Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

Bu çalışma BASF Beauty Care Solutions ile işbirliği içinde yapılmıştır. Charlie Colin-Pierre, BASF /CNRS tarafından finanse edilen bir doktora bursiyeridir.
Sayın Mehdi Sellami'ye 3D baskılı eklerin konsepti için teşekkür etmek istiyoruz.

NOT: 3D ekler (Şekil 1A) ticari olarak temin edilir ve hücre kültürü ve otoklavlama ile biyouyumlu bir fotopolimer reçine kullanılarak basılır (Malzeme Tablosuna bakın). Bu bölümde, eklerle ko-kültür modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır (bkz. Şekil 1B). Bazı uygulama örnekleri de verilmiştir.
1. Sterilize edilmiş ek parçanın 6 oyuklu plakalara yerleştirilm...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

Dolaylı hücre iletişimi genellikle koşullu ortam veya ko-kültür sistemi cihazları kullanılarak araştırılır. Şartlandırılmış ortam hazırlama, deneylerde yukarı yönde zaman alıcıdır ve bu yöntem tek taraflı etki analizleriyle sınırlıdır. Colin-Pierre ve arkadaşları tarafından yapılan önceki çalışma.8 şartlandırılmış ortam kullanılarak, iki hücre tipi (HDMEC'ler ve KORS) arasındaki dolaylı hücre iletişimi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu ?...

