Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Detta arbete finansierades delvis av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) och programmet för professor i särskild utnämning vid Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

1. Cellodling och passaging
OBS: Protokollet beskrivs med rutinmässigt odlade musembryonala fibroblaster (MEF) som ett exempel.
<ol><li>Odla MEF-celler i 10 cm cellodlingsskålar med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM). Inkubera vid 37 °C och 5%CO2 och övervaka cellerna i mikroskop med 100x förstoring.</li>
	<li>Utför rutinmässig cellpassage.<ol><li>När cellerna når 80%-90% sammanflöde (var 3: e dag), tvätta cellerna med 2 ml Dulbeccos fosfat...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utvärdera och övervaka den dynamiska processen med mitophagi i levande celler, som involverar autofagosomer, lysosomer och mitokondriell fission, genom samfärgning med cellpermeant mitokondrier och lysosomfärger. Metoden kan också användas för att identifiera mitokondrier och bedöma mitokondriell morfologi. Båda färgämnena som används i denna studie bör skyddas mot ljus, flera frys-tina cykler bör undvikas och färgämnena bör förvaras i alikvoter för e...

Mitokondrier är kraftverk för nästan alla eukaryota celler 1,2. Förutom ATP-produktion genom oxidativ fosforylering spelar mitokondrier en viktig roll i andra processer såsom bioenergetik, kalciumhomeostas, generering av fria radikaler, apoptos och cellulär homeostas 3,4,5. Eftersom mitokondrier genererar reaktiva syrearter (ROS) från flera komplex i elektrontransportkedjan stimuleras de ständigt av potentiell oxidativ stress, vilket så småningom kan leda till strukturella skador och dysfunktion när antioxidantförsvarssystemet kollapsar 6,7. Mitokondriell dysfunktion har visat sig bidra till många sjukdomar, inklusive metaboliska störningar, neurodegeneration och hjärt-kärlsjukdom8. Därför är det viktigt att upprätthålla friska mitokondriella populationer och deras korrekta funktion. Mitokondrier är mycket plastiska och dynamiska organeller; Deras morfologi och funktion styrs av mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer, inklusive post-translationella modifieringar (PTM) av mitokondriella proteiner, mitokondriell biogenes, fusion, fission och mitofagi 9,10. Mitokondriell fission medierad av dynaminrelaterat protein 1 (DRP1), ett GTPas av dynaminsuperfamiljen av proteiner, resulterar i små och runda mitokondrier och isolerar de dysfunktionella mitokondrierna, som kan rensas och brytas ned av mitophagy11,12.
Mitophagy är en cellulär process som selektivt bryter ner mitokondrier genom autofagi, som vanligtvis förekommer i skadade mitokondrier efter skada, åldrande eller stress. Därefter levereras dessa mitokondrier till lysosomer för nedbrytning10. Således är mitophagy en katabolisk process som hjälper till att upprätthålla kvantiteten och kvaliteten på mitokondrier i ett hälsosamt tillstånd i ett brett spektrum av celltyper. Det spelar en avgörande roll i återställandet av cellulär homeostas under normala fysiologiska och stressförhållanden13,14. Celler kännetecknas av en komplex mitophagimekanism, som induceras av olika signaler om cellulär stress och utvecklingsförändringar. Mitophagy regulatoriska vägar klassificeras som ubiquitinberoende eller receptorberoende15,16; den ubiquitinberoende autofagin förmedlas av kinaset PINK1 och rekryteringen av ubiquitinligasen Parkin E3 till mitokondrierna 17,18, medan receptorberoende autofagi involverar bindning av autofagireceptorer till den mikrotubuliassocierade proteinljuskedjan LC3 som förmedlar mitophagi som svar på mitokondriell skada19.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är den vanligaste metoden, och fortfarande en av de bästa metoderna, för att observera och upptäcka mitophagy20. De morfologiska egenskaperna hos mitophagi är autofagosomer eller autolysosomer bildade genom fusion av autofagosomer med lysosomer, vilket kan observeras från elektronmikroskopibilder21. Svagheten hos elektronmikroskopi (EM) är emellertid oförmågan att övervaka de dynamiska processerna för mitophagi, såsom mitokondriell depolarisering, mitokondriell fision och fusion av autofagosomer och lysosomer, i den levande cellen20. Således är utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller en attraktiv alternativ metod för mitokondriell forskning. Den levande cellavbildningstekniken som beskrivs här använder två fluorescerande färgämnen för att fläcka mitokondrier och lysosomer. När mitophagi inträffar färgas skadade eller överflödiga mitokondrier som uppslukas av autofagosomer gröna av mitokondriellt färgämne, medan det röda färgämnet fläckar lysosomerna. Fusionen av dessa autofagosomer och lysosomer, kallade autolysosomer, får den gröna och röda fluorescensen att överlappa varandra och manifesteras som gula prickar, vilket indikerar förekomsten av mitophagi22. Det cellpermeant mitokondrifärgämnet (MitoTracker Green) innehåller en milt tiolreaktiv klormetyldel för att märka mitokondrier23. För att märka mitokondrier inkuberas cellerna helt enkelt med färgämnet, som diffunderar passivt över plasmamembranet och ackumuleras i aktiva mitokondrier. Detta mitokondrifärgämne kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler. Lysosomfärgämnet (LysoTracker Red) är en fluorescerande acidotrop sond som används för att märka och spåra sura organeller i levande celler. Detta färgämne uppvisar en hög selektivitet för sura organeller och kan effektivt märka levande celler vid nanomolära koncentrationer24.
Förfarandena för användning av dessa fluorescerande färgämnen i levande celler, inklusive laddning av färgämnen och visualisering av mitokondrier och lysosomer, presenteras här. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Det kan också användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Mitokondrier, som är cellens kraftverk, spelar viktiga roller i bioenergetik, generering av fria radikaler, kalciumhomeostas och apoptos. Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll och studeras vanligtvis med mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy-analyser är svåra att utföra. Utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller är en alternativ och nödvändig metod för mitokondriell forskning. Detta protokoll beskriver procedurerna för användning av det cellpermenade grönfluorescerande mitokondrifärgämnet MitoTracker Green och det rödfluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red i levande celler, inklusive laddning av färgämnena, visualisering av mitokondrierna och lysosomen och förväntade resultat. Detaljerade steg för utvärdering av mitophagy i levande celler, samt tekniska anteckningar om mikroskopprogramvaruinställningar, tillhandahålls också. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Dessutom kan den användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.

