Name: three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments at JoVE.com

Il Dr. Acosta è supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. Il Dr. Gonzalez Porras è supportato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del National Institutes of Health, con il numero di premio F32-0DK122754. Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal National Institutes of Health (5SC1DK122578) e dall'Università del Texas presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica di San Antonio. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.

Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas a San Antonio.
NOTA: Per i passaggi descritti di seguito, vengono utilizzati ratti Lewis maschi. Lievi aggiustamenti del protocoll...

Il campo dell'ingegneria del tessuto adiposo marrone / beige è in gran parte immaturo 22,23,24,25,26,27,28, con la maggior parte dei modelli adiposi sviluppati per il tessuto adiposo bianco 8,22,31...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un approccio per lo sviluppo di tessuto adiposo beige vascolarizzato da una singola fonte potenzialmente autologa, il frammento microvascolare (MVF). I tessuti adiposi marroni e beige hanno dimostrato di mostrare proprietà benefiche legate alla regolazione metabolica; Tuttavia, il piccolo volume di questi depositi di tessuto adiposo negli adulti limita il potenziale impatto sul metabolismo sistemico, in particolare in condizioni malate come l'obesità o il diabete di tipo 2 1,2,3,4,5,6,7. C'è un significativo interesse per il grasso marrone / beige come bersaglio terapeutico per prevenire gli effetti metabolici dannosi legati all'obesità e alle sue comorbidità 8,9,10,11,12.
Gli MVF sono strutture vascolari che possono essere isolate direttamente dal tessuto adiposo, coltivate e mantenute in una configurazione tridimensionale per lunghi periodi di tempo13,14,15. Il lavoro precedente del nostro gruppo, e di altri, ha iniziato a sfruttare la capacità multicellulare e multipotente degli MVF, in particolare per quanto riguarda la formazione del tessuto adiposo16,17,18. Come conclusione di questo lavoro, abbiamo recentemente dimostrato che gli MVF derivati da modelli di roditori di diabete sano e di tipo 219 e da soggetti umani (adulti di età superiore ai 50 anni)20 contenevano cellule in grado di essere indotte a formare tessuto adiposo termogenico o beige.
Ecco un approccio innovativo da cui viene utilizzato un MVF da una singola fonte, non solo in grado di creare tessuto adiposo beige ma anche la sua componente vascolare associata e critica21. L'uso di questa tecnica potrebbe essere di grande valore per gli studi che cercano un approccio semplice di ingegneria tissutale per la formazione del tessuto adiposo termogenico. A differenza di altri metodi che aspirano a progettare il tessuto adiposo beige 22,23,24,25,26,27,28, il processo descritto in questo studio non richiede l'uso di più tipi di cellule o complessi regimi di induzione. I modelli di grasso beige e bianco vascolarizzati possono essere creati con MVF provenienti da fonti di roditori e umani, dimostrando un grande potenziale di traduzione. Il prodotto finale di questo protocollo è un tessuto adiposo termogenico beige ingegnerizzato con una struttura e una funzione metabolica paragonabili al tessuto adiposo bruno. Nel complesso, questo protocollo presenta l'idea che una fonte facilmente accessibile e possibilmente autologa MVF possa essere un utile intervento terapeutico e uno strumento per studiare i disturbi metabolici.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-Tipped Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-172</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>126575-10GM</td>
			<td>Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9633623</td>
			<td>Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC230302500</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable underpads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td>For fluid absorption during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16140089</td>
			<td>Added in DMEM to 20% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630-25G</td>
			<td>Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask, 250 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500250</td>
			<td>Allows for digestion of fat using a large surface area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-264-21</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MVF</td>
			<td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td>
			<td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td>
			<td>Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5523</td>
			<td>Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9023832</td>
			<td>Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Added in DMEM to 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>351029</td>
			<td>3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens &#38; 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 &#181;M screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>For counting fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td>Diluted to 1x with sterile deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC0854141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>R0106200MG</td>
			<td>Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen&#160; 37 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222R</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen 500 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222F</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated Hemostat</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-171</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>6051601KU</td>
			<td>Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid hormone (T3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 
			https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td>
			<td>Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments

L'ingegneria del tessuto adiposo termogenico (ad esempio, tessuti adiposi beige o bruni) è stata studiata come potenziale terapia per le malattie metaboliche o per la progettazione di microtessuti personalizzati per lo screening sanitario e i test farmacologici. Le strategie attuali sono spesso piuttosto complesse e non riescono a rappresentare accuratamente le proprietà multicellulari e funzionali del tessuto adiposo termogenico. I frammenti microvascolari, piccoli microvasi intatti composti da arteriole, venule e capillari isolati dal tessuto adiposo, fungono da singola fonte autologa di cellule che consentono la vascolarizzazione e la formazione del tessuto adiposo. Questo articolo descrive i metodi per ottimizzare le condizioni di coltura per consentire la generazione di tessuti adiposi termogenici tridimensionali, vascolarizzati e funzionali da frammenti microvascolari, compresi i protocolli per l'isolamento di frammenti microvascolari da tessuto adiposo e condizioni di coltura. Inoltre, vengono discusse le migliori pratiche, così come le tecniche per caratterizzare i tessuti ingegnerizzati e vengono forniti i risultati dei campioni da frammenti microvascolari sia di roditori che umani. Questo approccio ha il potenziale per essere utilizzato per la comprensione e lo sviluppo di trattamenti per l'obesità e le malattie metaboliche.