İn vivo olarak, hücreler birbirleriyle doğrudan (hücre teması) veya dolaylı olarak (moleküllerin salgılanmasıyla) iletişim kurar. Hücre iletişimini incelemek için, doğrudan ko-kültür (farklı hücre tipleri aynı kuyuda doğrudan etkileşim halindedir) ve bölümlere ayrılmış ko-kültür (farklı hücre tipleri bir kültür sisteminin farklı bölmelerinde dolaylı etkileşim içindedir) gibi farklı ko-kültür modelleri geliştirilebilir1. Ayrıca, koşullu ortam, dolaylı etkileşimin, bir efektör hücre tipinin koşullu ortamında bulunan salgılanan moleküllerin bir yanıt veren hücre tip1'e aktarılmasıyla sağlandığı ko-kültür sistemleri için kullanılabilir.
Parakrin hücre iletişim çalışmaları söz konusu olduğunda, dolaylı ko-kültür sistemleri, hücre etkileşimlerini in vivo olarak güçlü bir şekilde yansıtan modeller sağlar. Dolaylı eş-kültür sistemleri geliştirilmiş ve ticarileştirilmiştir, bu da dolaylı eş-kültür modellerinin kurulmasına olanak sağlamıştır 2,3. Ne yazık ki, çoğu dolaylı ko-kültür sistemi sadece iki bölme sağlar. Diğer dolaylı ko-kültür sistemleri çoklu bölmeler sağlar, ancak bu makalede bildirilen sisteme kıyasla daha az ölçeklenebilirler. Bazıları mikroskop altında klasik bir görselleştirmeye izin vermez ve genellikle belirli uygulama yöntemleri sunarlar. Çeşitli çalışmalarda, farklı hücre tipleri arasındaki parakrin iletişim, koşullu ortam modeli 4,5,6,7 ile incelenmiştir. Bu, dolaylı ko-kültür sistemlerine kıyasla daha kolay bir araştırma yöntemidir, çünkü belirli yöntemlerin veya materyallerin oluşturulmasını gerektirmez1. Öte yandan, şartlandırılmış ortamın hazırlanması zaman alıcıdır ve yalnızca tek yönlü hücre sinyalizasyonu (efektörden yanıtlayıcıya) hakkında bilgi sağlar1.
Bu yazıda, hücre iletişimini araştırmak için yeni ve basit bir yol önerilmiştir. Doğrudan veya dolaylı etkileşimde ve 2D veya 3D formatlarında çeşitli hücre tiplerinin kombinasyonuna izin veren basılı ekler, ko-kültür modellerinin kolayca kurulması için çok sayıda avantaj sunar. 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirilmek üzere uyarlanmış olan 3D baskılı ek parça daireseldir ve kuyunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir (iki büyük bölme ve iki küçük bölme; Şekil 1A). 3D baskılı ekler, bir tabanın olmaması ile karakterize edilir. Böylece hücreler, ekin yerleştirildiği plaka ile doğrudan temas halindedir. Ek olarak, her bölme diğerlerinden bağımsız olarak kaplanabilir. Ayrıca, hücre davranışı optik mikroskoplar altında kolayca takip edilebilir. Ek parçanın her duvarında iletişim pencerelerinin varlığı, farklı ortak kültür deneyleri yapmak için ortak bir ortamın en uygun zamanda eklenmesine izin verir. Çeşitli hücre tipleri arasındaki doğrudan ve/veya dolaylı iletişimi incelemek için çok sayıda ko-kültür kombinasyonu gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tabakalı ve/veya 3 boyutlu (sferoidler) dört farklı hücre tipi arasında dolaylı bir ko-kültür modeli tasarlanabilir. Doğrudan ve dolaylı ko-kültür modellerinin bir kombinasyonu, aynı bölmede farklı hücre tiplerinin karıştırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. Karmaşık yapıların (organoidler, doku eksplantı vb.) farklı hücre tipleri üzerindeki etkisi, yapılabilecek modellere başka bir örnek olabilir. Ayrıca, 3D baskılı ekler, hücre biyolojisi fonksiyonel tahlilleri (proliferasyon, migrasyon, psödotüp oluşumu, farklılaşma vb.) ve biyokimya testleri (DNA, RNA, protein, lipitlerin ekstraksiyonu, vb.) ile uyumludur. Son olarak, 3D baskılı ekler, aynı deneyde aynı anda farklı tahlilleri farklı bölmelerde birleştirme imkanı ile çok çeşitli ko-kültür modellerinin deneysel şemalarını sağlar.
