Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

Studien genomfördes i samarbete med BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre är en BASF/CNRS-finansierad doktorand.
Vi vill tacka Mehdi Sellami för idén till de 3D-printade insatserna.

OBS: 3D-insatserna (Figur 1A) är kommersiellt anskaffade och skrivs ut med ett fotopolymerharts som är biokompatibelt med cellodling och autoklavering (se materialtabellen). I detta avsnitt beskrivs ett detaljerat protokoll för att upprätta samkulturmodellen med hjälp av insatser (se figur 1B). Några exempel på applikationer ges också.
1. Placering av den steriliserade insatsen i 6-hålsplattorna</strong...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

Indirekt cellkommunikation undersöks vanligen med hjälp av betingade medier eller samodlingssystem. Konditionerad medieberedning är tidskrävande uppströms i experimenten, och denna metod är begränsad till ensidiga effektanalyser. Den tidigare studien av Colin-Pierre et al.8 med hjälp av konditionerade medier utfördes på den indirekta cellkommunikationen mellan två celltyper (HDMEC och KORS). Data från denna tidigare studie visade effekten av KORS-konditionerade medier på HDME...

In vivo kommunicerar cellerna med varandra antingen direkt (cellkontakt) eller indirekt (genom utsöndring av molekyler). För att studera cellkommunikation kan olika samodlingsmodeller utvecklas, såsom direkt samodling (de olika celltyperna är i direkt interaktion i samma brunn) och kompartmenterad samkultur (de olika celltyperna är i indirekt interaktion i olika delar av ett odlingssystem)1. Dessutom kan konditionerade medier användas för samodlingssystem, där den indirekta interaktionen möjliggörs av att utsöndrade molekyler som finns i det konditionerade mediet av en effektorcelltyp överförs till en respondercelltyp1.
När det gäller studier av parakrin cellkommunikation ger indirekta samodlingssystem modeller som starkt återspeglar cellinteraktioner in vivo. Indirekta samkultursystem har utvecklats och kommersialiserats, vilket har möjliggjort etablering av indirekta samkulturmodeller 2,3. Tyvärr har de flesta indirekta samkultursystem bara två avdelningar. Andra indirekta samkultursystem tillhandahåller flera avdelningar, men de är mindre skalbara jämfört med det system som rapporteras i detta manuskript. Vissa av dem tillåter inte en klassisk visualisering under mikroskop, och de presenterar ofta specifika applikationsmetoder. I flera studier har den parakrina kommunikationen mellan olika celltyper undersökts med hjälp av den betingade mediemodellen 4,5,6,7. Detta är ett enklare sätt att undersöka jämfört med indirekta samkultursystem eftersom det inte kräver att specifika metoder eller material etableras1. Å andra sidan är beredningen av konditionerade medier tidskrävande och ger endast information om envägscellsignalering (effektor till responder)1.
I denna uppsats föreslås ett nytt, enkelt sätt att undersöka cellkommunikation. Genom att möjliggöra kombination av flera celltyper i direkt eller indirekt interaktion och i 2D- eller 3D-format, ger de tryckta insatserna många fördelar för att enkelt sätta upp samodlingsmodeller. Den 3D-printade insatsen är anpassad för att placeras i brunnarna på 6-brunnsplattor och är cirkulär och gör det möjligt att dela upp brunnen i fyra fack (två stora fack och två små fack; Figur 1A). De 3D-printade insatserna kännetecknas av frånvaron av en botten. Således är cellerna i direkt kontakt med plattan som insatsen är placerad på. Dessutom kan varje fack beläggas oberoende av de andra. Dessutom kan cellens beteende enkelt följas under optiska mikroskop. Närvaron av kommunikationsfönster i varje vägg i insatsen gör det möjligt att vid optimal tidpunkt lägga till ett gemensamt medium för att utföra olika experiment med samkultur. Ett flertal kombinationer av samodling kan utföras för att studera direkt och/eller indirekt kommunikation mellan flera celltyper. Till exempel kan en modell av indirekt samodling mellan fyra olika celltyper i monolager och/eller i 3D (sfäroider) utformas. En kombination av direkta och indirekta samodlingsmodeller kan också utföras genom att blanda olika celltyper i samma fack. Effekten av komplexa strukturer (organoider, vävnadsexplantat, etc.) på olika celltyper kan vara ett annat exempel på modeller som kan göras. Dessutom är de 3D-printade insatserna kompatibla med cellbiologiska funktionella analyser (proliferation, migration, pseudorörsbildning, differentiering, etc.) och med biokemiska tester (extraktion av DNA, RNA, protein, lipider, etc.). Slutligen ger de 3D-printade insatserna ett brett utbud av experimentella scheman av samodlingsmodeller med möjlighet att kombinera samtidigt olika analyser i samma experiment i de olika facken.
En del av kapaciteten hos de 3D-printade insatserna presenteras för att validera dem som en snabb och lättanvänd samodlingsmodell. I jämförelse med en tidigare publicerad studie utförd på parakrin cellkommunikation visas de 3D-printade inläggens förmåga att vara en värdefull samodlingsmodell. För att bedöma denna punkt jämfördes regleringen av endotelcellsproliferation och migration av keratinocyter mellan det 3D-printade insatssystemet och det klassiska systemet med konditionerade medier. De 3D-printade insatserna gör det möjligt att snabbt uppnå liknande resultat jämfört med det konventionella systemet med konditionerade medier. Faktum är att de 3D-printade insatserna ger en robust modell för att studera cellinteraktioner i båda riktningarna utan att behöva producera konditionerade medier och med möjlighet att parallellt utföra proliferations- och migrationsanalyserna i samma experiment.
Avslutningsvis föreslås i denna artikel en ny och färdig modell för att studera cellkommunikation. De 3D-printade insatserna är kompatibla med alla vidhäftande celltyper och gör det möjligt att utföra många kombinationer av samodling som syftar till att vara närmare in vivo-förhållanden .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

