Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة جينيفر زالين على توفير الجسم المضاد الأولي المضاد لخنزير غينيا المضاد ل Par-3. تم دعم هذا العمل بتمويل سخي (1R15GM143729-01 و 1P20GM139768-01 5743) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) ، أحد أعضاء المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، وكذلك معهد أركنساس للعلوم البيولوجية (ABI) ، الذي قدم تمويلا جزئيا لشراء مجهرنا متحد البؤر.

     

<ol>
	<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging.+Expansion+microscopy.">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Chang, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex.">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li><li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons.">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy.">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li><li>Yu, C. -. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+C.+elegans.">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249 (2020).</li><li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies.">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+in+ionic+gels.">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li><li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues.">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila apple juice-agar plates. , (2011).</li><li>de Matos Sim&#245;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+directs+bazooka/Par-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation.">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Par&#233;, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation.">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization.">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li><li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy.">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy.">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li><li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context.">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).</li><li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+revealing:+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures.">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

الانحراف اليدوي تتضمن معظم بروتوكولات تثبيت جنين ذبابة الفاكهة إزالة غشاء فيتيلين عن طريق هز الأجنة الثابتة في مستحلب من الميثانول والهيبتان ، مما يؤدي إلى انفجار الأغشية عن طريق التمزق التناضحي26. في حين أن الانحراف القائم على الميثانول (فرقعة الميثانول) فعال ومناسب للعديد من التطبيقات ، فإن الانحراف اليدوي (التقشير اليدوي) يوفر بعض المزايا المهمة. أولا ، يسمح التقشير اليدوي للمرء باختيار الأجنة المرحلية بدقة لتقسيمها وجمعها ، مما يزيد بشكل كبير من احتمالية الحصول على أجنة موسعة في اتجاه قابل للاستخدام في نهاية التجربة. هذا التخصيب أمر بالغ الأهمية عند دراسة جوانب محددة من عمليات النمو السريع (على سبيل المثال ، غزو الأديم المتوسط أو التمديد المتقارب) ، حيث قد تمثل الأجنة ذات المراحل المناسبة نسبة قليلة فقط من جميع الأجنة ، حتى في نافذة تجميع ضيقة التوقيت. بالطبع ، بالنسبة للعديد من التطبيقات ، سيكون ظهور الميثانول السائب التقليدي للأجنة من نافذة تجميع موقوتة كافيا ، وقد لا يستحق التقشير اليدوي الجهد الإضافي. ثانيا ، يتأثر ارتباط بعض الأجسام المضادة الأولية والأصباغ سلبا بالتعرض السابق للعينة للميثانول. لهذا السبب ، يمكن أن يؤدي التقشير اليدوي إلى زيادات كبيرة في جودة إشارة التألق المناعي مقارنة بالعينات المفرقعة بالميثانول ، مما يجعلها تقنية عامة مفيدة لعلماء الأحياء التنموية في ذبابة الفاكهة .
الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة في أجنة ذبابة الفاكهة الموسعة كاملة التركيب في حين أن إجراء الفحص المجهري متحد البؤر عالي الدقة على العينات الموسعة هو نفسه من الناحية المفاهيمية كما هو الحال في العينات غير الموسعة ، فإن ExM يقدم بعض العقبات الفنية. والجدير بالذكر أن اتجاه الجنين ، وهو عشوائي ، يصبح أكثر أهمية مع زيادة حجم العينة ، لأن الأهداف عالية التكبير وعالية NA قادرة فقط على تركيز الضوء من مناطق العينة القريبة جدا من الغطاء27. لذلك ، عادة ما يكون من الممكن التركيز فقط على الخلايا الموجودة على سطح الجنين أو بالقرب منه والتي انتهى بها الأمر بجوار غطاء الغطاء عند تكوين الجل. أفضل طريقة للتأكد من وجود عينات من الاتجاه الصحيح في النهاية هي بدء بروتوكول ExM بمجموعة محكمة من الأجنة الثابتة (على سبيل المثال ، باستخدام التقشير اليدوي) وزرع العديد من الأجنة في كل بئر (>10). لتصور الخلايا العميقة في داخل الجنين ، قد يكون من الضروري استخدام إعدادات تصوير أكثر تخصصا ، مثل المجهر الضوئي28. بالإضافة إلى ذلك ، نجد أنه يمكن تحسين جودة الصورة عن طريق فتح الثقب البؤري إلى حجم أكبر من وحدة تهوية واحدة. بالطبع ، سيأتي حجم الثقب المتزايد على حساب انخفاض الدقة القصوى ، ولكن من الناحية العملية ، حتى الزيادات الصغيرة في حجم الثقب يمكن أن تعزز بشكل كبير شدة الإشارة (البيانات غير معروضة). يجب أن تتناول الدراسات المستقبلية بشكل منهجي حجم الثقب والدقة الفعالة في عينات ExM.
الاختلافات في ExM الأساسية البروتوكول الموصوف هنا هو مثال بسيط نسبيا على ExM الذي يجب أن يعمل مع العديد من التطبيقات وأن يكون سهل التنفيذ في معظم مختبرات علم الأحياء التنموي. ومع ذلك ، هناك العديد من الاختلافات في المفهوم الأساسي ل ExM4،5،7 والتي يمكن استخدامها لزيادة شدة الإشارة ، وتحقيق درجات أخرى من التوسع ، واكتشاف جزيئات الحمض النووي وكذلك البروتينات. في هذا البروتوكول ، يتم تحضين الأجنة بالأجسام المضادة قبل الهلام والتوسع. بدلا من ذلك ، يمكن معالجة العينات بالأجسام المضادة بعد توسيعها 6,30 ، مما قد يزيد من شدة الإشارة بسبب زيادة إمكانية الوصول إلى الحواتم وتقليل فقدان الأجسام المضادة المرتبطة أثناء خطوات التمدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام جزيئات متشابكة محددة لربط جزيئات الحمض النووي الريبي بالهيدروجيل للسماح باكتشاف الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الموسعة باستخدام طريقة تفاعل سلسلة التهجين30. أخيرا ، يمكن إخضاع العينات لجولات متعددة من التوسع ، كما هو الحال في الفحص المجهري للتمدد التكراري (iExM) 31 ، و pan-ExM32 ، وكشف التمدد (ExR) 31 ، لتحقيق درجات أعلى من الدقة المتزايدة.

