Name: three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments at JoVE.com

Le Dr Acosta est soutenu par les subventions CA148724 et TL1TR002647 des National Institutes of Health. Le Dr Gonzalez Porras est soutenu par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales des National Institutes of Health, sous le numéro d’attribution F32-0DK122754. Ce travail a été soutenu, en partie, par les National Institutes of Health (5SC1DK122578) et le département de génie biomédical de l’Université du Texas à San Antonio. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. Les figures ont été partiellement créées avec Biorender.com.

Cette étude a été menée conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et au Règlement d’application sur le bien-être des animaux conformément aux principes du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Texas à San Antonio.
NOTE: Pour les étapes décrites ci-dessous, des rats Lewis mâles sont utili...

Le domaine de l’ingénierie du tissu adipeux brun/beige est largement immature 22,23,24,25,26,27,28, la majeure partie des modèles adipeux étant développés pour le tissu adipeux blanc 8,22,31....

L’objectif de ce protocole est de décrire une approche pour développer du tissu adipeux beige vascularisé à partir d’une source unique, potentiellement autologue, le fragment microvasculaire (MVF). Il a été démontré que les tissus adipeux bruns et beiges présentent des propriétés bénéfiques liées à la régulation métabolique; Cependant, le faible volume de ces dépôts de tissu adipeux chez les adultes limite l’impact potentiel sur le métabolisme systémique, en particulier dans les maladies telles que l’obésité ou le diabète de type 2 1,2,3,4,5,6,7. La graisse brune/beige suscite un intérêt considérable en tant que cible thérapeutique pour prévenir les effets métaboliques nocifs liés à l’obésité et à ses comorbidités 8,9,10,11,12.
Les MVF sont des structures de vaisseaux qui peuvent être directement isolées du tissu adipeux, cultivées et maintenues dans une configuration tridimensionnelle pendant de longues périodesde temps 13,14,15. Des travaux antérieurs de notre groupe, et d’autres, ont commencé à exploiter la capacité multicellulaire et multipotente des MVF, en particulier en ce qui concerne la formation de tissu adipeux16,17,18. Dans le prolongement de ces travaux, nous avons récemment démontré que les MVF dérivés de modèles de rongeurs de diabète sain et de type 219 et de sujets humains (adultes de plus de 50 ans)20 contenaient des cellules capables d’être induites à former du tissu adipeux thermogénique ou beige.
Il s’agit d’une approche innovante à partir de laquelle une source unique de MVF est utilisée, non seulement capable de créer du tissu adipeux beige, mais aussi son composant vasculaire associéet critique 21. L’utilisation de cette technique pourrait être d’une grande valeur pour les études à la recherche d’une approche simple d’ingénierie tissulaire pour la formation de tissu adipeux thermogénique. Contrairement à d’autres méthodes aspirant à concevoir du tissu adipeux beige 22,23,24,25,26,27,28, le processus décrit dans cette étude ne nécessite pas l’utilisation de plusieurs types de cellules ou de régimes d’induction complexes. Des modèles de graisse beige et blanche vascularisés peuvent être créés avec des MVF provenant de rongeurs et de sources humaines, démontrant un grand potentiel de traduction. Le produit final de ce protocole est un tissu adipeux thermogénique beige modifié avec une structure et une fonction métabolique comparables au tissu adipeux brun. Dans l’ensemble, ce protocole présente l’idée qu’une source facilement accessible et éventuellement autologue MVF peut être une intervention thérapeutique utile et un outil pour étudier les troubles métaboliques.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-Tipped Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-172</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>126575-10GM</td>
			<td>Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9633623</td>
			<td>Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC230302500</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable underpads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td>For fluid absorption during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16140089</td>
			<td>Added in DMEM to 20% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630-25G</td>
			<td>Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask, 250 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500250</td>
			<td>Allows for digestion of fat using a large surface area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-264-21</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MVF</td>
			<td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td>
			<td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td>
			<td>Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5523</td>
			<td>Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9023832</td>
			<td>Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Added in DMEM to 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>351029</td>
			<td>3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens &#38; 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 &#181;M screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>For counting fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td>Diluted to 1x with sterile deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC0854141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>R0106200MG</td>
			<td>Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen&#160; 37 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222R</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen 500 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222F</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated Hemostat</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-171</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>6051601KU</td>
			<td>Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid hormone (T3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 
			https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td>
			<td>Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments

L’ingénierie du tissu adipeux thermogénique (p. ex. tissus adipeux beiges ou bruns) a été étudiée comme traitement potentiel pour les maladies métaboliques ou pour la conception de microtissus personnalisés pour le dépistage médical et les tests de drogues. Les stratégies actuelles sont souvent assez complexes et ne parviennent pas à décrire avec précision les propriétés multicellulaires et fonctionnelles du tissu adipeux thermogénique. Les fragments microvasculaires, petits microvaisseaux intacts composés d’artériole, de veinules et de capillaires isolés du tissu adipeux, constituent une source autologue unique de cellules qui permettent la vascularisation et la formation de tissu adipeux. Cet article décrit les méthodes d’optimisation des conditions de culture pour permettre la génération de tissus adipeux thermogéniques tridimensionnels, vascularisés et fonctionnels à partir de fragments microvasculaires, y compris les protocoles d’isolement des fragments microvasculaires du tissu adipeux et des conditions de culture. De plus, les meilleures pratiques sont discutées, de même que les techniques de caractérisation des tissus modifiés, et les résultats d’échantillons provenant de fragments microvasculaires de rongeurs et humains sont fournis. Cette approche a le potentiel d’être utilisée pour la compréhension et le développement de traitements pour l’obésité et les maladies métaboliques.

