Name: three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00
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アコスタ博士は、国立衛生研究所の助成金CA148724およびTL1TR002647によってサポートされています。ゴンザレス・ポラス博士は、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の支援を受けており、賞番号F32-0DK122754で報告されています。この研究は、国立衛生研究所(5SC1DK122578)とテキサス大学サンアントニオ校の生物医学工学科によって部分的にサポートされました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。図は部分的に Biorender.com で作成されました。

本研究は、動物愛護法および動物愛護規則施行規則に準拠して、実験動物の飼養及び利用に関する手引きの原則に従って実施された。すべての動物の手順は、テキサス大学サンアントニオ校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
注:以下に説明する手順では、オスのルイスラットが使用されます。雌およびマウス微小血管断片(MVF)コレクションにつ?...

ブラウン/ベージュの脂肪組織工学の分野は、ほとんど未成熟であり22,23,24,25,26,27,28であり、脂肪モデルの大部分は白色脂肪組織用に開発されています8,22,31<sup class="xr...

このプロトコルの目的は、単一の潜在的に自己由来の微小血管断片(MVF)から血管新生ベージュ脂肪組織を開発するためのアプローチを説明することです。茶色とベージュの脂肪組織は、代謝調節に関連する有益な特性を示すことが実証されています。ただし、成人のこれらの脂肪組織デポーの量が少ないため、特に肥満や2型糖尿病などの病状では、全身代謝への潜在的な影響が制限されます1,2,3,4,5,6,7。肥満とその併存疾患に関連する有害な代謝効果を予防するための治療標的として、茶色/ベージュ色の脂肪に大きな関心が寄せられています8,9,10,11,12。
MVFは、脂肪組織から直接単離し、培養し、長期間にわたって三次元構成で維持することができる血管構造である13、14、15。私たちのグループや他のグループからの以前の研究は、特に脂肪組織形成に関連するように、MVFの多細胞および多能性能力を利用し始めています16,17,18。この研究の積み重ねとして、私たちは最近、健康な2型糖尿病のげっ歯類モデル19およびヒト被験者(50歳以上の成人)20に由来するMVFに、熱発生またはベージュ色の脂肪組織を形成するように誘導できる細胞が含まれていることを実証しました。
本明細書は、単一ソースMVFが利用される革新的なアプローチであり、ベージュ脂肪組織だけでなく、その関連する重要な血管成分21も作成することができる。この技術の使用は、熱発生脂肪組織形成のための簡単な組織工学的アプローチを探している研究にとって非常に価値がある可能性があります。ベージュ色の脂肪組織を設計することを目指す他の方法22、23、24、25、26、27、28とは異なり、この研究に記載されているプロセスは、複数の細胞型または複雑な誘導レジメンを使用する必要はありません。血管化されたベージュおよび白色脂肪モデルは、げっ歯類およびヒト由来のMVFで作成でき、大きな翻訳の可能性を示しています。このプロトコルの最終製品は、褐色脂肪組織に匹敵する構造と代謝機能を備えた操作されたベージュの熱発生脂肪組織です。全体として、このプロトコルは、簡単にアクセスでき、おそらく自家ソースMVFが、代謝障害を研究するための価値のある治療的介入およびツールである可能性があるという考えを提示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-Tipped Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-172</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>126575-10GM</td>
			<td>Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9633623</td>
			<td>Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC230302500</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable underpads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td>For fluid absorption during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16140089</td>
			<td>Added in DMEM to 20% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630-25G</td>
			<td>Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask, 250 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500250</td>
			<td>Allows for digestion of fat using a large surface area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-264-21</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MVF</td>
			<td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td>
			<td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td>
			<td>Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5523</td>
			<td>Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9023832</td>
			<td>Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Added in DMEM to 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>351029</td>
			<td>3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens &#38; 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 &#181;M screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>For counting fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td>Diluted to 1x with sterile deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC0854141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>R0106200MG</td>
			<td>Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen&#160; 37 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222R</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen 500 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222F</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated Hemostat</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-171</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>6051601KU</td>
			<td>Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid hormone (T3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 
			https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td>
			<td>Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments

エンジニアリング熱発生脂肪組織(例えば、ベージュまたは褐色脂肪組織)は、代謝性疾患の潜在的な治療法として、または健康診断および薬物検査のための個別化された微小組織の設計のために研究されている。現在の戦略はしばしば非常に複雑であり、熱発生脂肪組織の多細胞および機能的特性を正確に完全に描写することができません。微小血管断片は、脂肪組織から単離された細動脈、細静脈、および毛細血管からなる小さな無傷の微小血管であり、血管新生および脂肪組織形成を可能にする単一の自家細胞源として機能する。この記事では、脂肪組織および培養条件から微小血管断片を分離するためのプロトコルを含む、微小血管断片から3次元、血管化、および機能的な熱発生脂肪組織を生成できるように培養条件を最適化する方法について説明します。さらに、ベストプラクティス、および操作された組織を特徴付けるための技術が議論され、げっ歯類とヒトの両方の微小血管断片からのサンプル結果が提供されます。このアプローチは、肥満や代謝性疾患の治療法の理解と開発に活用できる可能性があります。

ベージュ/褐色脂肪組織のいくつかの重要な表現型の形態学的特徴があります:それは多房性であり、小さな脂肪滴を含み、多数のミトコンドリアを所有し(生体内でその特徴的に「茶色がかった」外観の理由)、それに応じて高い酸素消費率/ミトコンドリア生体エネルギーを有し、高度に血管新生され、脂肪分解/インスリン刺激グルコース取り込みを増加させ、そして最も悪名高い、 熱...

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Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

ここでは、機能的な血管新生ベージュ脂肪組織を設計するための簡単なアプローチとして、げっ歯類またはヒト脂肪組織から分離された微小血管断片の使用を概説する詳細なプロトコルを提示します。

