Name: three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00
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阿科斯塔博士得到了美国国立卫生研究院拨款CA148724和TL1TR002647的支持。Gonzalez Porras博士得到了美国国立卫生研究院国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所的支持，奖励号为F32-0DK122754。这项工作得到了美国国立卫生研究院（5SC1DK122578）和德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物医学工程系的部分支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。数字部分是用 Biorender.com 创建的。

本研究是根据《动物福利法》和《动物福利实施条例》根据《实验动物护理和使用指南》的原则进行的。所有动物程序均由德克萨斯大学圣安东尼奥分校的机构动物护理和使用委员会批准。
注意：对于下面描述的步骤，使用雄性刘易斯大鼠。必须对雌性以及小鼠微血管片段（MVF）收集进行轻微的方案调整29。对于使用人MVF（h-MVF）的方案，唯一需要的步骤是?...

棕色/米色脂肪组织工程领域在很大程度上尚未成熟22，23，24，25，26，27，28，大部分脂肪模型正在开发用于白色脂肪组织8，22，31.工程棕色/米色微组?...

该协议的目标是描述一种从单一的，潜在的自体来源微血管碎片（MVF）开发血管化米色脂肪组织的方法。棕色和米色脂肪组织已被证明具有与代谢调节相关的有益特性;然而，成人中这些脂肪组织库的小体积限制了对全身代谢的潜在影响，特别是在肥胖或2型糖尿病等疾病条件下1，2，3，4，5，6，7。棕色/米色脂肪作为预防与肥胖及其合并症相关的有害代谢作用的治疗靶点引起了浓厚的兴趣8，9，10，11，12。
MVF是可以直接从脂肪组织中分离，培养并以三维结构长时间保持的血管结构13，14，15。我们小组和其他小组以前的工作已经开始利用MVF的多细胞和多能能力，特别是因为它与脂肪组织形成有关16，17，18。作为这项工作的积累，我们最近证明，来自健康和2型糖尿病19的啮齿动物模型以及来自人类受试者（50岁以上的成年人）20的MVF含有能够被诱导形成产热或米色脂肪组织的细胞。
这是一种利用单一来源MVF的创新方法，不仅能够创建米色脂肪组织，而且还能够创建其相关和关键的血管成分21。该技术的使用对于寻找一种直接的组织工程方法来形成产热脂肪组织的研究可能具有重要价值。与有志于设计米色脂肪组织22，23，24，25，26，27，28的其他方法不同，本研究中描述的过程不需要使用多种细胞类型或复杂的诱导方案。可以使用源自啮齿动物和人类来源的MVF创建血管化的米色和白色脂肪模型，显示出巨大的翻译潜力。该方案的最终产品是一种工程米色产热脂肪组织，其结构和代谢功能与棕色脂肪组织相当。总体而言，该协议提出了这样一种想法，即易于访问且可能自体来源MVF可能是一种有价值的治疗干预和研究代谢紊乱的工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-Tipped Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-172</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>126575-10GM</td>
			<td>Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9633623</td>
			<td>Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC230302500</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable underpads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td>For fluid absorption during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16140089</td>
			<td>Added in DMEM to 20% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630-25G</td>
			<td>Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask, 250 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500250</td>
			<td>Allows for digestion of fat using a large surface area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-264-21</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MVF</td>
			<td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td>
			<td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td>
			<td>Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5523</td>
			<td>Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9023832</td>
			<td>Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Added in DMEM to 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>351029</td>
			<td>3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens &#38; 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 &#181;M screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>For counting fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td>Diluted to 1x with sterile deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC0854141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>R0106200MG</td>
			<td>Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen&#160; 37 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222R</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen 500 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222F</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated Hemostat</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-171</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>6051601KU</td>
			<td>Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid hormone (T3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 
			https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td>
			<td>Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments

工程产热脂肪组织（例如，米色或棕色脂肪组织）已被研究为代谢疾病的潜在疗法或用于健康筛查和药物测试的个性化微组织设计。目前的策略通常相当复杂，无法准确完全描述产热脂肪组织的多细胞和功能特性。微血管碎片是由从脂肪组织中分离的小动脉、小静脉和毛细血管组成的完整小血管，作为细胞的单一自体来源，可实现血管化和脂肪组织形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以便能够从微血管碎片中生成三维、血管化和功能性产热脂肪组织，包括从脂肪组织和培养条件中分离微血管碎片的方案。此外，还讨论了最佳实践，以及表征工程组织的技术，并提供了啮齿动物和人类微血管碎片的样品结果。这种方法有可能用于理解和开发肥胖和代谢疾病的治疗方法。

米色/棕色脂肪组织有几个关键的表型形态特征：它是多房/含有小脂滴，具有大量的线粒体（这是其在 体内特征性“褐色”外观的原因），相应地具有高耗氧率/线粒体生物能量，高度血管化，脂肪分解/胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，以及最臭名昭著的， 表达高水平的解偶联蛋白 1 （UCP1），这是一种参与产热呼吸的线粒体蛋白19，30。
<p class="...

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Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

在这里，我们提出了一个详细的方案，概述了使用从啮齿动物或人类脂肪组织中分离的微血管碎片作为设计功能性，血管化米色脂肪组织的直接方法。

微血管碎片血管化产热脂肪组织的三维培养

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

该协议描述了从微血管片段或MVF生成三维血管化和功能性产热脂肪。 目前用于工程产热脂肪组织的策略很复杂，不能完全描述其多细胞和功能特性。MVF是使血管化和脂肪组织形成的单一细胞来源。作为一种简单的单一来源方法，可以创建米色脂肪的生物仿制品，MVF在促进肥胖和代谢疾病治疗的理解或开发方面具有巨大潜力。将用70%乙醇处理的适当剃光和安乐死的动物置于仰卧位，并开始分离腹股沟脂肪。用一把剪刀抬起阴茎下方的皮肤并进行切口，从中心开始横向切割，形成V形，然后循环到动物的背部以进入整个脂肪沉积物。切割时，通过切割相互连接的筋膜组织来确保皮肤与脂肪分离。一旦筋膜被适当切割，确保两侧的腹股沟脂肪，从腹股沟延伸到背部，是可见的。接下来，在单独的锥形管中去除两侧的脂肪，该锥形管含有 10 毫升 PBS 中的 BSA，浓度为每毫升 1 毫克。要收获附睾脂肪，请切开腹部皮肤，然后小心地切开睾丸周围的薄层。用镊子轻轻拉动脂肪组织，然后用剪刀剪掉，同时避免解剖任何主要的可见血管。现在，将去除的脂肪放入 50 毫升锥形管中，其中含有 10 毫升每毫升 1 毫克 BSA 的 PBS。为了隔离后皮下脂肪，将老鼠俯卧转并用大剪刀将背部的厚皮一直剪到头皮，注意不要切得太深。切开连接皮肤和组织的筋膜。在分离皮下脂肪并将其放入含有 10 毫升每毫升 BSA 的 50 毫升锥形管中之前，将位于肩胛内区域的皮下脂肪与靠近脊柱的棕色脂肪区分开来。在生物罩内工作时，使用镊子将切除的脂肪放入标准的 100 毫升培养皿中，培养皿中含有 0.5 毫升每毫升 1 毫克 BSA 的 PBS。从脂肪中去除任何可见的血管、肌肉或外来组织。用剪刀将脂肪切碎 10 分钟，并通过添加更多 BSA 来检查结块。如有必要，继续切碎，然后用10毫升移液管将切碎的脂肪悬浮液转移到无菌250毫升烧瓶中。通过在PBS中添加足够的BSA，使烧瓶中的体积达到20毫升。