Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Эта работа была частично профинансирована Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Национальным фондом естественных наук Китая (81970333,31901044, и Программой для профессора специального назначения в Шанхайских высших учебных заведениях (GZ2020008).

1. Клеточная культура и пассаж
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан с использованием обычно культивируемых мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в качестве примера.
<ol><li>Культивируйте клетки MEF в чашках для культивирования клеток 10 см с 10 мл модифицированной орлиной с?...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Протокол, описанный здесь, предоставляет метод оценки и мониторинга динамического процесса митофагии в живых клетках, включая аутофагосомы, лизосомы и деление митохондрий, путем совместного окрашивания с клеточными проницаемыми митохондриями и лизосомными красителями. Метод также м...

Митохондрии являются электростанциями почти всех эукариотических клеток 1,2. В дополнение к производству АТФ путем окислительного фосфорилирования, митохондрии играют жизненно важную роль в других процессах, таких как биоэнергетика, гомеостаз кальция, генерация свободных радикалов, апоптоз и клеточный гомеостаз 3,4,5. Поскольку митохондрии генерируют активные формы кислорода (АФК) из нескольких комплексов в цепи переноса электронов, они постоянно стимулируются потенциальным окислительным стрессом, который в конечном итоге может привести к структурным повреждениям и дисфункции, когда система антиоксидантной защиты разрушается 6,7. Было обнаружено, что митохондриальная дисфункция способствует развитию многих заболеваний, включая метаболические нарушения, нейродегенерацию и сердечно-сосудистые заболевания8. Поэтому крайне важно поддерживать здоровые митохондриальные популяции и их правильную функцию. Митохондрии являются высокопластичными и динамичными органеллами; их морфология и функция контролируются механизмами контроля качества митохондрий, включая посттрансляционные модификации (ПТМ) митохондриальных белков, митохондриальный биогенез, слияние, деление и митофагию 9,10. Митохондриальное деление, опосредованное связанным с динамином белком 1 (DRP1), ГТФазой надсемейства динаминов белков, приводит к малым и круглым митохондриям и изолирует дисфункциональные митохондрии, которые могут быть очищены и деградированы митофагией11,12.
Митофагия — это клеточный процесс, который избирательно разрушает митохондрии путем аутофагии, обычно происходящей в поврежденных митохондриях после травмы, старения или стресса. Впоследствии эти митохондрии доставляются в лизосомы для деградации10. Таким образом, митофагия является катаболическим процессом, который помогает поддерживать количество и качество митохондрий в здоровом состоянии в широком диапазоне типов клеток. Он играет решающую роль в восстановлении клеточного гомеостаза в нормальных физиологических и стрессовых условиях13,14. Клетки характеризуются сложным механизмом митофагии, который индуцируется различными сигналами клеточного стресса и изменений в развитии. Регуляторные пути митофагии классифицируются как убиквитин-зависимые илирецептор-зависимые 15,16; убиквитин-зависимая аутофагия опосредована киназой PINK1 и рекрутированием убиквитин-лигазы Parkin E3 в митохондрии17,18, в то время как рецептор-зависимая аутофагия включает связывание рецепторов аутофагии с микротрубочкой-ассоциированной белковой легкой цепью LC3, которая опосредует митофагию в ответ на повреждение митохондрий19.
Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) является наиболее часто используемым методом и до сих пор одним из лучших методов для наблюдения и обнаружения митофагии20. Морфологическими особенностями митофагии являются аутофагосомы или аутолизосомы, образованные слиянием аутофагосом с лизосомами, что можно наблюдать по изображениям электронной микроскопии21. Слабость электронной микроскопии (ЭМ), однако, заключается в неспособности контролировать динамические процессы митофагии, такие как деполяризация митохондрий, деление митохондрий и слияние аутофагосом и лизосом, в живой клетке20. Таким образом, оценка митофагии с помощью визуализации живых органелл является привлекательным альтернативным методом митохондриальных исследований. Метод визуализации живых клеток, описанный здесь, использует два флуоресцентных красителя для окрашивания митохондрий и лизосом. Когда происходит митофагия, поврежденные или лишние митохондрии, поглощенные аутофагосомами, окрашиваются в зеленый цвет митохондриальным красителем, в то время как красный краситель окрашивает лизосомы. Слияние этих аутофагосом и лизосом, называемых аутолизосомами, приводит к тому, что зеленая и красная флуоресценция перекрываются и проявляются в виде желтых точек, что указывает на возникновение митофагии22. Клеточно-проницаемый краситель митохондрий (MitoTracker Green) содержит умеренно тиол-реактивный хлорметиловый фрагмент для маркировки митохондрий23. Чтобы метить митохондрии, клетки просто инкубируются с красителем, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и накапливается в активных митохондриях. Этот краситель митохондрий может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток. Лизосомный краситель (LysoTracker Red) представляет собой флуоресцентный ацидотропный зонд, используемый для маркировки и отслеживания кислых органелл в живых клетках. Этот краситель проявляет высокую селективность для кислых органелл и может эффективно маркировать живые клетки при наномолярных концентрациях24.
Здесь представлены процедуры использования этих флуоресцентных красителей в живых клетках, включая загрузку красителей и визуализацию митохондрий и лизосом. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Он также может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Митохондрии, будучи электростанциями клетки, играют важную роль в биоэнергетике, генерации свободных радикалов, гомеостазе кальция и апоптозе. Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий и обычно изучается с использованием микроскопических наблюдений, однако анализы митофагии in vivo трудно выполнить. Оценка митофагии путем визуализации живых органелл является альтернативным и необходимым методом митохондриальных исследований. Этот протокол описывает процедуры использования клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий MitoTracker Green и красного флуоресцентного лизосомного красителя LysoTracker Red в живых клетках, включая загрузку красителей, визуализацию митохондрий и лизосом, а также ожидаемые результаты. Также приведены подробные шаги по оценке митофагии в живых клетках, а также технические примечания о настройках программного обеспечения микроскопа. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Кроме того, он может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.