MitoTracker Green är en grönfluorescerande mitokondriell fläck som exakt kan lokaliseras till mitokondrier. Färgämnet kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler (figur 2). Det röda fluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red kan märka och spåra sura lysosomala organeller och kan bara fläcka levande celler (figur 2). Konfokalmikroskopavbildning möjliggör visualisering av mitokondr...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll. Utvärderingen av mitophagy in vivo hindras emellertid av bristen på tillförlitliga kvantitativa analyser. Här presenteras ett protokoll för observation av mitophagy i levande celler med användning av ett cellpermeant grönfluorescerande mitokondrifärgämne och ett rött fluorescerande lysosomfärgämne.

Visualisering av mitofagi med fluorescerande färgämnen för mitokondrier och lysosom

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Denna metod hjälper till att observera mitophagy i levande celler med hjälp av en cell permeant grön-fluorescerande mitokondrier färgämne och ett rött fluorescerande lysosomfärgämne. Mitophagy spelar en viktig roll för att upprätthålla mitokondrier homeostas och olika aspekter av cellulär funktion. Denna teknik kan ge ett nytt tillvägagångssätt för behandling av mitokondrierrelaterade sjukdomar.Denna procedur är inte särskilt komplicerad. Att fånga tydliga bilder är mycket viktigt för att räkna överlagringen av mitokondrier och lysosomer. Till att börja med, odla mus embryonal fibroblast eller MEF-celler i en 10 centimeter cellodlingsskål med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium eller DMEM.Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid och övervaka cellerna under ett mikroskop vid 100X förstoring. När cellerna når 80 till 90% sammanflöde, tvätta dem med två milliliter Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning. Tillsätt sedan två milliliter 0,05% trypsin EDTA i en minut för att dissociera cellerna, följt av två milliliter DMEM för att stoppa reaktionen.Centrifugera cellsuspensionen vid 100 G i tre minuter och återsuspendera pelleten i en milliliter DMEM. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare och cellräkningskammarglas och inokulera 1,5 gånger 10 till de sjätte cellerna i en ny 10 centimeter cellodlingsskål som innehåller 10 ml DMEM. För mitophagianalysen, förbered en cellsuspension enligt beskrivningen och späd cellsuspensionen till en gånger 10 till den femte cellerna per milliliter färsk DMEM.Tillsätt två milliliter av den utspädda cellsuspensionen till en 20 millimeter konfokal skål och skaka skålen i ett kors. Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar. Förbered arbetslösningar av färgämnena genom att späda stamlösningarna.Tillsätt två mikroliter vardera av 0,2 millimolärt mitokondriellt färgämne och 50 mikromolärt lysosomfärgämne till två milliliter DMEM för att erhålla en arbetskoncentration av 0,2 mikromolärt mitokondriellt färgämne och 50 nanomolärt lysosomfärgämne. Ta bort mediet från konfokalodlingsskålen och tillsätt en milliliter av färgningslösningen för att täcka cellerna. Placera cellodlingsskålen vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 20 till 30 minuter.Ställ in parametrarna för den konfokala mikroskopiavbildningsprogramvaran. För dubbla excitationsbilder, använd sekventiell excitation vid 488 nanometer och 543 nanometer och samla in utsläpp vid 505 till 545 nanometer respektive mer än 560 nanometer. Ta bort odlingsmedieskålen som innehåller färgämnet från inkubatorn och tillsätt en milliliter