Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
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Cette étude a été réalisée en collaboration avec BASF Beauty Care Solutions. Mme Charlie Colin-Pierre est doctorante financée par BASF et le CNRS.
Nous tenons à remercier M. Mehdi Sellami pour la conception des inserts imprimés en 3D.

REMARQUE : Les inserts 3D (Figure 1A) sont achetés dans le commerce et sont imprimés à l’aide d’une résine photopolymère biocompatible avec la culture cellulaire et l’autoclavage (voir le tableau des matériaux). Dans cette section, un protocole détaillé pour établir le modèle de co-culture par inserts est décrit (voir la figure 1B). Quelques exemples d’applications sont également fournis.
1. ...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

La communication cellulaire indirecte est couramment étudiée à l’aide de milieux conditionnés ou de dispositifs de système de co-culture. La préparation des milieux conditionnés prend beaucoup de temps en amont des expériences, et cette méthode est limitée à des analyses unilatérales des effets. L’étude précédente de Colin-Pierre et al.8 à l’aide de milieux conditionnés a été menée sur la communication cellulaire indirecte entre deux types de cellules (HDMECs et ...

In vivo, les cellules communiquent entre elles soit directement (contact cellulaire), soit indirectement (par sécrétion de molécules). Pour étudier la communication cellulaire, différents modèles de co-culture peuvent être développés, tels que la co-culture directe (les différents types de cellules sont en interaction directe dans le même puits) et la co-culture compartimentée (les différents types de cellules sont en interaction indirecte dans différents compartiments d’un système de culture)1. De plus, les milieux conditionnés peuvent être utilisés pour les systèmes de co-culture, où l’interaction indirecte est rendue possible par le transfert de molécules sécrétées contenues dans le milieu conditionné d’un type de cellule effectrice à une cellule répondeusede type 1.
Dans le cas des études de communication cellulaire paracrine, les systèmes de co-culture indirecte fournissent des modèles qui reflètent fortement les interactions cellulaires in vivo. Des systèmes de co-culture indirecte ont été développés et commercialisés, permettant la mise en place de modèles de co-culture indirecte 2,3. Malheureusement, la plupart des systèmes de co-culture indirecte ne comportent que deux compartiments. D’autres systèmes de co-culture indirecte offrent plusieurs compartiments, mais ils sont moins évolutifs que le système décrit dans le présent manuscrit. Certains d’entre eux ne permettent pas une visualisation classique au microscope, et ils présentent souvent des méthodes d’application spécifiques. Dans plusieurs études, la communication paracrine entre différents types de cellules est sondée par le modèle de milieu conditionné 4,5,6,7. Il s’agit d’une méthode d’investigation plus facile par rapport aux systèmes de co-culture indirects, car elle ne nécessite pas de méthodes ou de matériaux spécifiques pour être établie1. D’autre part, la préparation des milieux conditionnés prend du temps et ne fournit des informations que sur la signalisation cellulaire unidirectionnelle (effecteur à répondeur)1.
Dans cet article, une nouvelle façon simple d’étudier la communication cellulaire est proposée. Permettant la combinaison de plusieurs types de cellules en interaction directe ou indirecte et dans des formats 2D ou 3D, les inserts imprimés présentent de nombreux avantages pour mettre en place facilement des modèles de co-culture. Adapté pour être placé dans les puits de plaques de 6 puits, l’insert imprimé en 3D est circulaire et permet de séparer le puits en quatre compartiments (deux grands compartiments et deux petits compartiments ; Graphique 1A). Les inserts imprimés en 3D se caractérisent par l’absence de fond. Ainsi, les cellules sont en contact direct avec la plaque sur laquelle l’insert est placé. De plus, chaque compartiment peut être revêtu indépendamment des autres. De plus, le comportement des cellules peut être facilement suivi au microscope optique. La présence de fenêtres de communication dans chaque paroi de l’insert permet l’ajout, au moment optimal, d’un support commun pour réaliser différentes expériences de co-culture. De nombreuses combinaisons de co-culture peuvent être réalisées pour étudier la communication directe et/ou indirecte entre plusieurs types de cellules. Par exemple, un modèle de co-culture indirecte entre quatre types de cellules différentes en monocouche et/ou en 3D (sphéroïdes) peut être conçu. Une combinaison de modèles de co-culture directe et indirecte peut également être réalisée en mélangeant différents types de cellules dans le même compartiment. L’effet de structures complexes (organoïdes, explants de tissus, etc.) sur différents types de cellules pourrait être un autre exemple de modèles qui peuvent être réalisés. De plus, les inserts imprimés en 3D sont compatibles avec les tests fonctionnels de biologie cellulaire (prolifération, migration, formation de pseudotubes, différenciation, etc.) et avec les tests de biochimie (extraction d’ADN, d’ARN, de protéines, de lipides, etc.). Enfin, les inserts imprimés en 3D offrent un large éventail de schémas expérimentaux de modèles de co-culture avec la possibilité de combiner simultanément différents tests dans la même expérience dans les différents compartiments.
Certaines capacités des inserts imprimés en 3D sont présentées pour les valider en tant que modèle de co-culture rapide et facile à utiliser. Par rapport à une étude précédemment publiée sur la communication des cellules paracrines, la capacité des inserts imprimés en 3D à être un modèle de co-culture précieux est démontrée. Pour évaluer ce point, la régulation de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales par les kératinocytes a été comparée entre le système d’insertion imprimé en 3D et le système classique utilisant des milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D permettent d’obtenir rapidement des résultats similaires par rapport au système conventionnel utilisant des supports conditionnés. En effet, les inserts imprimés en 3D fournissent un modèle robuste pour étudier les interactions cellulaires dans les deux sens sans avoir besoin de produire des milieux conditionnés et avec la possibilité d’effectuer en parallèle les tests de prolifération et de migration dans la même expérience.
Pour conclure, dans cet article, un nouveau modèle prêt à l’emploi pour étudier la communication cellulaire est proposé. Compatibles avec tous les types de cellules adhérentes, les inserts imprimés en 3D permettent d’effectuer de nombreuses combinaisons de co-culture qui visent à se rapprocher des conditions in vivo .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