MitoTracker Green представляет собой зелено-флуоресцентное митохондриальное пятно, которое способно точно локализоваться в митохондриях. Краситель может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток (рисунок 2). ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий. Однако оценке митофагии in vivo препятствует отсутствие надежных количественных анализов. Здесь представлен протокол наблюдения митофагии в живых клетках с использованием клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красных флуоресцентных лизосом.

Визуализация митофагии флуоресцентными красителями для митохондрий и лизосом

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Этот метод помогает наблюдать митофагию в живых клетках с использованием клеточного проницаемого зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красно-флуоресцентной лизосомы. Митофагия играет важную роль в поддержании гомеостаза митохондрий и различных аспектов клеточной функции. Этот метод может обеспечить новый подход к лечению заболеваний, связанных с митохондриями.Эта процедура не очень сложная. Захват четких изображений очень важен для подсчета наложения митохондрий и лизосом. Для начала культивируйте эмбриональные фибробласты мышей или MEF-клетки в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток с 10 миллилитрами модифицированной орлиной среды Dulbecco или DMEM.Инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа и контролируйте клетки под микроскопом при 100-кратном увеличении. Когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, промыть их двумя миллилитрами фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco. Затем добавьте два миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА в течение одной минуты, чтобы диссоциировать клетки, а затем два миллилитра DMEM, чтобы остановить реакцию.Центрифугируют клеточную суспензию при 100 Г в течение трех минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре DMEM. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток и слайдов камеры подсчета клеток и прививайте 1,5 раза 10 к шестым клеткам в новую 10-сантиметровую чашку для культуры клеток, содержащую 10 миллилитров DMEM. Для анализа митофагии подготовьте клеточную суспензию, как описано, и разбавьте клеточную суспензию до одного раза от 10 до пятой клетки на миллилитр свежего DMEM.Добавьте два миллилитра разбавленной клеточной суспензии в 20-миллиметровую конфокальную посуду и встряхните блюдо крестиком. Инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Готовят рабочие растворы красителей путем разбавления исходных растворов.Добавьте два микролитра каждого из 0,2 миллимолярного митохондриального красителя и 50 микромолярного лизосомного красителя к двум миллилитрам DMEM для получения рабочей концентрации 0,2 микромолярного митохондриального красителя и 50 наномолярного лизосомного красителя. Удалите среду из чашки для конфокальной культуры и добавьте один миллилитр окрашивающего раствора, чтобы покрыть клетки. Поместите чашку для культивирования клеток при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа в течение 20-30 минут.Задайте параметры программного обеспечения для визуализации конфокальной микроскопии. Для изображений с двойным возбуждением используйте последовательное возбуждение при 488 нанометрах и 543 нанометрах и собирайте излучение при 505-545 нанометрах и более 560 нанометров соответственно. Выньте из инкубатора чашку из культуральной среды, содержащую краситель, и добавьте в блюдо один миллилитр буфера Krebs-Henseleit или KH.