Krebs-Henseleit- eller KH-buffert till skålen.För att inducera mitophagi, behandla cellerna med FCCP vid en mikromolar i KH-buffert i 10 minuter vid rumstemperatur och fortsätt omedelbart att avbilda cellerna med hjälp av konfokalmikroskopet. Applicera en lämplig mängd olja på toppen av 63X oljelinsen. Placera provet på provsteget i konfokalmikroskopet och flytta det direkt ovanför objektivlinsen.Använd bildprogramvaran för att hitta exemplet genom att klicka på fliken Hitta i det övre vänstra hörnet av programvarugränssnittet. Välj en grön filteruppsättning för experimentet. Använd den grova justeringsknappen för att snabbt fokusera genom att flytta objektivlinsen uppåt och nedåt.När cellprovet är tydligt synligt genom okularet, sök och fokusera området med enskilda celler och flytta det till mitten av synfältet. Klicka på fliken Förvärv i det övre vänstra hörnet av programvarugränssnittet för att hämta bilder. Välj endast 488 nanometerkanalen och bildruteupplösningen 1024 x 1024 för förhandsgranskning.Klicka på fliken Live i det övre vänstra hörnet för att starta en live-skanning. Justera synfältet till det skarpaste och justera lasereffekten genom att flytta skjutreglaget åt vänster eller höger. Håll förstärkningsinställningen under 600 för att undvika överexponering.Justera pinhålsvärdet till 156, få värde till 545 och digitalt förskjutningsvärde till noll. Välj det bästa synfältet, kontrollera de två kanalerna och välj bildupplösningen 1024 med 1024. Klicka på Fäst för att hämta 2D-bilder och spara de förvärvade bilderna.I denna studie användes FFCP för att utlösa mitophagi i MEF-celler för konfokal avbildning. Representativa bilder av celler färgade med det grönfluorescerande mitokondrifärgämnet som visar mitokondrier och färgade med det röda fluorescerande lysosomfärgämnet som visar lysosom visas här. När skadade grönfärgade mitokondrier uppslukas av rödfärgade lysosomer överlappar den gröna och röda fluorescensen för att avslöja gula samlokaliserade mitokondrier lysosomer.De gula prickarna motsvarar dessa samlokaliserade mitokondrilysosomer som representerar pågående mitophagi och kan därför räknas för att utvärdera omfattningen av mitophagi. Beredning av en arbetslösning av färgämnen för mitokondrier och lysosomfärgning och upprätthållande av lämplig cellsammanflöde vid avbildning med konfokalmikroskopi är viktiga steg att komma ihåg. Denna procedur kan också användas för att analysera mitokondriellt antal och morfologi vilket är viktigt för att bedöma mitokondriell dynamik.Mitophagy är nära associerad med en mängd olika mänskliga sjukdomar och denna teknik kan användas för att utforska sambandet mellan mitophagy och mänskliga sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualisera Live Drosophila Gliaceller-neuromuskulära förbindelsen med fluorescerande färger

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Visualisering Bakterier i Nematoder med fluorescensmikroskopi

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal avbildning av Single Mitochondrial Superoxid Blinkar i intakt hjärta eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide till Modern Kvantitativ Fluorescerande Western blotting med Felsökning Strategier

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Känsliga mätningar av Mitophagy av flödescytometri Flow och använda den pH-beroende fluorescerande Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Applicering av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell avbildning av trådformiga svampar

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...