Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
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Este trabajo fue financiado parcialmente por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970333,31901044), y el Programa para Profesor de Nombramiento Especial en las Instituciones de Educación Superior de Shanghai (GZ2020008).

1. Cultivo celular y pasaging
NOTA: El protocolo se describe utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) cultivados rutinariamente como ejemplo.
<ol><li>Cultive células MEF en placas de cultivo celular de 10 cm con 10 ml de medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 y monitorizar las células bajo un microscopio a un aumento de 100x.</li>
	<li>Realizar el paso celular de rutina.<ol><li>Cuando las células alcancen el 80% ...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

El protocolo descrito aquí proporciona un método para evaluar y monitorear el proceso dinámico de la mitofagia en células vivas, que involucra autofagosomas, lisosomas y fisión mitocondrial, a través de la tinción conjunta con mitocondrias permisas y colorantes lisosómicos permisionales. El método también se puede utilizar para identificar mitocondrias y evaluar la morfología mitocondrial. Ambos colorantes utilizados en este estudio deben protegerse de la luz, deben evitarse los ciclos múltiples de congelaci?...

Las mitocondrias son las centrales eléctricas de casi todas las células eucariotas 1,2. Además de la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa, las mitocondrias juegan un papel vital en otros procesos como la bioenergética, la homeostasis del calcio, la generación de radicales libres, la apoptosis y la homeostasis celular 3,4,5. A medida que las mitocondrias generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de múltiples complejos en la cadena de transporte de electrones, son estimuladas constantemente por el estrés oxidativo potencial, que eventualmente puede conducir a daños estructurales y disfunción cuando el sistema de defensa antioxidante colapsa 6,7. Se ha encontrado que la disfunción mitocondrial contribuye a muchas enfermedades, incluidos los trastornos metabólicos, la neurodegeneración y las enfermedades cardiovasculares8. Por lo tanto, es crucial mantener poblaciones mitocondriales sanas y su función adecuada. Las mitocondrias son orgánulos altamente plásticos y dinámicos; su morfología y función están controladas por mecanismos de control de calidad mitocondrial, incluyendo modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas mitocondriales, biogénesis mitocondrial, fusión, fisión y mitofagia 9,10. La fisión mitocondrial mediada por la proteína 1 relacionada con la dinamina (DRP1), una GTPasa de la superfamilia de proteínas dinamina, da como resultado mitocondrias pequeñas y redondas y aísla las mitocondrias disfuncionales, que pueden ser eliminadas y degradadas por la mitofagia11,12.
La mitofagia es un proceso celular que degrada selectivamente las mitocondrias por autofagia, que generalmente ocurre en las mitocondrias dañadas después de una lesión, envejecimiento o estrés. Posteriormente, estas mitocondrias son entregadas a los lisosomas para su degradación10. Por lo tanto, la mitofagia es un proceso catabólico que ayuda a mantener la cantidad y calidad de las mitocondrias en un estado saludable en una amplia gama de tipos de células. Desempeña un papel crucial en la restauración de la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y de estrés normales13,14. Las células se caracterizan por un complejo mecanismo de mitofagia, que es inducido por diferentes señales de estrés celular y cambios en el desarrollo. Las vías reguladoras de la mitofagia se clasifican como dependientes de ubiquitina o dependientes de receptores15,16; la autofagia dependiente de ubiquitina está mediada por la quinasa PINK1 y el reclutamiento de ubiquitina ligasa Parkin E3 a las mitocondrias 17,18, mientras que la autofagia dependiente del receptor implica la unión de los receptores de autofagia a la cadena ligera LC3 asociada a microtúbulos que media la mitofagia en respuesta al daño mitocondrial19.