Чтобы индуцировать митофагию, обработайте клетки FCCP на одном микромоляре в буфере KH в течение 10 минут при комнатной температуре и немедленно приступайте к изображению клеток с помощью конфокального микроскопа. Нанесите соответствующее количество масла на верхнюю часть масляной линзы 63X. Поместите образец на стадию образца конфокального микроскопа и переместите его непосредственно над объективом.Используйте программное обеспечение для создания образов, чтобы найти образец, щелкнув вкладку Поиск в левом верхнем углу интерфейса программного обеспечения. Выберите зеленый фильтр для эксперимента. Используйте грубую ручку регулировки для быстрой фокусировки, перемещая объектив вверх и вниз.После того, как образец ячейки будет хорошо виден через окуляр, выполните поиск и сфокусируйте область отдельных ячеек и переместите ее в центр поля зрения. Нажмите на вкладку «Приобретение» в левом верхнем углу программного интерфейса, чтобы получить изображения. Для предварительного просмотра выберите только 488-нанометровый канал и разрешение кадра 1024 на 1024.Нажмите на вкладку Live в левом верхнем углу, чтобы начать сканирование в реальном времени. Отрегулируйте поле зрения до максимально четкого и отрегулируйте мощность лазера, переместив ползунок влево или вправо. Держите коэффициент усиления ниже 600, чтобы избежать чрезмерной экспозиции.Отрегулируйте значение точечного отверстия до 156, значение усиления до 545 и значение цифрового смещения до нуля. Выберите лучшее поле зрения, проверьте два канала и выберите разрешение кадра 1024 на 1024. Нажмите кнопку Привязать, чтобы получить 2D-изображения и сохранить полученные изображения.В этом исследовании FFCP использовался для запуска митофагии в клетках MEF для конфокальной визуализации. Здесь показаны репрезентативные изображения клеток, окрашенных зелено-флуоресцентным красителем митохондрий, показывающим митохондрии, и окрашенных краснофлуоресцентным красителем лизосомы, показывающим лизосому. Когда поврежденные зеленые митохондрии поглощаются красными лизосомами, зеленая и красная флуоресценция перекрываются, чтобы выявить желтые колокализованные лизосомы митохондрий.Желтые точки соответствуют этим колокализованным лизосомам митохондрий, представляющим текущую митофагию, и, таким образом, могут быть подсчитаны для оценки степени митофагии. Приготовление рабочего раствора красителей для окрашивания митохондрий и лизосом и поддержание соответствующего слияния клеток при визуализации с помощью конфокальной микроскопии являются ключевыми шагами, которые необходимо запомнить. Эта процедура также может быть использована для анализа митохондриального числа и морфологии, что важно для оценки динамики митохондрий.Митофагия тесно связана с различными заболеваниями человека, и этот метод может быть использован для изучения связи между митофагией и заболеваниями человека.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Визуализация Живая Drosophila Глиальные-нервно-мышечном соединении с флуоресцентными красителями

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или<em&gt; В Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Руководство по современной количественной Люминесцентная Вестерн-блоттинга с устранения неисправностей стратегий

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Применение Membrane и клеточной стенки селективные флуоресцентные красители для Live-Cell Imaging filamentous Грибы

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...