Ci sono alcune caratteristiche morfologiche fenotipiche chiave del tessuto adiposo beige / marrone: è multiloculare / contiene piccole goccioline lipidiche, possiede un gran numero di mitocondri (la ragione del suo aspetto tipicamente "brunastro" in vivo), ha corrispondentemente un alto tasso di consumo di ossigeno / bioenergetica mitocondriale, è altamente vascolarizzato, ha aumentato la lipolisi / assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e, più notoriamente, esprime alti livelli di proteina disacco...

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Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che delinea l'uso di frammenti microvascolari isolati da roditori o tessuto adiposo umano come approccio diretto per progettare tessuto adiposo beige funzionale e vascolarizzato.

Coltura tridimensionale di tessuto adiposo termogenico vascolarizzato da frammenti microvascolari

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Questo protocollo descrive la generazione di grasso termogenico vascolarizzato e funzionale tridimensionale da frammenti microvascolari o MVF. Le attuali strategie per l'ingegneria del tessuto adiposo termogenico sono complesse e non descrivono completamente le sue proprietà multicellulari e funzionali. Gli MVF sono un'unica fonte di cellule che consentono la vascolarizzazione e la formazione del tessuto adiposo.Essendo un semplice metodo di sola fonte per creare imitazioni biologiche del grasso beige, gli MVF hanno un potenziale significativo per promuovere la comprensione o lo sviluppo di trattamenti per l'obesità e le malattie metaboliche. Porre l'animale opportunamente rasato ed eutanasia trattato con etanolo al 70% in posizione supina e iniziare l'isolamento del grasso inguinale. Sollevare la pelle sotto il pene con un paio di forbici ed eseguire l'incisione, partendo dal centro e tagliando lateralmente, formando una forma a V, prima di passare al retro dell'animale per accedere all'intero deposito di grasso.Durante il taglio, assicurarsi la separazione della pelle dal grasso tagliando il tessuto della fascia interconnessa. Una volta che la fascia è stata tagliata in modo appropriato, assicurarsi che il grasso inguinale da entrambi i lati, che si estende dall'inguine verso la parte posteriore, sia visibile. Quindi, rimuovere il grasso dai due lati in tubi conici separati contenenti 10 millilitri di BSA in PBS, con una concentrazione di un milligrammo per millilitro.Per raccogliere il grasso dell'epididimo, tagliare la pelle addominale, seguita da un taglio accurato attraverso lo strato sottile che circonda i testicoli. Tirare delicatamente il tessuto adiposo con una pinza e ritagliarlo con le forbici, evitando la dissezione di tutti i principali vasi sanguigni visibili. Ora, posizionare il grasso rimosso in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.Per isolare il grasso sottocutaneo posteriore, girare il ratto incline e utilizzare grandi forbici per tagliare la pelle spessa della schiena fino al cuoio capelluto, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità sotto la pelle. Tagliare la fascia che collega la pelle al tessuto. Differenziare il grasso sottocutaneo, situato nella regione intrascapolare, dal grasso bruno situato più vicino alla colonna vertebrale prima di isolare e posizionare il grasso sottocutaneo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.Mentre si lavora all'interno di una biocappa, utilizzare una pinza per posizionare il grasso asportato in una capsula di Petri standard da 100 millilitri contenente 0,5 millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS. Rimuovere eventuali vasi sanguigni visibili, muscoli o tessuto estraneo dal grasso. Usando le forbici, tritare il grasso per 10 minuti e controllare la presenza di grumi aggiungendo un po 'di BSA.Continuare a tritare, se necessario, prima di trasferire la sospensione di grasso tritato in un pallone sterile da 250 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Portare il volume nel pallone fino a 20 millilitri aggiungendo abbastanza BSA in PBS. Ora aggiungi BSA in PBS alla collagenasi e omogeneizza la soluzione agitandola delicatamente prima di filtrarla sterile attraverso un filtro in rete di nylon da 0,22 micron.Aggiungere immediatamente la quantità necessaria di soluzione di collagenasi alla sospensione di grasso tritato e digerire il grasso agitando il pallone con un movimento circolare a bagnomaria a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo appropriato. Trasferire il grasso digerito in un tubo conico da 50 millilitri etichettato grasso digerito o grasso tritato. Centrifugare il tubo a 400 G per quattro minuti per far girare i frammenti microvascolari, o MVF, in un pellet rosso.Decantare delicatamente il surnatante in un tubo conico da 50 millilitri etichettato come rifiuto senza disturbare il pellet. Quindi, aggiungere 10 millilitri di un milligrammo per millilitro BSA in PBS al tubo contenente il pellet e mescolare la sospensione di pellet pipettandola delicatamente su e giù