Il existe quelques caractéristiques morphologiques phénotypiques clés du tissu adipeux beige / brun: il est multioculaire / contient de petites gouttelettes lipidiques, possède un grand nombre de mitochondries (la raison de son apparence caractéristique « brunâtre » in vivo), a donc un taux élevé de consommation d’oxygène / bioénergétique mitochondriale, est fortement vascularisé, a augmenté l’absorption de glucose stimulée par la lipolyse / l’insuline et, plus notoirement, exprime des n...

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Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Ici, nous présentons un protocole détaillé décrivant l’utilisation de fragments microvasculaires isolés à partir de rongeurs ou de tissus adipeux humains comme une approche simple pour concevoir un tissu adipeux beige vascularisé fonctionnel.

Culture tridimensionnelle de tissu adipeux thermogénique vascularisé à partir de fragments microvasculaires

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Ce protocole décrit la génération de graisse thermogénique tridimensionnelle vascularisée et fonctionnelle à partir de fragments microvasculaires, ou MVF. Les stratégies actuelles d’ingénierie du tissu adipeux thermogénique sont complexes et ne décrivent pas pleinement ses propriétés multicellulaires et fonctionnelles. Les MVF sont une source unique de cellules qui permettent la vascularisation et la formation de tissu adipeux.Étant une méthode simple à source unique pour créer des imitations biologiques de graisse beige, les MVF ont un potentiel important pour promouvoir la compréhension ou le développement de traitements pour l’obésité et les maladies métaboliques. Placer l’animal convenablement rasé et euthanasié traité avec de l’éthanol à 70 % en décubitus dorsal et commencer l’isolement de la graisse inguinale. Soulevez la peau sous le pénis avec une paire de ciseaux et effectuez l’incision, en commençant par le centre et en coupant latéralement, formant une forme de V, avant de boucler sur le dos de l’animal pour accéder à l’ensemble du dépôt de graisse.Pendant la coupe, assurez-vous de séparer la peau de la graisse en coupant le tissu fascia interconnecté. Une fois que le fascia est correctement coupé, assurez-vous que la graisse inguinale des deux côtés, s’étendant de l’aine vers l’arrière, est visible. Ensuite, retirez la graisse des deux côtés dans des tubes coniques séparés contenant 10 millilitres de BSA dans du PBS, ayant une concentration d’un milligramme par millilitre.Pour récolter la graisse épididymaire, coupez à travers la peau abdominale, puis coupez soigneusement à travers la fine couche entourant les testicules. Tirez doucement le tissu adipeux à l’aide d’une pince et découpez-le à l’aide de ciseaux, tout en évitant la dissection des principaux vaisseaux sanguins visibles. Maintenant, placez la graisse retirée dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’un milligramme par millilitre BSA dans PBS.Pour isoler la graisse sous-cutanée postérieure, tournez le rat couché et utilisez de grands ciseaux pour couper la peau épaisse du dos jusqu’au cuir chevelu, en prenant soin de ne pas couper trop profondément sous la peau. Coupez le fascia reliant la peau au tissu. Différencier la graisse sous-cutanée, située dans la région intrascapulaire, de la graisse brune située plus près de la colonne vertébrale avant d’isoler et de placer la graisse sous-cutanée dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS.Lorsque vous travaillez à l’intérieur d’un biohood, utilisez des pinces pour placer la graisse excisée dans une boîte de Petri standard de 100 millilitres contenant 0,5 millilitre d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS. Enlevez tous les vaisseaux sanguins visibles, les muscles ou les tissus étrangers de la graisse. À l’aide de ciseaux, hachez la graisse pendant 10 minutes et vérifiez s’il y a des grumeaux en ajoutant un peu plus de BSA.Poursuivre le hachage, si nécessaire, avant de transférer la suspension de graisse hachée dans une fiole stérile de 250 millilitres à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Augmenter le volume dans la fiole jusqu’à 20 millilitres en ajoutant suffisamment de BSA dans le PBS. Maintenant, ajoutez du BSA dans du PBS à la collagénase et homogénéisez la solution en la secouant doucement avant de la filtrer stérile à travers un filet en nylon de 0,22 micron.Ajouter immédiatement la quantité requise de solution de collagénase à la suspension de graisse hachée et digérer la graisse en agitant la fiole dans un mouvement circulaire dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée. Transférez la graisse digérée dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté graisse digérée ou graisse hachée. Centrifuger le tube à 400 G pendant quatre minutes pour faire tourner les fragments microvasculaires, ou MVF, en une pastille rouge.Décanter doucement le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté déchets sans déranger le granulé. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS au tube contenant la pastille et mélangez la suspension de granulés en la pipetant doucement de haut en bas deux fois sans perturber les fragments. Maintenant, prenez l’écran de 500 microns pré-trempé dans une boîte de Petri stérile contenant cinq millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS et placez-le sur le support d’écran en plastique conservé sur une nouvelle boîte de Pétri.Pipeter 10 millilitres de suspension du tube de granulés digérés sur l’écran en cercles concentriques. Lavez le filtre avec cinq millilitres supplémentaires d’un milligramme par millilitre de BSA dans du PBS et jetez-le, tout en conservant le filtrat à l’intérieur de la boîte de Pétri. Placez ensuite l’écran pré-trempé de 37 microns au-dessus du support d’écran en plastique sur une nouvelle boîte de Pétri.À l’aide d’une pipette fraîche, transférer le filtrat de la première filtration sur l’écran en cercles concentriques. Comme décrit précédemment, lavez l’écran avec BSA dans PBS, et cette fois, jetez le filtrat tout en conservant l’écran de 37 microns. Faites glisser l’écran de 37 microns dans une nouvelle boîte de Petri contenant cinq millilitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans PBS.Délogez les fragments en tapotant doucement le plat contre un support conique, sans renverser de liquide. Rincez le filtre avec cinq millilitres supplémentaires de BSA dans PBS. Ensuite, transférez le liquide de la boîte de Petri dans un tube conique stérile de 50 millilitres.Rincez l’écran de 37 microns plusieurs fois, en ajoutant le lavage au tube conique jusqu’à ce que le volume total recueilli soit de 15 à 20 millilitres. Jetez l’écran après le rinçage final. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 20 microlitres à l’aide de ciseaux.Secouez doucement le tube contenant le liquide avant d’aspirer deux aliquotes de 20 microlitres à l’aide de l’embout coupé de la pipette et de pipeter chacune des aliquotes dans une boîte de Petri propre de 35 millimètres. Compter le nombre de fragments dans l’échantillon de chaque boîte de Petri à l’aide d’un microscope optique standard et, en utilisant la formule mentionnée dans le manuscrit, obtenir le nombre total de fragments microvasculaires isolés. Faites tourner le liquide restant dans le tube conique de 50 millilitres à 400 g pendant quatre minutes pour recueillir le MVF.Après l’essorage, décanter la majeure partie du surnageant du tube conique et utiliser une pipette pour enlever le petit volume de liquide restant sur le bord du tube. Ensuite, ajoutez de la thrombine dans les puits désignés pour les gels de coulée. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres et, en l’utilisant, remettez doucement en suspension les MVF dans le fibrinogène pour obtenir la densité finale souhaitée.Pipeter la suspension dans la solution de thrombine dans le puits et homogénéiser rapidement le mélange en pipetant de haut en bas. Une fois que tous les gels sont coulés, placez la plaque de puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant environ 15 minutes pour permettre la réticulation du gel. Les lipides et les adipocytes différenciés ont été observés par imagerie par microscopie confocale des hydrogels en utilisant BODIPY comme coloration lipidique.La culture de tissu adipeux non vascularisé à l’aide de milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges a entraîné la formation de tissu adipeux blanc ou beige non vascularisé, respectivement, à partir de MVF maigres et diabétiques dérivés de rongeurs. De même, la culture de tissu adipeux vascularisé à l’aide de milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges a entraîné la formation de tissu adipeux blanc ou beige vascularisé, respectivement, à partir des MVF dérivés de rongeurs. Des tissus adipeux blancs et beiges non vascularisés obtenus à partir de MVF humains ont également été observés par microscopie confocale.La capacité des MVF à se différencier en tissu adipeux beige a été génétiquement confirmée à l’aide de la RT-qPCR. Les MVF de rongeurs maigres et diabétiques exposés à des milieux adipogènes blancs directs ou adipogènes beiges ont été évalués pour l’adipogenèse, la thermogenèse et l’angiogenèse. L’expression de la protéine de découplage 1, comme prévu, était significativement plus élevée dans le tissu adipogène beige.Une tendance similaire a été observée chez les MVF de rongeurs exposés à des milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges indirects, ainsi que chez les MVF humains exposés à des milieux adipogènes blancs ou adipogènes beiges directs. Enfin, d’après la bioénergétique mitochondriale, il était évident que fonctionnellement, le tissu adipeux beige avait un taux de consommation d’oxygène (OCR) caractéristique plus élevé dans tous les cas. La digestion enzymatique du tissu adipeux doit être optimisée pour reproduire systématiquement des MVF de taille et de qualité similaires.Après la digestion, les MVF doivent être manipulés avec douceur, avec un soin particulier pour éviter une nouvelle rupture des fragments. Cette technique a contribué à renforcer l’équilibre entre la croissance des vaisseaux et la différenciation des adipocytes qui s’est avérée dépendante des facteurs introduits.

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