3D baskılı eklerin bazı kapasiteleri, bunları hızlı ve kullanımı kolay bir ortak kültür modeli olarak doğrulamak için sunulmuştur. Parakrin hücre iletişimi üzerine daha önce yayınlanmış bir çalışma ile karşılaştırıldığında, 3D baskılı eklerin değerli bir ko-kültür modeli olma yeteneği gösterilmiştir. Bu noktayı değerlendirmek için, keratinositler tarafından endotel hücre proliferasyonunun ve migrasyonunun düzenlenmesi, 3D baskılı insert sistemi ile şartlandırılmış ortam kullanan klasik sistem arasında karşılaştırıldı. 3D baskılı kesici uçlar, şartlandırılmış medya kullanan geleneksel sisteme kıyasla benzer sonuçların hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Gerçekten de, 3D baskılı ekler, şartlandırılmış ortam üretme zorunluluğu olmadan ve aynı deneyde proliferasyon ve migrasyon testlerini paralel olarak gerçekleştirme olasılığı ile her iki yönde hücre etkileşimlerini incelemek için sağlam bir model sağlar.
Sonuç olarak, bu yazıda hücre iletişimini incelemek için yeni ve kullanıma hazır bir model önerilmiştir. Tüm yapışık hücre tipleriyle uyumlu olan 3D baskılı ekler, in vivo koşullara daha yakın olmayı amaçlayan çok sayıda ko-kültür kombinasyonunun gerçekleştirilmesine olanak tanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

Farklı hücre tipleri arasındaki dolaylı iletişimin klasik analizleri, şartlandırılmış ortamların kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, şartlandırılmış ortamın üretimi zaman alıcı ve fizyolojik ve patolojik koşullardan uzak kalmaktadır. Birkaç ko-kültür modeli ticari olarak mevcut olmasına rağmen, bunlar spesifik tahlillerle sınırlı kalır ve çoğunlukla iki tip hücre içindir. 
Burada, çok sayıda fonksiyonel tahlil ile uyumlu 3D baskılı kesici uçlar kullanılmaktadır. Ek parça, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunun dört bölmeye ayrılmasına izin verir. Çok çeşitli kombinasyonlar ayarlanabilir. Ayrıca, bölmelerin her duvarında pencereler tasarlanmıştır, böylece her bölme arasında potansiyel hücreler arası iletişim, kültür ortamında hacme bağlı bir şekilde mümkün olur. Örneğin, parakrin hücreler arası iletişim, tek katmanlı, 3 boyutlu (sferoidler) veya her ikisini birleştirerek dört hücre tipi arasında incelenebilir. Ek olarak, farklı hücre tiplerinin bir karışımı aynı bölmede 2D veya 3D (organoidler) formatında ekilebilir. 3D baskılı eklerde bir tabanın olmaması, plaka üzerinde olağan kültür koşullarına, eki içeren plaka üzerinde olası kaplamaya ve optik mikroskopi ile doğrudan görselleştirmeye izin verir. Çoklu bölmeler, farklı hücre tiplerini bağımsız olarak toplama veya her bölmede RNA veya protein ekstraksiyonu için farklı reaktifler kullanma imkanı sağlar. Bu çalışmada, yeni 3D baskılı eki bir ko-kültür sistemi olarak kullanmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmıştır. Bu esnek ve basit modelin çeşitli kapasitelerini göstermek için, daha önce yayınlanmış hücre iletişiminin fonksiyonel tahlilleri yeni 3D baskılı eklerde gerçekleştirildi ve tekrarlanabilir olduğu gösterildi. 3D baskılı ekler ve şartlandırılmış ortam kullanan geleneksel hücre kültürü benzer sonuçlara yol açtı. Sonuç olarak, 3D baskılı ek, yapışık hücre tiplerine sahip çok sayıda ko-kültür modeline uyarlanabilen basit bir cihazdır.

