Name: visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome
Uploaded: 2022-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970333,31901044) ve Şangay Yüksek Öğrenim Kurumlarında Özel Atama Profesörü Programı (GZ2020008) tarafından finanse edilmiştir.

1. Hücre kültürü ve pasaj
NOT: Protokol, örnek olarak rutin olarak kültürlenmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak tanımlanmıştır.
<ol><li>Kültür MEF hücreleri, 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile 10 cm hücre kültürü kaplarında. 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin ve hücreleri mikroskop altında 100x büyütmede izleyin.</li>
	<li>Rutin hücre geçişi gerçekleştirin.<ol><li>Hücreler% 80-90 akıcılığa ...

<ol>
	<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+mitochondria:+evolution,+function,+and+disease.">Animal mitochondria: evolution, function, and disease.</a> Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).</li><li>Henze, K., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+biology:+essence+of+mitochondria.">Evolutionary biology: essence of mitochondria.</a> Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).</li><li>Kiriyama, Y., Nochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+intercellular+quality+control+mechanisms+of+mitochondria.">Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria.</a> Cells. 7 (1), (2017).</li><li>Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+development+and+disease.">Mitochondrial function in development and disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).</li><li>Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+as+a+therapeutic+target.">Mitochondrial quality control as a therapeutic target.</a> Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).</li><li>Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+from+specific+mitochondrial+sites+under+different+bioenergetic+conditions.">Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).</li><li>Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+electron+transport+chain,+ROS+generation+and+uncoupling+(Review).">Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).</li><li>Murphy, M. P., Hartley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+a+therapeutic+target+for+common+pathologies.">Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).</li><li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+in+cardiomyocytes:+a+critical+role+in+the+progression+of+cardiovascular+diseases.">Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases.</a> Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission.">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics:+fission+and+fusion+in+fate+determination+of+mesenchymal+stem+cells.">Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).</li><li>Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+physiological+functions+of+mitophagy.">Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy.</a> The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).</li><li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitophagy+in+cellular+homeostasis,+physiology+and+pathology.">Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).</li><li>Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+and+independent+signals+in+selective+autophagy.">Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).</li><li>Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+receptor-dependent+mitophagy+pathways+and+their+implication+in+neurodegeneration.">Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PINK1+binding+to+the+TOM+complex+and+alternate+intracellular+membranes+in+recruitment+and+activation+of+the+E3+ligase+Parkin.">Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin.</a> Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+receptor+FUNDC1+regulates+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy.">Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).</li><li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+mechanisms,+pathophysiological+roles,+and+analysis.">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li><li>Parzych, K. R., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+autophagy:+morphology,+mechanism,+and+regulation.">An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).</li><li>Hasegawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome-lysosome+fusion+in+neurons+requires+INPP5E,+a+protein+associated+with+Joubert+syndrome.">Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome.</a> The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).</li><li>Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+Green+labeling+of+mitochondrial+proteins+and+their+subsequent+analysis+by+capillary+electrophoresis+with+laser-induced+fluorescence+detection.">MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.</a> Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+lysosomes+in+live+cells+with+LysoTracker.">Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance.">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Takemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mitophagy+using+LysoKK,+a+7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine+derivative.">Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative.</a> Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).</li><li>Maeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+live+imagers+MitoMM1/2+for+mitochondrial+visualization.">The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).</li><li>Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+promotes+the+stemness+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Sentelle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+targets+autophagosomes+to+mitochondria+and+induces+lethal+mitophagy.">Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy.</a> Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde otofagozomlar, lizozomlar ve mitokondriyal fisyonu içeren dinamik mitofaji sürecini, hücre perkastlı mitokondri ve lizozom boyaları ile birlikte boyama yoluyla değerlendirmek ve izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem ayrıca mitokondrileri tanımlamak ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan her iki boya da ışıktan korunmalı, çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalı ve boyalar mümkün ol...