De klassiska analyserna av indirekt kommunikation mellan olika celltyper kräver användning av betingade medier. Dessutom är produktionen av konditionerade medier fortfarande tidskrävande och långt ifrån fysiologiska och patologiska tillstånd. Även om ett fåtal modeller av samodling är kommersiellt tillgängliga, är de fortfarande begränsade till specifika analyser och är främst för två typer av celler. 
Här används 3D-printade insatser som är kompatibla med många funktionella analyser. Insatsen gör det möjligt att separera en brunn i en 6-hålsplatta i fyra fack. Ett brett utbud av kombinationer kan ställas in. Dessutom är fönster utformade i varje vägg i facken så att potentiell intercellulär kommunikation mellan varje fack är möjlig i odlingsmediet på ett volymberoende sätt. Till exempel kan parakrin intercellulär kommunikation studeras mellan fyra celltyper i monolager, i 3D (sfäroider) eller genom att kombinera båda. Dessutom kan en blandning av olika celltyper sås i samma fack i 2D- eller 3D-format (organoider). Frånvaron av en botten i de 3D-printade insatserna möjliggör de vanliga odlingsförhållandena på plattan, möjlig beläggning på plattan som innehåller insatsen och direkt visualisering genom optisk mikroskopi. De många facken gör det möjligt att samla in olika celltyper oberoende av varandra eller att i varje fack använda olika reagenser för RNA- eller proteinextraktion. I denna studie ges en detaljerad metodik för att använda den nya 3D-printade insatsen som ett samodlingssystem. För att demonstrera flera kapaciteter hos denna flexibla och enkla modell utfördes tidigare publicerade funktionella analyser av cellkommunikation i de nya 3D-printade insatserna och visade sig vara reproducerbara. De 3D-printade insatserna och den konventionella cellodlingen med konditionerade medier ledde till liknande resultat. Sammanfattningsvis är den 3D-printade insatsen en enkel enhet som kan anpassas till många modeller av samkulturer med vidhäftande celltyper.