Les analyses classiques de la communication indirecte entre différents types de cellules nécessitent l’utilisation de milieux conditionnés. De plus, la production de milieux conditionnés reste chronophage et éloignée des conditions physiologiques et pathologiques. Bien que quelques modèles de co-culture soient disponibles dans le commerce, ils restent limités à des tests spécifiques et concernent principalement deux types de cellules. 
Ici, on utilise des inserts imprimés en 3D qui sont compatibles avec de nombreux tests fonctionnels. L’insert permet la séparation d’un puits d’une plaque à 6 puits en quatre compartiments. Un large éventail de combinaisons peut être défini. De plus, des fenêtres sont conçues dans chaque paroi des compartiments de manière à ce que la communication intercellulaire potentielle entre chaque compartiment soit possible dans le milieu de culture d’une manière dépendante du volume. Par exemple, la communication intercellulaire paracrine peut être étudiée entre quatre types de cellules en monocouche, en 3D (sphéroïdes), ou en combinant les deux. De plus, un mélange de différents types de cellules peut être ensemencé dans le même compartiment au format 2D ou 3D (organoïdes). L’absence de fond dans les inserts imprimés en 3D permet les conditions de culture habituelles sur la plaque, un éventuel revêtement sur la plaque contenant l’insert, et une visualisation directe par microscopie optique. Les multiples compartiments offrent la possibilité de collecter différents types de cellules indépendamment ou d’utiliser, dans chaque compartiment, différents réactifs pour l’extraction d’ARN ou de protéines. Dans cette étude, une méthodologie détaillée est fournie pour utiliser le nouvel insert imprimé en 3D comme système de co-culture. Pour démontrer plusieurs capacités de ce modèle flexible et simple, des tests fonctionnels de communication cellulaire précédemment publiés ont été effectués dans les nouveaux inserts imprimés en 3D et se sont avérés reproductibles. Les inserts imprimés en 3D et la culture cellulaire conventionnelle à l’aide de milieux conditionnés ont conduit à des résultats similaires. En conclusion, l’insert imprimé en 3D est un dispositif simple qui peut être adapté à de nombreux modèles de co-cultures avec des types de cellules adhérentes.

Dans le présent travail, un système de co-culture optimisé a été décrit pour obtenir des données robustes, fiables et significatives comparables aux méthodes classiques grâce à l’utilisation de milieux conditionnés. Les inserts imprimés en 3D imitent les conditions du microenvironnement in vivo de différents types de cellules en interaction en surmontant les difficultés et la production fastidieuse de milieux conditionnés en amont des expériences. Une étude précédemment publiée a été reme...