Mitokondri, neredeyse tüm ökaryotik hücrelerin güç merkezleridir 1,2. Oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimine ek olarak, mitokondri biyoenerjetik kalsiyum homeostazı, serbest radikal üretimi, apoptoz ve hücresel homeostaz 3,4,5 gibi diğer süreçlerde hayati bir rol oynamaktadır. Mitokondri, elektron taşıma zincirindeki çoklu komplekslerden reaktif oksijen türleri (ROS) ürettiğinden, antioksidan savunma sistemi çöktüğünde yapısal hasara ve işlev bozukluğuna yol açabilecek potansiyel oksidatif stres tarafından sürekli olarak uyarılırlar 6,7. Mitokondriyal disfonksiyonun metabolik bozukluklar, nörodejenerasyon ve kardiyovasküler hastalık8 dahil olmak üzere birçok hastalığa katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu nedenle, sağlıklı mitokondriyal popülasyonları ve bunların uygun işlevlerini korumak çok önemlidir. Mitokondri oldukça plastik ve dinamik organellerdir; morfolojileri ve fonksiyonları, mitokondriyal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonları (PTM), mitokondriyal biyogenez, füzyon, fisyon ve mitofaji 9,10 dahil olmak üzere mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Proteinlerin dinamin süper ailesinin bir GTPazı olan dinamin ile ilişkili protein 1'in (DRP1) aracılık ettiği mitokondriyal fisyon, küçük ve yuvarlak mitokondri ile sonuçlanır ve mitofaji11,12 tarafından temizlenebilen ve parçalanabilen işlevsiz mitokondrileri izole eder.
Mitofaji, mitokondrileri otofaji ile seçici olarak bozan, genellikle yaralanma, yaşlanma veya stresten sonra hasarlı mitokondrilerde ortaya çıkan hücresel bir süreçtir. Daha sonra, bu mitokondriler bozulma10 için lizozomlara verilir. Bu nedenle, mitofaji, mitokondrinin miktarını ve kalitesini çok çeşitli hücre tiplerinde sağlıklı bir durumda tutmaya yardımcı olan katabolik bir süreçtir. Normal fizyolojik ve stres koşulları altında hücresel homeostazın restorasyonunda çok önemli bir rol oynar13,14. Hücreler, farklı hücresel stres sinyalleri ve gelişimsel değişiklikler tarafından indüklenen karmaşık bir mitofaji mekanizması ile karakterizedir. Mitopaji düzenleyici yolakları ubikitine bağımlı veya reseptöre bağımlı15,16 olarak sınıflandırılır; ubikitin bağımlı otofajiye kinaz PINK1 ve ubikitin ligaz Parkin E3'ün mitokondri17,18'e alınması aracılık ederken, reseptöre bağımlı otofaji, otofaji reseptörlerinin mitokondriyal hasara yanıt olarak mitofajiye aracılık eden mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir LC3'e bağlanmasını içerir19.
İletim elektron mikroskobu (TEM), mitofaji20'yi gözlemlemek ve tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemdir ve hala en iyi yöntemlerden biridir. Mitofajinin morfolojik özellikleri, otofagozomların lizozomlarla füzyonu ile oluşan otofagozomlar veya otolizozomlardır ve elektron mikroskobu görüntülerinden gözlemlenebilir21. Bununla birlikte, elektron mikroskobunun (EM) zayıflığı, mitokondriyal depolarizasyon, mitokondriyal fisyon ve otofagozomların ve lizozomların füzyonu gibi mitofajinin dinamik süreçlerini canlı hücre20'de izleyememektir. Bu nedenle, canlı organelleri görüntüleme yoluyla mitofajiyi değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için cazip bir alternatif yöntemdir. Burada açıklanan canlı hücre görüntüleme tekniği, mitokondri ve lizozomları boyamak için iki floresan boya kullanır. Mitofaji meydana geldiğinde, otofagozomlar tarafından yutulan hasarlı veya gereksiz mitokondri, mitokondriyal boya tarafından yeşile boyanırken, kırmızı boya lizozomları boyar. Otolizozomlar olarak adlandırılan bu otofagozomların ve lizozomların füzyonu, yeşil ve kırmızı floresanın üst üste binmesine ve sarı noktalar olarak tezahür etmesine neden olur, böylece mitofaji22'nin oluşumunu gösterir. Hücre perkastı mitokondri boyası (MitoTracker Green), mitokondri23'ü etiketlemek için hafif bir tiol-reaktif klorometil moiety içerir. Mitokondrileri etiketlemek için, hücreler plazma zarı boyunca pasif olarak yayılan ve aktif mitokondride biriken boya ile basitçe inkübe edilir. Bu mitokondri boyası canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir. Lizozom boyası (LysoTracker Red), canlı hücrelerdeki asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılan floresan asidotropik bir probdur. Bu boya, asidik organeller için yüksek bir seçicilik sergiler ve canlı hücreleri nanomolar konsantrasyonlarda etkili bir şekilde etiketleyebilir24.
Bu floresan boyaların, boyaların yüklenmesi ve mitokondri ve lizozomların görselleştirilmesi de dahil olmak üzere canlı hücrelerde kullanılması için prosedürler burada sunulmuştur. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>12-0005-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom cell culture dish (confocal dish)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J (Rasband, NIH)</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs&#8211;Henseleit(KHB) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1818430</td>
			<td>100 &#181;mol/L, red-fluorescent lysosome dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1842298</td>
			<td>200 &#181;mol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective (63x oil lens)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>Cat# 25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEISS LSM 880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>ZEN 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome

Hücrenin güç merkezleri olan mitokondri, biyoenerjetik çalışmalarda, serbest radikal oluşumunda, kalsiyum homeostazında ve apoptozda önemli roller oynamaktadır. Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolün birincil mekanizmasıdır ve genellikle mikroskobik gözlem kullanılarak incelenir, ancak in vivo mitofi tahlillerinin yapılması zordur. Mitofajiyi canlı organelleri görüntüleyerek değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için alternatif ve gerekli bir yöntemdir. Bu protokol, boyaların yüklenmesi, mitokondri ve lizozomun görselleştirilmesi ve beklenen sonuçlar dahil olmak üzere, hücre perkastı yeşil floresan mitokondri boyası MitoTracker Green ve kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red'in canlı hücrelerde kullanılmasına ilişkin prosedürleri açıklar. Canlı hücrelerde mitofajinin değerlendirilmesi için ayrıntılı adımlar ve mikroskop yazılım ayarları hakkında teknik notlar da sağlanmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Ek olarak, mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için kullanılabilir.

MitoTracker Green, mitokondriye doğru bir şekilde lokalize olabilen yeşil floresan mitokondriyal bir lekedir. Boya, canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir (Şekil 2). Kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red, asidik lizozomal organelleri etiketleyebilir ve izleyebilir ve sadece canlı hücreleri lekeleyebilir (Şekil 2). Konfokal mikroskop görüntüleme, uygun boya...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome at JoVE.com

Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome

Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Mitokondri ve Lizozom için Floresan Boyalarla Mitopajinin Görselleştirilmesi

Mitochondria, being the powerhouses of the cell, play important roles in bioenergetics, free radical generation, calcium homeostasis, and apoptosis. ...