Bu çalışmada, şartlandırılmış ortamların kullanımı yoluyla klasik yöntemlerle karşılaştırılabilir sağlam, güvenilir ve anlamlı veriler elde etmek için optimize edilmiş bir ko-kültür sistemi tanımlanmıştır. 3D baskılı ekler, deneylerde zorlukların ve zaman alıcı koşullu ortam üretiminin üstesinden gelerek, etkileşim halindeki farklı hücre tiplerinin in vivo mikroçevre koşullarını taklit eder. Saç foliküllerinde bulunan iki hücre tipi arasındaki dolaylı etkileşimler...

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Bu protokol, çok sayıda kültür çalışmasını araştırmak ve doğrudan hücre iletişimini araştırmak için yeni bir araç sağlamak için kullanılabilir. Bu yeni cihaz, bir kültür modeli oluşturmada önemli ölçüde zaman kazandırır ve belirli bir kaplama gerektiren veya gerektirmeyen farklı hücre tiplerine uygulanabilir. Gerçekten de, 3D baskılı eklerin dört bölmesi, farklı hücre tiplerinin tek katmanlı veya 3D olarak farklı kombinasyonlarla aynı şekilde kültürlenmesine izin verir.3D baskılı ekler daha dayanıklı, esnek, ölçeklenebilirdir ve immünoloji veya androjenez gibi fizyopatolojilerin çalışmaları için deneysel modeller tasarlamak için kullanılabilir. Başlamak için, kitte sağlanan iki bileşeni, gıda silikonunu ve katalizörü, üreticinin talimatlarına göre %70 etanol ile sterilize edilmiş bir spatula kullanarak 10:1 oranında karıştırın. Karışımın alt kenarında homojen bir şekilde dağılması için ekleri silikon karışımın üzerine cımbızla uygulayın.Ekleri altı oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin ve hücre kültürü ortamının herhangi bir sızıntısını önlemek için eklerin plaka ile yakın temas halinde olduğundan emin olmak için hafif bir basınç uygulayın. Silikonun katılaşma sürecini bir saat boyunca desteklemek için plakayı 37 santigrat dereceye koyun. Katılaşmadan sonra, plakaları 30 dakika ila bir saat boyunca% 70 etanol banyosuna batırarak eklerle sterilize edin.Ardından, alkolü pipetleyerek atın ve plakayı bir hücre kültürü kapağında gece boyunca kurumaya bırakın. Dış kök kılıfının ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin keratinositlerini kültürlemek için, ortamı şişelerden atın ve hücreleri ayırmak için beş mililitre tripsin ekleyin. Dış kök kılıfının keratinositlerini içeren şişeyi beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirin ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini içeren şişeyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.15 mililitrelik steril konik bir tüpte, dış kök kılıfının keratinositlerini içeren tripsin solüsyonunu% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş beş mililitre mezenkimal kök hücre ortamı ile karıştırın ve insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini% 5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş beş mililitre endotel hücre ortamı ile karıştırın. Dış kök kılıfının keratinositlerini ve insan dermal mikrovasküler endotel hücresi süspansiyonlarını oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri kendi ortamlarının iki mililitresinde yeniden süspanse edin.10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre tripan mavisi boya ile karıştırın ve 10 mikrolitre karışımı sayma slaytının haznesine ekleyin. Sayma slaytını hücre sayma sistemine yerleştirin ve hücre sayısını ve canlılığını tespit edin. Hücre süspansiyonunu ilgili ortamda mililitre başına 50.000 hücre konsantrasyonunda hazırladıktan sonra, 800 mikrolitre ila bir mililitre hücre süspansiyonunu tek tek büyük bölmelere ve 100 ila 150 mikrolitreyi bir pipetle ayrı küçük bölmelere dağıtın.%5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş mezenkimal kök hücre ortamındaki keratinositleri ve endotel hücre ortamındaki insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerini, küçük ve diğer büyük bölmelerde %5 FBS ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş olarak görün. Hücre yapışması ve/veya olgunlaşmasına izin vermek için hücre kültürü plakasını %5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye veya normal koşullar altına yerleştirin. Bir pipet kullanarak eklerin farklı bölmelerinin kültür ortamını boşaltın.Daha sonra hücreleri büyük bölmelerde bir mililitre 37 santigrat derece ılık PBS ve küçük bölmelerde 200 mikrolitre ile durulayın. Tüm hücre tipleri için uyumlu olacak şekilde seçilen ortak bir ortamdan üç mililitre ekleyin. Ko-kültürleri içeren plakayı 24 ila 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirin.Hücre süspansiyonu sayımı için tripsin kullanarak hücreleri ayırın ve tripan mavisi boyamayı kullanarak canlılığı kontrol edin. Morfolojiyi gözlemledikten sonra, 24 ila 48 saatlik inkübasyondan sonra optik mikroskop altında deney sırasında farklı bölmelerin hücre sayısını sayın. İlk olarak, deneyin sonundaki altı oyuklu plakadan ekleri hafif bir bükülme ile çıkarın ve ardından silikonu çekerek eklerden çıkarın.Ekleri geleneksel hücre kültürü deterjanları ve temizlik malzemeleriyle yıkayın. Daha sonra ekleri ileride kullanmak üzere bir otoklavda veya bir saat boyunca% 70 etanol banyosuna batırarak sterilize edin. Fenotip ve hücre canlılığı karşılaştırıldı, burada altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarında %90 canlılık gözlendi ve dış kök kılıfının keratinositleri için 3D baskılı eklerde %91 oranında gözlendi.İnsan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin canlılığı, altı oyuklu plakanın kuyucuklarında %85 iken, 3D baskılı eklerde %86 idi. 3D baskılı eklerdeki keratinositler ve endotel hücreleri arasındaki dolaylı hücre iletişimi, eklerdeki keratinositlerin varlığında, insan dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunun 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 3,1 kat arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, dış kök kılıfı durum ortamının keratinositinin, insan dermal mikrovasküler endotel hücre proliferasyonunu 24 saat sonra 1,5 kat ve 48 saat sonra 2,1 kat önemli ölçüde artırdığı gösterilmiştir.Keratinositlerin insan dermal mikrovasküler endotel hücre göçü üzerindeki etkisini belirlemek için 3D baskılı insert ko-kültür modeli test edildi. Kontrol durumunda, endotel hücreleri göç etti ve 24 saat sonra yara alanının yaklaşık% 44'ünü kapladı. Keratinosit varlığında, insan dermal mikrovasküler endotel hücre göçünde önemli bir artış gözlenmiştir, bu da yara alanının sırasıyla üç, 12 ve 24 saat sonra kaplandığını göstermektedir.Benzer şekilde, HDMEC'lerin göçü, dış kök kılıfı durum ortamının keratinositlerinin varlığında artar. Hücre ortamının bir bölmeden diğerine sızmasını önlemek için, ek parçanın plakaya sızdırmazlığını sağlamak çok önemlidir. Proliferasyon, migrasyon, sedatif oluşum tahlilleri DNA, RNA, protein ve diğer analizler gibi çeşitli uygulamalar yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES Hücre türetilen nöroepitelyal Hücre Kültürleri

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

İmalat ve Operasyon yapışkan Hücresel Kültürler Oksijen Ekle

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

Bombus Arısı (Bombus) Kovan Girişleri için 3D Baskılı Polen Tuzağı

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...