Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
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这项研究是与巴斯夫美容护理解决方案合作完成的。Charlie Colin-Pierre女士是巴斯夫/CNRS资助的博士研究员。
我们要感谢Mehdi Sellami先生构思3D打印插件。

注意：3D插入物（图1A）是商业采购的，并使用与细胞培养和高压灭菌具有生物相容性的光敏聚合物树脂进行打印（参见 材料表）。在本节中，描述了通过插入片段建立共培养模型的详细协议（见 图1B）。还提供了一些应用程序示例。
1. 将灭菌插入物放置在 6 孔板中
<ol><li>根据制造商的说明，以10：1（v /...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

通常使用条件培养基或共培养系统设备研究间接细胞通讯。在实验的上游，条件培养基制备非常耗时，并且该方法仅限于单侧效应分析。科林-皮埃尔等人的先前研究。使用条件培养基对两种细胞类型（HDMEC和KORS）之间的间接细胞通讯进行了8次。先前研究的数据证明了KORS条件培养基对HDMEC增殖的影响以及KORS条件培养基对HDMEC迁移，假管形成和GPC1表达的影响</su...

在体内，细胞直接（细胞接触）或间接（通过分子分泌）相互交流。为了研究细胞通讯，可以开发不同的共培养模型，例如直接共培养（不同的细胞类型在同一孔中直接相互作用）和区室共培养（不同的细胞类型在培养系统的不同隔室中间接相互作用）1。此外，条件培养基可用于共培养系统，其中间接相互作用是通过将效应细胞类型的条件培养基中包含的分泌分子转移到1型应答细胞来实现的。
在旁分泌细胞通讯研究的情况下，间接共培养系统提供了强烈反映体内细胞相互作用的模型。间接共培养系统已经开发并商业化，允许建立间接共培养模式2,3。不幸的是，大多数间接共培养系统仅提供两个隔室。其他间接共培养系统提供多个隔室，但与本手稿中报告的系统相比，它们的可扩展性较差。其中一些不允许在显微镜下进行经典的可视化，并且它们通常提供特定的应用方法。在几项研究中，不同细胞类型之间的旁分泌通讯由条件培养基模型4,5,6,7探测。与间接共培养系统相比，这是一种更简单的研究方法，因为它不需要建立特定的方法或材料1.另一方面，条件培养基的制备非常耗时，并且仅提供有关单向细胞信号传导（效应器到应答器）的信息1。
在本文中，提出了一种新的、简单的研究细胞通讯的方法。打印的插入物允许以直接或间接相互作用以及2D或3D格式组合多种细胞类型，为轻松建立共培养模型提供了许多优势。适合放置在6孔板的孔中，3D打印插入物是圆形的，可以将孔分成四个隔室（两个大隔室和两个小隔室; 图1A）。3D打印插件的特点是没有底部。因此，细胞与放置插入物的板直接接触。此外，每个隔间都可以独立于其他隔间进行涂层。此外，在光学显微镜下可以轻松跟踪细胞行为。插入物每壁中存在通信窗口，允许在最佳时间添加公共培养基以执行不同的共培养实验。可以进行多种共培养组合，以研究几种细胞类型之间的直接和/或间接通讯。例如，可以设计单层和/或3D（球状体）中四种不同细胞类型之间的间接共培养模型。直接和间接共培养模型的组合也可以通过在同一隔室中混合不同的细胞类型来进行。复杂结构（类器官、组织外植体等）对不同细胞类型的影响可能是可以建立模型的另一个例子。此外，3D打印插入片段与细胞生物学功能测定（增殖，迁移，假管形成，分化等）和生物化学测试（提取DNA，RNA，蛋白质，脂质等）兼容。最后，3D打印的插入物提供了广泛的共培养模型实验方案，可以在不同隔室的同一实验中同时组合不同的测定。
提出了3D打印插入物的一些容量，以验证它们是否是一种快速且易于使用的共培养模型。与先前发表的关于旁分泌细胞通讯的研究相比，3D打印插入物能够成为有价值的共培养模型。为了评估这一点，比较了3D打印插入系统和使用条件培养基的经典系统之间的角质形成细胞对内皮细胞增殖和迁移的调节。与使用条件介质的传统系统相比，3D打印的插入物可以快速获得类似的结果。事实上，3D打印的插入物提供了一个强大的模型来研究两个方向的细胞相互作用，而无需产生条件培养基，并且有可能在同一实验中并行进行增殖和迁移测定。
最后，本文提出了一种新的、即用型的细胞通讯研究模型。3D打印插入片段与所有贴壁细胞类型兼容，允许进行多种共培养组合，旨在更接近 体内 条件。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