I detta arbete beskrevs ett optimerat samkultursystem för att erhålla robusta, tillförlitliga och signifikanta data jämförbara med klassiska metoder genom användning av betingade medier. De 3D-printade insatserna efterliknar mikromiljöförhållandena in vivo hos olika celltyper i interaktion genom att övervinna svårigheterna och den tidskrävande produktionen av konditionerade medier uppströms i experimenten. En tidigare publicerad studie har genomförts på nytt för att analysera de indirekta interak...

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

I denna artikel presenteras en nydesignad 3D-printad insats som en modell för samodling och valideras genom studier av den parakrina intercellulära kommunikationen mellan endotelceller och keratinocyter.

En innovativ 3D-printad insats som är utformad för att möjliggöra enkla 2D- och 3D-cellkulturer

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Detta protokoll kan användas för att undersöka många odlingsstudier och ge ett nytt verktyg för att undersöka direkt cellkommunikation. Denna nya enhet sparar mycket tid vid etablering av en odlingsmodell och är tillämplig på olika celltyper som kräver en specifik beläggning eller inte. Faktum är att de fyra facken i de 3D-printade insatserna gör det möjligt att odla olika celltyper i monolager, eller i 3D på samma sätt med olika kombinationer.De 3D-printade insatserna är mer hållbara, flexibla, skalbara och kan användas för att designa experimentella modeller för studier av fysiopatologier, såsom immunologi eller androgenes. Till att börja med, blanda de två komponenterna, matkisel och katalysator som medföljer i satsen i förhållandet 10:1, med en 70% etanolsteriliserad spatel enligt tillverkarens instruktioner. Applicera insatserna på silikonblandningen med en pincett så att blandningen fördelas homogent vid insatsens nedre kant.Placera insatserna i brunnarna på en platta med sex brunnar och tryck försiktigt för att säkerställa att insatserna är i nära kontakt med plattan för att undvika läckage av cellodlingsmediet. Sätt plattan vid 37 grader Celsius för att stödja stelningsprocessen av kislet i en timme. Efter stelning, sterilisera plattorna med insatserna genom att sänka ner dem i ett 70% etanolbad i 30 minuter till en timme.Kassera sedan alkoholen genom pipettering och låt plattan torka över natten i en cellodlingshuva. För att odla keratinocyterna i den yttre rotskidan och humana dermala mikrovaskulära endotelceller, kassera mediet från kolvarna och tillsätt fem milliliter trypsin för att lossa cellerna. Placera kolven med keratinocyterna i den yttre rotskidan vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid i fem minuter och inkubera kolven som innehåller de humana dermala mikrovaskulära endotelcellerna i fem minuter vid rumstemperatur.I ett 15 ml sterilt koniskt rör, blanda trypsinlösningen som innehåller keratinocyterna i den yttre rotskidan med fem milliliter mesenkymalt stamcellsmedium kompletterat med 5%FBS och tillväxtfaktorer och humana dermala mikrovaskulära endotelceller med fem milliliter endotelcellsmedium kompletterat med 5%FBS och tillväxtfaktorer. Centrifugera keratinocyterna i det yttre rotskidan och de humana dermala mikrovaskulära endotelcellssuspensionerna vid 200 G i fem minuter vid rumstemperatur. Efter att ha kasserat supernatanten, återsuspendera cellerna i två milliliter av deras respektive medier.Blanda 10 mikroliter av cellsuspensionen med 10 mikroliter trypanblått färgämne och tillsätt 10 mikroliter av blandningen i räkneglasets kammare. Sätt in räkneglaset i cellräkningssystemet och upptäck cellnumret och livskraften. Efter beredning av cellsuspensionen i en koncentration av 50 000 celler per milliliter i respektive medium, fördela 800 mikroliter till en milliliter av cellsuspensionen i de enskilda stora facken och 100 till 150 mikroliter i de enskilda små facken med en pipett.Se keratinocyterna i mesenkymalt stamcellsmedium kompletterat med 5%FBS och tillväxtfaktorer och humana dermala mikrovaskulära endotelceller i