cellene ved hjelp av konfokalmikroskopet. Påfør en passende mengde olje på toppen av 63X oljelinsen. Plasser prøven på prøvetrinnet i det konfokale mikroskopet og flytt den rett over objektivlinsen.Bruk bildebehandlingsprogramvaren til å finne prøven ved å klikke på Finn fanen øverst til venstre i programvaregrensesnittet. Velg et grønt filtersett for eksperimentet. Bruk grovjusteringsknappen til å fokusere raskt ved å flytte objektivlinsen opp og ned.Etter at celleprøven er tydelig synlig gjennom okularet, søk og fokuser området av enkeltceller og flytt det til midten av synsfeltet. Klikk på fanen Anskaffelse øverst til venstre i programvaregrensesnittet for å skaffe bilder. Velg bare 488 nanometerkanalen og rammeoppløsningen 1024 x 1024 for forhåndsvisning.Klikk på Live-fanen øverst til venstre for å starte en live skanning. Juster synsfeltet til det skarpeste, og juster lasereffekten ved å flytte glidebryteren til venstre eller høyre. Hold forsterkningsinnstillingen under 600 for å unngå overeksponering.Juster nålehullsverdien til 156, forsterkningsverdi til 545 og digital forskyvningsverdi til null. Velg det beste synsfeltet, sjekk de to kanalene og velg rammeoppløsningen 1024 x 1024. Klikk på Fest for å hente 2D-bilder og lagre de hentede bildene.I denne studien ble FFCP brukt til å utløse mitofagi i MEF-celler for konfokal avbildning. Representative bilder av celler farget med det grønnfluorescerende mitokondrierfargestoffet som viser mitokondrier og farget med det rødfluorescerende lysosomfargestoffet som viser lysosom, er vist her. Når skadede grønnfargede mitokondrier blir oppslukt av rødfargede lysosomer, overlapper den grønne og røde fluorescensen for å avsløre gule samlokaliserte mitokondrier lysosomer.De gule prikkene tilsvarer disse samlokaliserte mitokondriene lysosomer som representerer pågående mitofagi og kan dermed telles for å evaluere omfanget av mitofagi. Fremstilling av en arbeidsløsning av fargestoffer for mitokondrier og lysosomfarging og opprettholdelse av passende cellekonfluens ved avbildning med konfokalmikroskopi er viktige trinn å huske. Denne prosedyren kan også brukes til å analysere mitokondrielt antall og morfologi som er viktig for å vurdere mitokondriell dynamikk.Mitofagi er nært forbundet med en rekke menneskelige sykdommer, og denne teknikken kan brukes til å utforske sammenhengen mellom mitofagi og menneskelige sykdommer.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisere Bakterier i Nematoder med fluorescerende Mikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging av enkelt Mitokondrielle superoksid Blinker Intakt hjerte eller<em&gt; I Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

A Guide to Modern Kvantitativ Fluorescent Western Blotting med Feilsøking Strategier

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Følsom måling av Mitophagy av Flow cytometri ved hjelp av pH-avhengig fluorescerende Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Anvendelse av membran og Cell Wall selektiv fluorescerende fargestoffer for Live-Cell Imaging av trådformede sopp

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...