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el método más utilizado, y sigue siendo uno de los mejores, para observar y detectar la mitofagia20. Las características morfológicas de la mitofagia son autofagosomas o autolisosomas formados por la fusión de autofagosomas con lisosomas, que pueden ser observados a partir de imágenes de microscopía electrónica21. La debilidad de la microscopía electrónica (EM), sin embargo, es la incapacidad de monitorear los procesos dinámicos de la mitofagia, como la despolarización mitocondrial, la fisión mitocondrial y la fusión de autofagosomas y lisosomas, en la célula viva20. Por lo tanto, la evaluación de la mitofagia a través de imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo atractivo para la investigación mitocondrial. La técnica de imagen de células vivas descrita aquí utiliza dos tintes fluorescentes para teñir mitocondrias y lisosomas. Cuando ocurre la mitofagia, las mitocondrias dañadas o superfluas engullidas por autofagosomas se tiñen de verde por el tinte mitocondrial, mientras que el tinte rojo tiñe los lisosomas. La fusión de estos autofagosomas y lisosomas, denominados autolisosomas, hace que la fluorescencia verde y roja se superponga y se manifieste como puntos amarillos, indicando así la ocurrencia de mitofagia22. El colorante mitocondrial permean celular (MitoTracker Green) contiene una fracción clorometilo ligeramente reactiva al tiol para etiquetar las mitocondrias23. Para etiquetar las mitocondrias, las células simplemente se incuban con el tinte, que se difunde pasivamente a través de la membrana plasmática y se acumula en las mitocondrias activas. Este colorante mitocondrial puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído. El colorante lisosómico (LysoTracker Red) es una sonda acidotrópica fluorescente utilizada para etiquetar y rastrear orgánulos ácidos en células vivas. Este colorante exhibe una alta selectividad para orgánulos ácidos y puede etiquetar eficazmente las células vivas a concentraciones nanomolares24.
Aquí se presentan los procedimientos para usar estos tintes fluorescentes en células vivas, incluida la carga de los tintes y la visualización de mitocondrias y lisosomas. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. También se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas, y evaluar la morfología mitocondrial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Las mitocondrias, al ser las centrales eléctricas de la célula, juegan un papel importante en la bioenergética, la generación de radicales libres, la homeostasis del calcio y la apoptosis. La mitofagia es el mecanismo primario del control de calidad mitocondrial y generalmente se estudia mediante observación microscópica, sin embargo, los ensayos de mitofagia in vivo son difíciles de realizar. La evaluación de la mitofagia mediante imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo y necesario para la investigación mitocondrial. Este protocolo describe los procedimientos para usar el colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular MitoTracker Green y el colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red en células vivas, incluida la carga de los colorantes, la visualización de las mitocondrias y el lisosoma, y los resultados esperados. También se proporcionan pasos detallados para la evaluación de la mitofagia en células vivas, así como notas técnicas sobre la configuración del software del microscopio. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. Además, se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas y evaluar la morfología mitocondrial.