endotelcellsmedium, kompletterat med 5%FBS och tillväxtfaktorer i de små och andra stora facken. Placera cellodlingsplattan vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid, eller under vanliga förhållanden, för att möjliggöra cellvidhäftning och/eller mognad. Töm odlingsmediet på de olika facken i insatserna med en pipett.Skölj sedan cellerna med en milliliter 37 grader Celsius varm PBS i de stora facken och 200 mikroliter i de små facken. Tillsätt tre milliliter av ett vanligt medium som valts ut för att vara kompatibelt för alla celltyper. Placera plattan med samkulturerna vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid i 24 till 48 timmar.Lossa cellerna med trypsin för cellsuspensionsräkning och kontrollera livskraften med trypanblå färgning. Efter att ha observerat morfologin, räkna cellantalet i de olika facken under experimentet under ett optiskt mikroskop efter 24 till 48 timmars inkubation. Ta först bort insatserna från plattan med sex brunnar i slutet av experimentet genom en liten vridning och ta sedan bort kiseln från insatserna genom att dra av den.Tvätta insatserna med konventionella cellodlingsrengöringsmedel och rengöringsmedel. Sterilisera sedan insatserna för framtida användning i en autoklav eller genom att sänka ner dem i ett 70-procentigt etanolbad i en timme. Fenotypen och cellviabiliteten jämfördes, där 90 % viabilitet observerades i brunnarna på de sex brunnsplattorna och vid 91 % observerades i de 3D-printade insatserna för keratinocyter i den yttre rotskidan.Livsdugligheten hos humana dermala mikrovaskulära endotelceller var 85 % i brunnarna på de sex brunnsplattorna, medan 86 % i de 3D-printade insatserna. Den indirekta cellkommunikationen mellan keratinocyter och endotelceller i de 3D-printade insatserna visade att i närvaro av keratinocyter i inläggen ökade de humana dermala mikrovaskulära endotelcellernas proliferation signifikant med 1,5 gånger efter 24 timmar och med 3,1 gånger efter 48 timmar jämfört med kontrollgruppen. Keratinocyten i det yttre rothöljets konditionsmedium visade sig dock signifikant öka human dermal mikrovaskulär endotelcellsproliferation med 1,5 gånger efter 24 timmar och med 2,1 gånger efter 48 timmar.Den 3D-printade insert-co-kulturmodellen testades för att bestämma effekten av keratinocyter på human dermal mikrovaskulär endotelcellsmigration. Under kontrollbetingelsen migrerade endotelcellerna och täckte cirka 44 % av sårområdet efter 24 timmar. I närvaro av keratinocyter observerades en signifikant ökning av human dermal mikrovaskulär endotelcellsmigration, vilket visar att 43 %67 % och 99 % av sårområdet täcktes efter tre, 12 respektive 24 timmar.På samma sätt ökar migrationen av HDMEC i närvaro av keratinocyter i det yttre rothöljets konditionsmedium. Det är avgörande att säkerställa tätningen av insatsen mot plattan för att förhindra läckage av cellmediet från ett fack till ett annat. Flera tillämpningar kan göras, såsom proliferation, migration, sedativbildningsanalyser DNA, RNA, protein och annan analys.

Research

JoVE Journal

Biology

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES-cellerna neuroepiteliala cellkulturer

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Mus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) kulturer

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Tillverkning och drift av en Oxygen Insats för Vidhäftande cellodlingar

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metod för Exosome Kvantifiering och storlek Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

En effektiv och flexibel cell Aggregation Metod för 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Inrättandet av en extracellulär sura pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

En 3D-utskriven pollenfälla för humlor(Bombus) Hive-ingångar

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strömlinjeformad intravital avbildningsmetod för långtidsövervakning av epitelvävnadsdynamik på ett inverterat konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...