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

このプロトコルは、微小血管断片(MVF)からの三次元血管化および機能性熱発生脂肪の生成について説明しています。 熱発生脂肪組織を操作するための現在の戦略は複雑であり、その多細胞および機能的特性を完全には示していません。MVFは、血管新生と脂肪組織形成を可能にする細胞の単一の供給源です。MVFは、ベージュ色の脂肪の生物学的模倣を作成するための単純な唯一のソース方法であるため、肥満や代謝性疾患の治療法の理解や開発を促進する大きな可能性を秘めています。70%エタノールで処理した適切に剃毛および安楽死させた動物を仰臥位に置き、鼠径脂肪の分離を開始します。.ハサミで陰茎の下の皮膚を持ち上げ、中央から始めて横方向に切断し、V字型を形成してから、動物の裏側にループして脂肪沈着物全体にアクセスします。切断中は、相互接続された筋膜組織を切断することにより、脂肪から皮膚を確実に分離します。筋膜が適切に切断されたら、鼠径部から背中に向かって伸びる両側の鼠径脂肪が見えるようにします。次に、1ミリリットルあたり1ミリグラムの濃度のPBSに10ミリリットルのBSAを含む別々の円錐形のチューブで両側から脂肪を取り除きます。精巣上体脂肪を収穫するには、腹部の皮膚を切り取り、続いて睾丸を囲む薄い層を注意深く切ります。鉗子を使用して脂肪組織をそっと引っ張り、目に見える主要な血管の解剖を避けながら、ハサミを使用して切り取ります。次に、除去した脂肪を、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。後部皮下脂肪を分離するには、ラットを伏せて大きなハサミで背中の厚い皮膚を頭皮まで切り、皮膚の下を深く切りすぎないように注意します。皮膚を組織に接続する筋膜を切ります。肩甲骨内領域にある皮下脂肪を脊椎に近い褐色脂肪と区別してから、皮下脂肪を分離して、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル含む50ミリリットルの円錐管に入れます。バイオフード内で作業している間、鉗子を使用して、切除した脂肪をPBSの1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの0.5ミリリットルを含む標準の100ミリリットルのペトリ皿に入れます。脂肪から目に見える血管、筋肉、または無関係な組織を取り除きます。はさみを使用して、脂肪を10分間ミンチし、さらにBSAを追加してしこりがないか確認します。必要に応じてミンチを続けてから、ミンチ脂肪懸濁液を10ミリリットルのピペットで滅菌した250ミリリットルのフラスコに移します。PBSに十分なBSAを加えて、フラスコ内の容量を最大20ミリリットルにします。次に、PBS中のBSAをコラゲナーゼに加え、溶液を穏やかに振って均質化してから、0.22ミクロンのナイロンネットフィルターで滅菌ろ過します。直ちに必要量のコラゲナーゼ溶液を細切脂肪懸濁液に加え、フラスコを摂氏37度の水浴中で円を描くように振って脂肪を消化する。消化された脂肪を、消化脂肪またはミンチ脂肪とラベル付けされた50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを400 Gで4分間遠心分離し、微小血管断片(MVF)を赤いペレットにスピンダウンします。ペレットを乱すことなく、上清を廃棄物とラベル付けされた50ミリリットルの円錐形のチューブにそっとデカントします。次に、ペレットを入れたチューブにPBS中の1ミリリットル当たり1ミリグラムのBSAを10ミリリットル加え、断片を乱すことなく2回穏やかに上下にピペッティングしてペレット懸濁液を混合する。次に、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAを5ミリリットル含む滅菌ペトリ皿にあらかじめ浸した500ミクロンのスクリーンを取り、新しいペトリ皿に保管されているプラスチック製のスクリーンホルダーの上に置きます。消化されたペレットチューブから同心円状にスクリーン上に10ミリリットルの懸濁液をピペットで入れる。PBSで1ミリリットルBSAあたり1ミリグラムの追加5ミリリットルでフィルターを洗浄し、ろ液をペトリ皿内に保持しながら廃棄します。次に、事前に浸した37ミクロンのスクリーンを新しいペトリ皿のプラスチックスクリーンホルダーの上に置きます。新しいピペットを使用して、最初のろ過から同心円でスクリーンにろ液を移します。前述のように、PBSのBSAでスクリーンを洗浄し、今度は37ミクロンのスクリーンを保持したまま濾液を廃棄します。37ミクロンのスクリーンを、PBSに1ミリリットルあたり1ミリグラムのBSAが5ミリリットル入った新しいペトリ皿にスライドさせます。液体をこぼさずに、皿を円錐形のホルダーにそっと叩いて破片を取り除きます。PBSでさらに5ミリリットルのBSAでフィルターをすすぎます。次に、ペトリ皿から滅菌50ミリリットルの円錐管に液体を移します。37ミクロンのスクリーンをさらに数回すすぎ、収集された総量が15〜20ミリリットルになるまでコニカルチューブに洗浄を追加します。最後のすすぎの後、スクリーンを破棄します。ハサミを使用して20マイクロリットルのピペットチップの端を切ります。カットされたピペットチップを使用して20マイクロリットルの2つのアリコートを引く前に、液体を含むチューブを静かに振って、各アリコートをきれいな35ミリメートルのペトリ皿にピペットで入れます。標準的な光学顕微鏡を用いて各シャーレ中の試料中の断片の数を数え、そして原稿に記載された式を用いて、単離された微小血管断片の総数を得る。50ミリリットルのコニカルチューブ内の残りの液体を400Gで4分間回転させてMVFを収集します。回転後、円錐管から上清の大部分をデカントし、ピペットを使用して管の縁に残っている少量の液体を除去します。次に、キャストゲル用に指定されたウェルにトロンビンを追加します。200マイクロリットルのピペットチップの端を切り取り、それを使用してMVFをフィブリノーゲンに静かに再懸濁し、目的の最終密度を得ます。懸濁液をウェル内のトロンビン溶液にピペットで入れ、上下にピペッティングして混合物を素早くホモジナイズします。すべてのゲルをキャストしたら、ウェルプレートを摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに約15分間置き、ゲルの架橋を可能にします。脂質および分化脂肪細胞を、脂質染色剤としてBODIPYを用いたヒドロゲルの共焦点顕微鏡イメージングによって観察した。白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて非血管化脂肪組織を培養すると、痩せた齧歯類および糖尿病性のげっ歯類由来のMVFの両方から、それぞれ血管化されていない白色またはベージュの脂肪組織が形成された。同様に、白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地を用いて血管新生脂肪組織を培養すると、げっ歯類由来のMVFからそれぞれ血管化された白色脂肪組織またはベージュ脂肪組織が形成された。 ヒトMVFから得られた非血管化白色およびベージュ脂肪組織も共焦点顕微鏡によって観察された。MVFのベージュ脂肪組織への分化能は、RT-qPCRを用いて遺伝的に確認された。 直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪生成培地に曝露された除脂肪および糖尿病のげっ歯類MVFは、脂肪生成、熱発生および血管新生について評価された。予想通りの脱共役タンパク質1の発現は、ベージュ色の脂肪生成組織において有意に高かった。同様の傾向は、間接的な白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたげっ歯類MVF、および直接白色脂肪原性またはベージュ色の脂肪発生培地に曝露されたヒトMVFでも観察されました。.最後に、ミトコンドリアの生体エネルギー学から、機能的には、ベージュ色の脂肪組織はすべてのケースで特徴的に高い酸素消費率(OCR)レベルを持っていることが明らかになりました。脂肪組織の酵素消化は、同様のサイズと品質のMVFを一貫して再現するように最適化する必要があります。消化後、MVFは、断片がさらに分解しないように特別な注意を払って、穏やかに取り扱う必要があります。この技術は、血管の成長と脂肪細胞の分化のバランスを促進するのに役立ち、導入された要因に依存することが証明されました。

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