due volte senza interrompere i frammenti. Ora, prendi lo schermo da 500 micron pre-imbevuto di una piastra di Petri sterile contenente cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS e posizionalo sopra il supporto dello schermo di plastica tenuto su una nuova capsula di Petri.Pipettare 10 millilitri di sospensione dal tubo di pellet digerito sullo schermo in cerchi concentrici. Lavare il filtro con altri cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS e scartarlo, mantenendo il filtrato all'interno della capsula di Petri. Quindi posizionare lo schermo da 37 micron pre-imbevuto sopra il supporto dello schermo di plastica su una nuova capsula di Petri.Utilizzando una nuova pipetta, trasferire il filtrato dalla prima filtrazione sullo schermo in cerchi concentrici. Come descritto in precedenza, lavare lo schermo con BSA in PBS e, questa volta, eliminare il filtrato mantenendo lo schermo da 37 micron. Far scorrere lo schermo da 37 micron in una nuova capsula di Petri contenente cinque millilitri di un milligrammo per millilitro di BSA in PBS.Rimuovere i frammenti picchiettando delicatamente il piatto contro un supporto conico, senza versare alcun liquido. Risciacquare il filtro con altri cinque millilitri di BSA in PBS. Quindi, trasferire il liquido dalla piastra di Petri in un tubo conico sterile da 50 millilitri.Risciacquare lo schermo da 37 micron più volte, aggiungendo il lavaggio al tubo conico fino a quando il volume totale raccolto è da 15 a 20 millilitri. Eliminare lo schermo dopo il risciacquo finale. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 20 microlitri usando le forbici.Agitare delicatamente il tubo contenente il liquido prima di prelevare due aliquote da 20 microlitri utilizzando la punta della pipetta tagliata e pipettare ciascuna delle aliquote in una capsula di Petri pulita da 35 millimetri. Contare il numero di frammenti nel campione in ogni capsula di Petri usando un microscopio ottico standard e, usando la formula menzionata nel manoscritto, ottenere il numero totale di frammenti microvascolari isolati. Ruotare il liquido rimanente nel tubo conico da 50 millilitri a 400 G per quattro minuti per raccogliere l'MVF.Dopo la centrifuga, decantare la maggior parte del surnatante dal tubo conico e utilizzare una pipetta per rimuovere il piccolo volume di liquido rimasto sul bordo del tubo. Quindi, aggiungere trombina nei pozzetti designati per la colata di gel. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 200 microlitri e, utilizzandola, risospendere delicatamente gli MVF nel fibrinogeno per ottenere la densità finale desiderata.Pipettare la sospensione nella soluzione di trombina nel pozzetto e omogeneizzare rapidamente la miscela pipettando su e giù. Una volta che tutti i gel sono stati colati, posizionare la piastra del pozzetto in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa 15 minuti per consentire la reticolazione del gel. I lipidi e gli adipociti differenziati sono stati osservati mediante microscopia confocale degli idrogel utilizzando BODIPY come colorante lipidico.La coltura di tessuto adiposo non vascolarizzato utilizzando mezzi adipogeni bianchi adipogenici o beige ha portato alla formazione di tessuto adiposo bianco o beige non vascolarizzato, rispettivamente, da MVF di derivazione magra e diabetica derivata da roditori. Allo stesso modo, la coltura di tessuto adiposo vascolarizzato utilizzando mezzi adipogeni adipogenici bianchi o beige ha portato alla formazione di tessuto adiposo bianco o beige vascolarizzato rispettivamente, dagli MVF derivati dai roditori. Anche il tessuto adiposo bianco e beige non vascolarizzato ottenuto da MVF umani è stato osservato mediante microscopia confocale.La capacità degli MVF di differenziarsi in tessuto adiposo beige è stata confermata geneticamente utilizzando RT-qPCR. MVF di roditori magri e diabetici esposti a terreni adipogeni bianchi diretti o adipogeni beige sono stati valutati per adipogenesi, termogenesi e angiogenesi. L'espressione del disaccoppiamento della proteina 1, come previsto, era significativamente più alta nel tessuto adipogeno beige.Una tendenza simile è stata osservata negli MVF di roditori esposti a terreni adipogeni bianchi indiretti o adipogenici beige, nonché negli MVF umani esposti a mezzi adipogeni bianchi diretti o adipogenici beige. Infine, dalla bioenergetica mitocondriale, era evidente che funzionalmente, il tessuto adiposo beige aveva un tasso di consumo di ossigeno caratteristicamente più elevato, o OCR, livello in tutti i casi. La digestione enzimatica del tessuto adiposo dovrebbe essere ottimizzata per riprodurre costantemente MVF di dimensioni e qualità simili.Dopo la digestione, gli MVF devono essere maneggiati delicatamente, con particolare attenzione per evitare un'ulteriore rottura dei frammenti. Questa tecnica ha contribuito a promuovere l'equilibrio della crescita dei vasi e la differenziazione degli adipociti, dimostrando di dipendere dai fattori introdotti.

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