现在将PBS中的BSA添加到胶原酶中，并通过轻轻摇动溶液来均质化溶液，然后通过0.22微米尼龙网过滤器将其无菌过滤。立即将所需量的胶原酶溶液加入切碎的脂肪悬浮液中，并通过在37摄氏度的水浴中以圆周运动摇动烧瓶来消化脂肪。将消化的脂肪转移到标有消化脂肪或碎脂肪的50毫升锥形管中。将试管以 400 G 离心四分钟，将微血管碎片或 MVF 旋转成红色沉淀。轻轻地将上清液倒入标记废物的50毫升锥形管中，而不会干扰沉淀。接下来，将10毫升每毫升BSA中的PBS中加入10毫升1毫克，并通过轻轻上下移液两次来混合沉淀悬浮液而不会破坏碎片。现在，将预先浸泡在无菌培养皿中的500微米屏幕，该培养皿含有PBS中每毫升BSA中的5毫升1毫克，并将其放在保存在新培养皿上的塑料筛网支架上。将10毫升悬浮液从消化的颗粒管中移液到同心圆的屏幕上。在PBS中用每毫升1毫克BSA的额外五毫升洗涤过滤器并将其丢弃，同时将滤液保留在培养皿内。然后将预先浸泡的37微米屏幕放在新的培养皿上的塑料屏幕支架上方。使用新鲜移液管，将滤液从第一次过滤中以同心圆转移到筛网上。如前所述，在PBS中用BSA清洗筛网，这次，丢弃滤液，同时保留37微米筛网。将 37 微米的屏幕滑入一个新的培养皿中，培养皿中含有 PBS 中每毫升 1 毫克 BSA 的 5 毫升。通过将培养皿轻轻敲打在锥形支架上来移开碎片，不要溢出任何液体。用PBS中的另外五毫升BSA冲洗过滤器。接下来，将液体从培养皿转移到无菌的50毫升锥形管中。再冲洗37微米的屏幕几次，将洗涤液加入锥形管中，直到收集的总体积为15至20毫升。最后一次冲洗后丢弃屏幕。用剪刀剪断 20 微升移液器吸头的末端。轻轻摇动含有液体的试管，然后使用切开的移液器吸头抽取两个 20 微升的等分试样，并将每个等分试样移液到干净的 35 毫米培养皿中。使用标准光学显微镜计算每个培养皿中样品中的片段数，并使用手稿中提到的公式，获得分离的微血管片段总数。将剩余的液体在 50 毫升锥形管中以 400 G 旋转四分钟以收集 MVF。旋转后，从锥形管中倒出大部分上清液，并使用移液管除去管边缘残留的少量液体。接下来，将凝血酶添加到指定用于灌制凝胶的孔中。切开 200 微升移液器吸头的末端，并使用它，轻轻地将 MVF 重悬于纤维蛋白原中，以获得所需的最终密度。将悬浮液移入孔中的凝血酶溶液中，并通过上下移液快速均质混合物。灌制所有凝胶后，将孔板置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中约15分钟，以使凝胶交联。以BODIPY为脂质染色剂，通过水凝胶的共聚焦显微镜成像观察脂质和分化的脂肪细胞。使用白色脂肪或米色脂肪培养基培养非血管化脂肪组织，分别由瘦和糖尿病啮齿动物衍生的MVF形成非血管化的白色或米色脂肪组织。同样，使用白色脂肪或米色脂肪培养基培养血管化脂肪组织导致啮齿动物来源的MVF分别形成血管化的白色或米色脂肪组织。 通过共聚焦显微镜也观察到从人类MVF获得的非血管化白色和米色脂肪组织。使用RT-qPCR对MVF分化为米色脂肪组织的能力进行了遗传证实。 暴露于直接白色脂肪或米色脂肪培养基的瘦和糖尿病啮齿动物MVF评估了脂肪生成，产热和血管生成。正如预期的那样，解偶联蛋白1在米色脂肪组织中的表达显着更高。在暴露于间接白色脂肪或米色脂肪培养基的啮齿动物MVF以及暴露于直接白色脂肪或米色致脂介质的人类MVF中也观察到了类似的趋势。最后，从线粒体生物能量学来看，很明显，在功能上，米色脂肪组织在所有情况下都具有较高的耗氧率或OCR水平。应优化脂肪组织的酶消化，以一致地再现相似大小和质量的MVF。消化后，MVF应轻柔处理，特别注意避免片段进一步破碎。该技术有助于进一步平衡血管生长和脂肪细胞分化，证明这取决于引入的因素。

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