Bu yöntem, bir hücre perkastı yeşil-floresan mitokondri boyası ve bir kırmızı-floresan lizozom boyası kullanarak canlı hücrelerde mitofajiyi gözlemlemeye yardımcı olur. Mitofaji, mitokondri homeostazının ve hücresel fonksiyonun çeşitli yönlerinin korunmasında önemli bir rol oynar. Bu teknik, mitokondri ile ilişkili hastalıkların tedavisinde yeni bir yaklaşım sağlayabilir.Bu prosedür çok karmaşık değildir. Net görüntüler yakalamak, mitokondri ve lizozomların bindirmesini saymak için çok önemlidir. Başlamak için, kültür faresi embriyonik fibroblast veya MEF hücreleri, 10 mililitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM içeren 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabında.37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve hücreleri mikroskop altında 100X büyütmede izleyin. Hücreler% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, bunları iki mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın. Daha sonra hücreleri ayırmak için bir dakika boyunca iki mililitre% 0.05 tripsin EDTA, ardından reaksiyonu durdurmak için iki mililitre DMEM ekleyin.Hücre süspansiyonunu 100 G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı ve hücre sayma odası slaytları kullanarak hücreleri sayın ve 10 mililitre DMEM içeren yeni bir 10 santimetre hücre kültürü kabına altıncı hücrelere 1,5 kez 10 kez aşılayın. Mitofaji testi için, tarif edildiği gibi bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre süspansiyonunu, taze DMEM'in mililitresi başına bir kez 10 ila beşinci hücrelere seyreltin.Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun iki mililitresini 20 milimetrelik bir konfokal kaba ekleyin ve çanağı bir haç içinde sallayın. 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Stok çözeltilerini seyrelterek boyaların çalışma çözeltilerini hazırlayın.0.2 mikromolar mitokondriyal boya ve 50 nanomolar lizozom boyası çalışma konsantrasyonu elde etmek için iki mililitre DMEM'e her biri 0.2 milimolar mitokondriyal boya ve 50 mikromolar lizozom boyası ekleyin. Ortamı konfokal kültür kabından çıkarın ve hücreleri örtmek için bir mililitre boyama çözeltisi ekleyin. Hücre kültürü kabını 20 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin.Konfokal mikroskopi görüntüleme yazılımının parametrelerini ayarlayın. Çift uyarma görüntüleri için, 488 nanometre ve 543 nanometrede sıralı uyarma kullanın ve sırasıyla 505 ila 545 nanometre ve 560 nanometreden daha büyük emisyonları toplayın. Boyayı içeren kültür orta kabını inkübatörden çıkarın ve kaba bir mililitre Krebs-Henseleit veya KH tamponu ekleyin.Mitofajiyi indüklemek için, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca KH tamponunda bir mikromolar'da FCCP ile tedavi edin ve hemen konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemeye devam edin. 63X yağlı lensin üst kısmına uygun miktarda yağ uygulayın. Numuneyi konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin ve doğrudan objektif lensin üzerine taşıyın.Yazılım arabiriminin sol üst köşesindeki Bul sekmesine tıklayarak örneği bulmak için görüntüleme yazılımını kullanın. Deneme için yeşil bir filtre kümesi seçin. Objektif lensi yukarı ve aşağı hareket ettirerek hızlı bir şekilde odaklanmak için kaba ayar düğmesini kullanın.Hücre örneği göz merceğinden açıkça görülebildikten sonra, tek hücrelerin alanını arayın ve odaklayın ve görüş alanının merkezine taşıyın. Görüntüleri almak için yazılım arayüzünün sol üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Önizleme için yalnızca 488 nanometre kanalı ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin.Canlı bir tarama başlatmak için sol üst köşedeki Canlı sekmesine tıklayın. Görüş alanını en keskin olana ayarlayın ve kaydırıcıyı sola veya sağa hareket ettirerek lazer gücünü ayarlayın. Aşırı pozlamayı önlemek için kazanç ayarını 600'ün altında tutun.İğne deliği değerini 156, kazanç değerini 545 ve dijital ofset değerini sıfır olarak ayarlayın. En iyi görüş alanını seçin, iki kanalı kontrol edin ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin. 2B görüntüleri almak ve elde edilen görüntüleri kaydetmek için Tuttur'u tıklatın.Bu çalışmada, konfokal görüntüleme için MEF hücrelerinde mitofajiyi tetiklemek için FFCP kullanıldı. Mitokondri gösteren yeşil floresan mitokondri boyası ile boyanmış ve lizozom gösteren kırmızı-floresan lizozom boyası ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Hasarlı yeşil lekeli mitokondri kırmızı lekeli lizozomlar tarafından yutulduğunda, yeşil ve kırmızı floresan sarı birlikte lokalize mitokondri lizozomlarını ortaya çıkarmak için üst üste biner.Sarı noktalar, devam eden mitofajiyi temsil eden bu birlikte lokalize mitokondri lizozomlarına karşılık gelir ve bu nedenle mitofajinin derecesini değerlendirmek için sayılabilir. Mitokondri ve lizozom boyama için çalışan bir boya çözeltisinin hazırlanması ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme sırasında uygun hücre akıcılığının korunması, hatırlanması gereken önemli adımlardır. Bu prosedür, mitokondriyal dinamikleri değerlendirmek için önemli olan mitokondriyal sayı ve morfolojiyi analiz etmek için de kullanılabilir.Mitofaji, çeşitli insan hastalıkları ile yakından ilişkilidir ve bu teknik, mitofaji ve insan hastalıkları arasındaki bağlantıyı araştırmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Tek Mitokondriyal süperoksit Bozulmamış Kalp Flaşlar veya konfokal Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...