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An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Ce protocole peut être utilisé pour étudier de nombreuses études de culture et fournir un nouvel outil pour étudier la communication cellulaire directe. Ce nouveau dispositif permet de gagner un temps considérable dans l’établissement d’un modèle de culture et est applicable à différents types de cellules nécessitant ou non un enrobage spécifique. En effet, les quatre compartiments des inserts imprimés en 3D, permettent de cultiver différents types de cellules en monocouche, ou en 3D de la même manière avec différentes combinaisons.Les inserts imprimés en 3D sont plus durables, flexibles, évolutifs et peuvent être utilisés pour concevoir des modèles expérimentaux pour l’étude des physiopathologies, telles que l’immunologie ou l’androgenèse. Pour commencer, mélangez les deux composants, le silicium alimentaire et le catalyseur fournis dans le kit dans un rapport de 10 :1, à l’aide d’une spatule stérilisée à l’éthanol à 70% selon les instructions du fabricant. Appliquez les inserts sur le mélange de silicone à l’aide d’une pince à épiler afin que le mélange soit réparti de manière homogène sur le bord inférieur de l’insert.Placez les inserts dans les puits d’une plaque à six puits et appliquez une légère pression pour vous assurer que les inserts sont en contact étroit avec la plaque afin d’éviter toute fuite du milieu de culture cellulaire. Placez la plaque à 37 degrés Celsius pour soutenir le processus de solidification du silicium pendant une heure. Après solidification, stérilisez les plaques avec les inserts en les immergeant dans un bain d’éthanol à 70% pendant 30 minutes à une heure.Ensuite, jetez l’alcool par pipetage et laissez sécher la plaque pendant la nuit dans une hotte de culture cellulaire. Pour cultiver les kératinocytes de la gaine radiculaire externe et des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines, jetez le milieu des flacons et ajoutez cinq millilitres de trypsine pour détacher les cellules. Placez le flacon contenant les kératinocytes de la gaine racinaire externe à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes, et incubez le flacon contenant les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines pendant cinq minutes à température ambiante.Dans un tube conique stérile de 15 millilitres, mélanger la solution de trypsine contenant les kératinocytes de la gaine radiculaire externe avec cinq millilitres de milieu de cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines avec cinq millilitres de milieu de cellules endothéliales supplémentées en 5 % de FBS et de facteurs de croissance. Centrifuger les kératinocytes de la gaine racinaire externe et les suspensions de cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de leurs milieux respectifs.Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de colorant bleu trypan et ajoutez 10 microlitres du mélange dans la chambre de la lame de comptage. Insérez la lame de comptage dans le système de comptage de cellules et détectez le nombre et la viabilité des cellules. Après avoir préparé la suspension cellulaire à une concentration de 50 000 cellules par millilitre dans le milieu respectif, répartissez 800 microlitres à un millilitre de suspension cellulaire dans les grands compartiments individuels et 100 à 150 microlitres dans les petits compartiments individuels avec une pipette.Voir les kératinocytes dans le milieu des cellules souches mésenchymateuses supplémentées en 5% FBS et facteurs de croissance et les cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines dans le milieu des cellules endothéliales, complétées avec 5% FBS et les facteurs de croissance dans les petits et autres grands compartiments. Placez la plaque de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, ou dans les conditions habituelles, pour permettre l’adhésion et/ou la maturation des cellules. Videz les milieux de culture des différents compartiments des inserts à l’aide d’une pipette.Rincez ensuite les cellules avec un millilitre de PBS chaud à 37 degrés Celsius dans les grands compartiments et 200 microlitres dans les petits compartiments. Ajoutez trois millilitres d’un milieu commun sélectionné pour être compatible avec tous les types de cellules. Placez la plaque contenant les co-cultures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures.Détachez les cellules à l’aide de trypsine pour le comptage des suspensions cellulaires et vérifiez la viabilité à l’aide d’une coloration au bleu de trypan. Après avoir observé la morphologie, comptez le nombre de cellules des différents compartiments pendant l’expérience au microscope optique après 24 à 48 heures d’incubation. Tout d’abord, retirez les inserts de la plaque à six puits à la fin de l’expérience en les tournant légèrement, puis retirez le silicium des inserts en le retirant.Lavez les inserts avec des détergents et des produits de nettoyage conventionnels pour cultures cellulaires. Stérilisez ensuite les inserts pour une utilisation ultérieure dans un autoclave, ou en les immergeant dans un bain à 70% d’éthanol pendant une heure. Le phénotype et la viabilité cellulaire ont été comparés, où une viabilité de 90 % a été observée dans les puits des plaques à six puits, et de 91 % dans les inserts imprimés en 3D pour les kératinocytes de la gaine racinaire externe.La viabilité des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines était de 85 % dans les puits de la plaque à six puits, tandis que de 86 % dans les inserts imprimés en 3D. Les communications cellulaires indirectes entre les kératinocytes et les cellules endothéliales dans les inserts imprimés en 3D ont démontré qu’en présence de kératinocytes dans les inserts, la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines augmentait significativement de 1,5 fois après 24 heures, et de 3,1 fois après 48 heures par rapport au témoin. Cependant, il a été démontré que les kératinocytes du milieu de la gaine radiculaire externe augmentaient significativement la prolifération des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines de 1,5 fois après 24 heures et de 2,1 fois après 48 heures.Le modèle de co-culture d’inserts imprimé en 3D a été testé pour déterminer l’effet des kératinocytes sur la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines. Dans la condition témoin, les cellules endothéliales ont migré et ont recouvert environ 44 % de la surface de la plaie après 24 heures. En présence de kératinocytes, une augmentation significative de la migration des cellules endothéliales microvasculaires dermiques humaines a été observée, ce qui montre que 43 %, 67 % et 99 % de la surface de la plaie étaient couverts après trois, 12 et 24 heures respectivement.De même, la migration des HDMECs augmente en présence de kératinocytes du milieu d’état de la gaine racinaire externe. Il est crucial d’assurer l’étanchéité de l’insert à la plaque, afin d’éviter la fuite du milieu des cellules d’un compartiment à l’autre. Plusieurs applications pourraient être faites, telles que la prolifération, la migration, les tests de formation sédative de l’ADN, de l’ARN, des protéines et d’autres analyses.

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Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

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Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...