不同细胞类型之间间接通讯的经典分析需要使用条件培养基。此外，条件培养基的生产仍然耗时，并且远离生理和病理条件。尽管市场上有几种共培养模型，但它们仍然仅限于特定的测定，并且主要用于两种类型的细胞。 
在这里，使用了与多种功能测定兼容的3D打印插入物。插入物允许将 6 孔板的一个孔分离成四个隔室。可以设置多种组合。此外，在隔室的每个壁上都设计了窗口，以便在培养基中以体积依赖性的方式在每个隔间之间实现潜在的细胞间通信。例如，可以在单层、3D（微球）或两者结合的四种细胞类型之间研究旁分泌细胞间通讯。此外，可以将不同细胞类型的混合物以2D或3D（类器官）格式接种在同一隔室中。3D打印插入物中没有底部，因此可以在板上进行通常的培养条件，在包含插入物的板上进行可能的涂层，并通过光学显微镜直接可视化。多个隔室提供了独立收集不同细胞类型的可能性，也可以在每个隔室中使用不同的试剂进行RNA或蛋白质提取。在这项研究中，提供了使用新的3D打印插入物作为共培养系统的详细方法。为了证明这种灵活而简单的模型的几种能力，在新的3D打印插入物中进行了先前发表的细胞通讯功能测定，并被证明是可重复的。3D打印插入物和使用条件培养基的传统细胞培养物导致了类似的结果。总之，3D打印插入物是一种简单的设备，可以适应与贴壁细胞类型的多种共培养模型。

在这项工作中，描述了一种优化的共培养系统，以通过使用条件培养基获得与传统方法相当的稳健、可靠和重要的数据。3D打印插入物通过克服实验上游条件培养基的困难和耗时的生产，模拟不同细胞类型相互作用的体内微环境条件。先前发表的一项研究已被重新进行，以分析毛囊中存在的两种细胞类型之间的间接相互作用：人微血管内皮细胞（HDMECs）和人外根鞘角质形成细胞（KORS）<sup cl...

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An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

