Name: three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments at JoVE.com

Dr. Acosta é apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. O Dr. Gonzalez é apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais dos Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de prêmio F32-0DK122754. Este trabalho foi apoiado, em parte, pelo National Institutes of Health (5SC1DK122578) e pelo Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade do Texas em San Antonio. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas em San Antonio.
NOTA: Para as etapas descritas abaixo, são utilizados ratos Lewis machos. Pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos para uma fêm...

O campo da engenharia do tecido adiposo marrom/bege é em grande parte imaturo 22,23,24,25,26,27,28, com a maior parte dos modelos adiposos sendo desenvolvidos para o tecido adiposo branco 8,22,31. ...

O objetivo deste protocolo é descrever uma abordagem para o desenvolvimento de tecido adiposo bege vascularizado a partir de uma única fonte potencialmente autóloga, o fragmento microvascular (MVF). Demonstrou-se que os tecidos adiposos marrom e bege exibem propriedades benéficas relacionadas à regulação metabólica; entretanto, o pequeno volume desses depósitos de tecido adiposo em adultos limita o potencial impacto sobre o metabolismo sistêmico, particularmente em condições de doenças como obesidade ou diabetes tipo 21,2,3,4,5,6,7. Há significativo interesse na gordura marrom/bege como alvo terapêutico para a prevenção dos efeitos metabólicos deletérios associados à obesidade e suas comorbidades 8,9,10,11,12.
As FVM são estruturas vasculares que podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo, cultivadas e mantidas em uma configuração tridimensional por longos períodos de tempo13,14,15. Trabalhos anteriores de nosso grupo, entre outros, começaram a explorar a capacidade multicelular e multipotente das MVFs, especificamente no que se refere à formação de tecido adiposo16,17,18. Como um acúmulo deste trabalho, demonstramos recentemente que MVFs derivados de modelos de roedores com diabetes tipo 2 esaudáveis19 e de indivíduos humanos (adultos com mais de 50 anos de idade)20 continham células capazes de serem induzidas a formar tecido adiposo termogênico, ou bege.
Trata-se de uma abordagem inovadora a partir da qual se utiliza uma única fonte de FMV, capaz não só de criar tecido adiposo bege, mas também de seu componente vascular associado e crítico21. O uso dessa técnica pode ser de grande valia para estudos que buscam uma abordagem simples de engenharia tecidual para a formação de tecido adiposo termogênico. Ao contrário de outros métodos que aspiram a manipular tecido adiposo bege 22,23,24,25,26,27,28, o processo descrito neste estudo não requer o uso de múltiplos tipos celulares ou regimes complexos de indução. Modelos vascularizados de gordura bege e branca podem ser criados com MVFs provenientes de fontes de roedores e humanos, demonstrando grande potencial de tradução. O produto final deste protocolo é um tecido adiposo termogênico bege projetado com uma estrutura e função metabólica comparáveis ao tecido adiposo marrom. De modo geral, este protocolo apresenta a ideia de que uma FMVM de fonte facilmente acessível e possivelmente autóloga pode ser uma intervenção terapêutica e uma ferramenta valiosa para o estudo de distúrbios metabólicos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt-Tipped Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-172</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>126575-10GM</td>
			<td>Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9633623</td>
			<td>Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC230302500</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable underpads</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td>For fluid absorption during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td>Sterilize in autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>16140089</td>
			<td>Added in DMEM to 20% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8630-25G</td>
			<td>Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask, 250 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500250</td>
			<td>Allows for digestion of fat using a large surface area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-264-21</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MVF</td>
			<td>Advanced Solutions Life Scienes, LLC</td>
			<td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td>
			<td>Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td>Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5523</td>
			<td>Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoZap</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC9023832</td>
			<td>Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Added in DMEM to 1% v/v.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>351029</td>
			<td>3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens &#38; 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 &#181;M screens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>50-202-036</td>
			<td>For counting fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td>Diluted to 1x with sterile deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>NC0854141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>R0106200MG</td>
			<td>Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td>1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen&#160; 37 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222R</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen 500 &#181;M&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>652222F</td>
			<td>Cut into 3&#34; rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serrated Hemostat</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-000-171</td>
			<td>Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>6051601KU</td>
			<td>Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid hormone (T3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td>Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male&#160;</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 
			https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td>
			<td>Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of vascularized thermogenic adipose tissue from microvascular fragments

A engenharia do tecido adiposo termogênico (por exemplo, tecido adiposo bege ou marrom) tem sido investigada como uma terapia potencial para doenças metabólicas ou para o design de microtecidos personalizados para triagem de saúde e testes de drogas. As estratégias atuais são frequentemente bastante complexas e falham em retratar com precisão as propriedades multicelulares e funcionais do tecido adiposo termogênico. Fragmentos microvasculares, pequenos microvasos intactos constituídos por arteríolas, vênulas e capilares isolados do tecido adiposo, servem como uma única fonte autóloga de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo. Este artigo descreve métodos para otimizar as condições de cultura para permitir a geração de tecido adiposo termogênico tridimensional, vascularizado e funcional a partir de fragmentos microvasculares, incluindo protocolos para isolamento de fragmentos microvasculares do tecido adiposo e condições de cultura. Adicionalmente, as melhores práticas são discutidas, assim como as técnicas de caracterização dos tecidos modificados, e resultados de amostras de fragmentos microvasculares de roedores e humanos são fornecidos. Essa abordagem tem potencial para ser utilizada para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas.