MitoTracker Green es una tinción mitocondrial verde-fluorescente que es capaz de localizar con precisión las mitocondrias. El colorante puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído (Figura 2). El colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red es capaz de etiquetar y rastrear orgánulos lisosomales ácidos y solo puede teñir células vivas (Figura 2). La imagen del microscopio co...

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Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Este método ayuda a observar la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente perceptible celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente. La mitofagia juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de las mitocondrias y varios aspectos de la función celular. Esta técnica podría proporcionar un nuevo enfoque para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las mitocondrias.Este procedimiento no es muy complicado. La captura de imágenes claras es muy importante para contar la superposición de mitocondrias y lisosomas. Para comenzar, cultive fibroblastos embrionarios de ratón o células MEF en una placa de cultivo celular de 10 centímetros con 10 mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM.Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y monitorear las células bajo un microscopio a un aumento de 100X. Cuando las células alcancen 80 a 90% de confluencia, lávelas con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Luego agregue dos mililitros de 0.05% tripsina EDTA durante un minuto para disociar las células, seguido de dos mililitros de DMEM para detener la reacción.Centrifugar la suspensión celular a 100 G durante tres minutos y volver a suspender el pellet en un mililitro DMEM. Cuente las células usando un contador celular automatizado y portaobjetos de cámara de conteo celular e inocule 1.5 veces 10 a la sexta celda en un nuevo plato de cultivo celular de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de DMEM. Para el ensayo de mitofagia, prepare una suspensión celular como se describe y diluya la suspensión celular a una vez de 10 a la quinta célula por mililitro de DMEM fresco.Agregue dos mililitros de la suspensión de celda diluida a una placa confocal de 20 milímetros y agite la placa en una cruz. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Preparar soluciones de trabajo de los colorantes diluyendo las soluciones madre.Agregue dos microlitros de colorante mitocondrial de 0,2 milimolares y 50 de colorante lisosómico micromolar a dos mililitros de DMEM para obtener una concentración de trabajo de 0,2 colorante mitocondrial micromolar y 50 colorante lisosómico nanomolar. Retire el medio de la placa de cultivo confocal y agregue un mililitro de la solución de tinción para cubrir las células. Coloque la placa de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos.Establezca los parámetros del software de imágenes de microscopía confocal. Para imágenes de excitación dual, use excitación secuencial a 488 nanómetros y 543 nanómetros y recoja la emisión a 505 a 545 nanómetros y más de 560 nanómetros respectivamente. Retire el plato de medio de cultivo que contiene el tinte de la incubadora y agregue un mililitro de tampón Krebs-Henseleit o KH al plato.Para inducir la mitofagia, trate las células con FCCP en un micromolar en tampón KH durante 10 minutos a temperatura ambiente e inmediatamente proceda a obtener imágenes de las células con el microscopio confocal. Aplique una cantidad adecuada de aceite en la parte superior de la lente de aceite 63X. Coloque la muestra en la etapa de muestra del microscopio confocal y muévala directamente sobre la lente del objetivo.Utilice el software de imágenes para encontrar la muestra haciendo clic en la pestaña Localizar en la esquina superior izquierda de la interfaz del software. Seleccione un conjunto de filtros verdes para el experimento. Utilice la perilla de ajuste gruesa para enfocar rápidamente moviendo la lente del objetivo hacia arriba y hacia abajo.Después de que la muestra de células sea claramente visible a través del ocular, busque y enfoque el área de celdas individuales y muévala al centro del campo de visión. Haga clic en la pestaña Adquisición en la esquina superior izquierda de la interfaz del software para adquirir imágenes. Seleccione solo el canal de 488 nanómetros y la resolución de fotogramas 1024 por 1024 para obtener una vista previa.Haga clic en la pestaña En vivo en la esquina superior izquierda para iniciar un escaneo en vivo. Ajuste el campo de visión al máximo y ajuste la potencia del láser moviendo el control deslizante hacia la izquierda o hacia la derecha. Mantenga el ajuste de ganancia por debajo de 600 para evitar la sobreexposición.Ajuste el valor del agujero de alfiler a 156, el valor de ganancia a 545 y el valor de desplazamiento digital a cero. Seleccione el mejor campo de visión, verifique los dos canales y elija la resolución de cuadro 1024 por 1024. Haga clic en Ajustar para adquirir imágenes 2D y guardar las imágenes adquiridas.En este estudio, FFCP se utilizó para desencadenar la mitofagia en células MEF para imágenes confocales. Aquí se muestran imágenes representativas de células teñidas con el colorante mitocondrial verde-fluorescente que muestra mitocondrias y teñidas con el colorante lisosómico fluorescente rojo que muestra lisosoma. Cuando las mitocondrias dañadas teñidas de verde son engullidas por lisosomas teñidos de rojo, la fluorescencia verde y roja se superponen para revelar lisosomas mitocondriales colocalizados amarillos.Los puntos amarillos corresponden a estos lisosomas mitocondriales colocalizados que representan la mitofagia en curso y, por lo tanto, se pueden contar para evaluar la extensión de la mitofagia. La preparación de una solución funcional de colorantes para la tinción de mitocondrias y lisosomas y el mantenimiento de la confluencia celular adecuada cuando se obtienen imágenes con microscopía confocal son pasos clave para recordar. Este procedimiento también se puede utilizar para analizar el número mitocondrial y la morfología, que es importante para evaluar la dinámica mitocondrial.La mitofagia está estrechamente asociada con una variedad de enfermedades humanas y esta técnica se puede utilizar para explorar la conexión entre la mitofagia y las enfermedades humanas.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Investigación

Biología

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

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Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

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Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

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Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

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Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o<em&gt; En Vivo</em

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The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...