在本文中，提出了一种新设计的3D打印插入物作为共培养模型，并通过研究内皮细胞和角质形成细胞之间的旁分泌细胞间通讯进行了验证。

创新的 3D 打印插入物，旨在实现简单的 2D 和 3D 细胞培养

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

该协议可用于研究许多培养研究，并为研究直接细胞通讯提供新工具。这种新设备节省了建立培养模型的大量时间，并且适用于是否需要特定涂层的不同细胞类型。事实上，3D打印插入物的四个隔室允许以单层或以相同的方式以不同的组合培养不同的细胞类型。3D打印的插入物更耐用，灵活，可扩展，可用于设计生理病理学研究的实验模型，例如免疫学或雄激素生成。首先，根据制造商的说明，使用70%乙醇灭菌刮刀，以10：1的比例混合试剂盒中提供的两种成分，食品硅和催化剂。用镊子将嵌件涂在硅胶混合物上，使混合物均匀分布在嵌件的底部边缘。将插入物放入六孔板的孔中并施加温和的压力，以确保插入物与板紧密接触，以避免细胞培养基泄漏。将板置于37摄氏度以支持硅的凝固过程一小时。凝固后，将板浸入70%乙醇浴中30分钟至1小时，用插入物对板进行灭菌。接下来，通过移液丢弃酒精，让板在细胞培养罩中干燥过夜。为了培养外根鞘和人真皮微血管内皮细胞的角质形成细胞，从烧瓶中弃去培养基并加入五毫升胰蛋白酶以分离细胞。将装有外根鞘角质形成细胞的烧瓶与5%二氧化碳一起置于37摄氏度下5分钟，并将含有人真皮微血管内皮细胞的烧瓶在室温下孵育5分钟。在15毫升无菌锥形管中，将含有外根鞘角质形成细胞的胰蛋白酶溶液与补充有5%FBS和生长因子的5毫升间充质干细胞培养基混合，将人真皮微血管内皮细胞与补充有5%FBS和生长因子的5毫升内皮细胞培养基混合。在室温下以200G离心外根鞘和人真皮微血管内皮细胞悬浮液的角质形成细胞5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于两毫升各自的培养基中。将10微升细胞悬液与10微升台盼蓝染料混合，并将10微升混合物加入计数载玻片的腔室中。将计数玻片插入细胞计数系统并检测细胞数量和活力。在相应培养基中以每毫升50， 000个细胞的浓度制备细胞悬液后，用移液管将800微升至1毫升的细胞悬液分配到各个大隔室中，并将100至150微升分配到各个小隔室中。参见补充有5%FBS和生长因子的间充质干细胞培养基中的角质形成细胞以及内皮细胞培养基中的人真皮微血管内皮细胞，在小区室和其他大隔室中补充5%FBS和生长因子。将细胞培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳下，或在通常条件下，以使细胞粘附和/或成熟。使用移液管清空插入物不同隔室的培养基。然后在大隔室中用一毫升37摄氏度的温PBS冲洗细胞，在小隔室中用200微升冲洗细胞。加入三毫升选定适用于所有细胞类型的常用培养基。将含有共培养物的板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下 24 至 48 小时。使用胰蛋白酶分离细胞进行细胞悬液计数，并使用台盼蓝染色检查活力。观察形态后，在孵育24至48小时后，在光学显微镜下计算实验期间不同隔室的细胞数。首先，在实验结束时通过轻微扭转从六孔板上取出插入物，然后通过将其拉下从插入物中取出硅。用常规细胞培养洗涤剂和清洁材料清洗插入物。然后将插入物消毒以备将来在高压灭菌器中使用，或将它们浸入70%乙醇浴中一小时。比较表型和细胞活力，在六个孔板的孔中观察到90%的活力，在外根鞘角质形成细胞的3D打印插入物中观察到91%的活力。在六孔板的孔中，人真皮微血管内皮细胞的活力为85%，而在3D打印插入物中为86%。3D打印插入物中角质形成细胞和内皮细胞之间的间接细胞通讯表明，在插入物中存在角质形成细胞的情况下，与对照组相比，人真皮微血管内皮细胞的增殖在24小时后显着增加1.5倍，48小时后显着增加3.1倍。然而，外根鞘条件培养基的角质形成细胞在24小时后显着增加人真皮微血管内皮细胞增殖1.5倍，48小时后增加2.1倍。测试了3D打印插入物共培养模型，以确定角质形成细胞对人真皮微血管内皮细胞迁移的影响。在对照条件下，内皮细胞迁移并在24小时后覆盖约44%的伤口区域。在角质形成细胞存在的情况下，观察到人真皮微血管内皮细胞迁移显着增加，这表明分别在3,12和24小时后覆盖了43%67%和99%的伤口区域。同样，HDMEC的迁移在外根鞘条件培养基的角质形成细胞的存在下增加。确保插入物密封到板上至关重要，以防止细胞培养基从一个隔室泄漏到另一个隔室。可以进行多种应用，例如增殖，迁移，镇静剂形成测定DNA，RNA，蛋白质和其他分析。

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