Existem algumas características morfológicas fenotípicas importantes do tecido adiposo bege/marrom: é multilocular/contém pequenas gotículas lipídicas, possui um grande número de mitocôndrias (a razão de sua aparência caracteristicamente "acastanhada" in vivo), correspondentemente tem uma alta taxa de consumo de oxigênio/bioenergética mitocondrial, é altamente vascularizado, tem aumento da lipólise/captação de glicose estimulada por insulina e, mais notoriamente, expressa altos níveis de prote...

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Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado delineando o uso de fragmentos microvasculares isolados de tecido adiposo humano ou de roedores como uma abordagem direta para a engenharia de tecido adiposo bege vascularizado funcional.

Cultura Tridimensional de Tecido Adiposo Termogênico Vascularizado a partir de Fragmentos Microvasculares

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Este protocolo descreve a geração de gordura termogênica tridimensional vascularizada e funcional a partir de fragmentos microvasculares, ou MVFs. As estratégias atuais de engenharia de tecido adiposo termogênico são complexas e não retratam completamente suas propriedades multicelulares e funcionais. As MVFs são uma fonte única de células que permitem a vascularização e a formação de tecido adiposo.Sendo um método simples de fonte única para criar imitações biológicas de gordura bege, os MVFs têm um potencial significativo para promover a compreensão ou o desenvolvimento de tratamentos para obesidade e doenças metabólicas. Colocar o animal adequadamente tricotelado e eutanasiado tratado com etanol 70% em decúbito dorsal e iniciar o isolamento da gordura inguinal. Levante a pele abaixo do pênis com uma tesoura e realize a incisão, começando pelo centro e cortando lateralmente, formando um formato de V, antes de fazer um loop até a parte de trás do animal para acessar todo o depósito de gordura.Durante o corte, garanta a separação da pele da gordura cortando o tecido da fáscia interconectado. Uma vez que a fáscia é adequadamente cortada, certifique-se de que a gordura inguinal de ambos os lados, estendendo-se da virilha para trás, é visível. Em seguida, retire a gordura dos dois lados em tubos cônicos separados contendo 10 mililitros de BSA em PBS, com uma concentração de um miligrama por mililitro.Para colher a gordura epididimal, corte através da pele abdominal, seguido de cortar cuidadosamente a fina camada que envolve os testículos. Puxe suavemente o tecido adiposo usando pinças e corte-o usando tesoura, evitando a dissecção de quaisquer vasos sanguíneos visíveis importantes. Agora, coloque a gordura removida em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.Para isolar a gordura subcutânea posterior, vire o rato de bruços e use uma tesoura grande para cortar a pele grossa das costas até o couro cabeludo, tomando cuidado para não cortar muito fundo abaixo da pele. Corte a fáscia que liga a pele ao tecido. Diferenciar a gordura subcutânea, localizada na região intraescapular, da gordura marrom localizada mais próxima à coluna vertebral antes de isolar e colocar a gordura subcutânea em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de um miligrama por mililitro de SC em PBS.Enquanto estiver trabalhando dentro de um biohood, use fórceps para colocar a gordura excisada em uma placa de Petri padrão de 100 mililitros contendo 0,5 mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS. Remova quaisquer vasos sanguíneos visíveis, músculos ou tecido estranho da gordura. Usando uma tesoura, pique a gordura por 10 minutos e verifique se há caroços adicionando um pouco mais de BSA.Continue picando, se necessário, antes de transferir a suspensão de gordura picada para um balão estéril de 250 mililitros com uma pipeta de 10 mililitros. Aumentar o volume no frasco até 20 mililitros adicionando BSA suficiente em PBS. Agora adicione BSA em PBS à colagenase e homogeneize a solução agitando-a suavemente antes de filtrá-la estéril através de um filtro líquido de nylon de 0,22 mícron.Adicione imediatamente a quantidade necessária de solução de colagenase à suspensão de gordura picada e digerir a gordura agitando o balão em movimento circular em banho-maria a 37 graus Celsius durante o período de tempo adequado. Transfira a gordura digerida para um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como gordura digerida ou gordura picada. Centrifugar o tubo a 400 G por quatro minutos para girar os fragmentos microvasculares, ou MVFs, em uma pastilha vermelha.Decantar suavemente o sobrenadante em um tubo cônico de 50 mililitros rotulado como resíduo sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione 10 mililitros de um miligrama por miligrama de BSA em PBS ao tubo que contém o pellet e misture a suspensão do pellet pipetando-o suavemente para cima e para baixo duas vezes sem interromper os fragmentos. Agora, pegue a tela de 500 mícrons pré-embebida em uma placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS e coloque-a sobre o suporte de tela de plástico mantido em uma nova placa de Petri.Pipetar 10 mililitros de suspensão do tubo de pellet digerido para a tela em círculos concêntricos. Lave o filtro com mais cinco mililitros de um miligrama por mililitro de BSA em PBS e elimine-o, mantendo o filtrado dentro da placa de Petri. Em seguida, coloque a tela pré-embebida de 37 mícrons acima do suporte de tela de plástico em uma nova placa de Petri.Usando uma pipeta fresca, transfira o filtrado da primeira filtração para a tela em círculos concêntricos. Como descrito anteriormente, lave a tela com BSA em PBS e, desta vez, descarte o filtrado mantendo a tela de 37 mícrons. Deslize a tela de 37 mícrons em uma nova placa de Petri contendo cinco mililitros de um miligrama por mililitro BSA em PBS.Desalojar os fragmentos batendo suavemente o prato contra um suporte cônico, sem derramar nenhum líquido. Enxaguar o filtro com mais cinco mililitros de BSA em PBS. Em seguida, transfira o líquido da placa de Petri para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.Enxágue a tela de 37 mícrons várias vezes, adicionando a lavagem ao tubo cônico até que o volume total coletado seja de 15 a 20 mililitros. Descarte a tela após o enxágue final. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 20 microlitros usando uma tesoura.Agite suavemente o tubo que contém o líquido antes de retirar duas alíquotas de 20 microlitros usando a ponta da pipeta cortada e pipetar cada uma das alíquotas em uma placa de Petri limpa de 35 milímetros. Contar o número de fragmentos da amostra em cada placa de Petri utilizando um microscópio de luz padrão e, utilizando a fórmula mencionada no manuscrito, obter o número total de fragmentos microvasculares isolados. Gire o líquido restante no tubo cônico de 50 mililitros a 400 G por quatro minutos para coletar a FMV.Após a fiação, decantar a maior parte do sobrenadante do tubo cônico e usar uma pipeta para remover o pequeno volume de líquido remanescente na borda do tubo. Em seguida, adicione trombina nos orifícios designados para fundição de géis. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e, usando-a, ressuspenda suavemente as MVFs em fibrinogênio para obter a densidade final desejada.Pipetar a suspensão para a solução de trombina no poço e homogeneizar rapidamente a mistura pipetando para cima e para baixo. Depois que todos os géis estiverem fundidos, coloque a placa do poço em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cerca de 15 minutos para permitir a reticulação do gel. Os lipídios e os adipócitos diferenciados foram observados por microscopia confocal dos hidrogéis usando BODIPY como coloração lipídica.A cultura de tecido adiposo não vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege não vascularizado, respectivamente, tanto de MVFs magros quanto de roedores diabéticos. Da mesma forma, a cultura de tecido adiposo vascularizado usando meios adipogênicos brancos ou beges resultou na formação de tecido adiposo branco ou bege vascularizado, respectivamente, a partir das MVFs derivadas de roedores.A capacidade das MVFs de se diferenciarem em tecido adiposo bege foi geneticamente confirmada usando RT-qPCR. MVFs de roedores magros e diabéticos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges foram avaliados quanto à adipogênese, termogênese e angiogênese. A expressão da proteína desacopladora 1, como esperado, foi significativamente maior no tecido adipogênico bege.Uma tendência semelhante foi observada em MVFs de roedores expostos a meios adipogênicos brancos ou beges indiretos, bem como em MVFs humanos expostos a meios adipogênicos brancos diretos ou beges. Por fim, a partir da bioenergética mitocondrial, ficou evidente que, funcionalmente, o tecido adiposo bege apresentou taxa de consumo de oxigênio caracteristicamente mais elevada, ou OCR, em todos os casos. A digestão enzimática do tecido adiposo deve ser otimizada para reproduzir consistentemente MVFs de tamanho e qualidade semelhantes.Após a digestão, os MVFs devem ser manuseados suavemente, com cuidado especial para evitar a quebra dos fragmentos. Essa técnica auxiliou no equilíbrio do crescimento vascular e na diferenciação dos adipócitos, comprovadamente dependentes dos fatores introduzidos.

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