في بيولوجيا الخلية والتطور ، الرؤية هي الإيمان ، والقدرة على تحديد أنماط توطين البروتينات بدقة أمر أساسي للعديد من أنواع التجارب. الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر هو الأداة القياسية لتصوير البروتينات ذات العلامات الفلورية في ثلاثة أبعاد داخل عينات سليمة. المجاهر متحدة البؤر التقليدية غير قادرة على تمييز (حل) إشارات الفلورسنت المجاورة التي يفصلها أقل من نصف الطول الموجي للضوء الذي تنبعث منه1. بمعنى آخر ، يجب فصل مصدرين نقطيين بما لا يقل عن 200-300 نانومتر في الاتجاه الجانبي (500-700 نانومتر في الاتجاه المحوري) لحلها كإشارتين متميزتين. يعرف هذا الحاجز التقني باسم حد الحيود ، وهو عقبة أساسية أمام دراسات الهياكل تحت الخلوية المعقدة (على سبيل المثال ، شبكات الهيكل الخلوي أو الميتوكوندريا actomyosin) مع ميزات مكانية أقل من حد الحيود . لذلك ، فإن تقنيات زيادة قوة حل المجاهر متحدة البؤر التقليدية ذات أهمية عامة للمجتمع البيولوجي.
لتجنب حد الحيود ، تم تطوير عدد من تقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة المختلفة التي تسمح بالدقة في حدود عشرات النانومتر أو أقل من 1،2،3 ، مما يكشف عن عالممن التعقيد البيولوجي الذي كان يمكن الوصول إليه سابقا فقط عبر المجهر الإلكتروني. على الرغم من المزايا الواضحة لهذه الأساليب القائمة على الأجهزة ، غالبا ما يكون للمجاهر فائقة الدقة متطلبات محددة لوضع العلامات على العينات وأوقات اكتساب طويلة ، مما يحد من مرونتها ، أو قد تكون ببساطة باهظة الثمن بالنسبة لبعض المختبرات للوصول إليها. بديل للدقة الفائقة القائمة على المجهر هو الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، وهو ليس نوعا من الفحص المجهري في حد ذاته ولكنه بالأحرى طريقة لنفخ العينة مع الحفاظ على التنظيم المكاني النسبي للجزيئات المكونة لها4. يمكن بعد ذلك ملاحظة العينات الموسعة الخواص بدقة متزايدة بشكل فعال باستخدام مجهر متحد البؤر مضان تقليدي. تم وصف ExM لأول مرة من قبل مجموعة Boyden في عام 20155 ، ومنذ ذلك الحين تم تكييف التقنية الأساسية للاستخدام في مجموعة متنوعة من التجارب6،7،8. كما تم تكييف ExM للاستخدام في الأجنة الكاملة ، لا سيما في ذبابة الفاكهة9،10،11 ، C. elegans12 ، و الزرد 13 ، مما يجعلها أداة قوية لعلماء الأحياء التنموية.
يعتمد ExM على اثنين من كيمياء الهيدروجيل المختلفة: 1) الهلاميات المائية متعددة الإلكتروليت القابلة للانتفاخ ، والتي تزداد بشكل كبير في الحجم عند نقعها في الماء14 ، و 2) الهلاميات المائية بولي أكريلاميد ، والتي لها تباعد بوليمر صغير للغاية للسماح بتوسيع عينة الخواص15. في حين أن هناك العديد من بروتوكولات ExM المنشورة ، إلا أنها تشترك بشكل عام في الخطوات التالية: تثبيت العينة ، ووضع العلامات ، والتنشيط ، والهلام ، والهضم ، والتوسع4. ستختلف ظروف التثبيت واستراتيجيات وضع العلامات الفلورية بالطبع بناء على احتياجات التجربة والنظام ، وفي بعض البروتوكولات ، يحدث وضع العلامات بعد التوسع. يجب تحضير (تنشيط) الجزيئات المستهدفة في العينة للارتباط بالهيدروجيل ، والذي يمكن تحقيقه باستخدام مواد كيميائية مختلفة4. أثناء خطوات الهلام ، يتم تشبع العينة بمونومرات هيدروجيل المستقبل (أكريلات الصوديوم ، والأكريلاميد ، وبيساكريلاميد الرابط المتقاطع) ، ثم يتم تشكيل الهيدروجيل عن طريق بلمرة الجذور الحرة التي يحفزها بادئ ، مثل كبريتات الأمونيوم (APS) ، ومسرع ، مثل رباعي ميثيلين ديامين (TEMED) 4. بعد الهلام ، يتم هضم العينة إنزيميا لتجانس مقاومة العينة للتورم وضمان التمدد الخواص للهيدروجيل4. أخيرا ، يتم وضع الهيدروجيل المهضوم في الماء ، مما يؤدي إلى توسيعه إلى ما يقرب من أربعة أضعاف حجمه الخطي الأصلي4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على الفحص المجهري التمددي في أجنة ذبابة الفاكهة . ExM هو بروتوكول متعدد الخطوات يستغرق إكماله 4 أيام على الأقل. جمع الأجنة ، والتثبيت ، و devitellinization يستغرق 1 يوم أو أكثر اعتمادا على ما إذا كان يتم تجميع الأجنة من مجموعات متعددة. يستغرق وضع العلامات المناعية 1 يوم أو 2 أيام اعتمادا على ما إذا كانت الأجنة يتم تحضينها بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية. يمكن إجراء تنشيط الجنين ، والهلام ، والهضم ، والتوسع في يوم واحد. يمكن تركيب المواد الهلامية وتصويرها مباشرة بعد التمدد ، على الرغم من أنه لأسباب عملية غالبا ما يكون من المستحسن بدء التصوير في اليوم التالي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء ExM على أجنة ذبابة الفاكهة كاملة التركيب في وقت مبكر إلى منتصفالمرحلة 16 لتصور أنماط توطين البروتين تحت الخلوي بدقة فائقة (الشكل 1). تستخدم هذه الطريقة كيمياء حمض الميثيل أكريليك N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) لتنشيط جزيئات البروتين وتثبيتها في الهيدروجيل17 ، وهو تعديل لبروتوكول ExM المنشور مسبقا للاستخدام في أجنة وأنسجة ذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة 11. يستخدم هذا البروتوكول آبار polydimethylsiloxane (PDMS) لتشكيل الهلاميات المائية وتسهيل تبادل المحلول أثناء التنشيط والهلام. تتضمن الطريقة البديلة التي لا تتطلب إنشاء آبار PDMS خفض الأجنة المرتبطة بأغطية الأغطية إلى قطرات من محلول المونومر الموجود على قطعة من فيلم ختمالمختبر 22. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لإزالة غشاء vitelline غير المنفذ الذي يحيط بأجنة ذبابة الفاكهة يدويا ، وهو شرط أساسي لتلطيخ التألق المناعي. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام طريقة تقشير الأجنة يدويا لاختيار أجنة ذبابة الفاكهة التي تم تنظيمها بشكل صحيح فقط قبل وضع العلامات على العينات ، مما يزيد بشكل كبير من احتمال أن ينتهي الأمر بعينات موسعة من المرحلة والاتجاه الصحيحين ، وبالتالي ، يجعل جمع البيانات النهائية أكثر كفاءة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

العمود الفقري لعلم الأحياء التنموي هو المجهر متحد البؤر ، والذي يسمح للباحثين بتحديد التوطين ثلاثي الأبعاد للجزيئات الموسومة داخل العينات البيولوجية المعقدة. في حين أن المجاهر التقليدية متحدة البؤر تسمح للمرء بحل مصدرين متجاورين لنقطة الفلورسنت يقعان على بعد بضع مئات من النانومترات ، فإن مراقبة التفاصيل الدقيقة للبيولوجيا تحت الخلوية تتطلب القدرة على حل الإشارات بترتيب عشرات النانومترات. تم تطوير العديد من الطرق القائمة على الأجهزة للفحص المجهري فائق الدقة للسماح للباحثين بتجنب حدود الدقة هذه ، على الرغم من أن هذه الأساليب تتطلب مجاهر متخصصة غير متوفرة لجميع الباحثين. تتمثل إحدى الطرق البديلة لزيادة قوة التحليل في تكبير العينة نفسها بشكل متناحي من خلال عملية تعرف باسم الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، والتي تم وصفها لأول مرة من قبل مجموعة Boyden في عام 2015. ExM ليس نوعا من الفحص المجهري في حد ذاته ولكنه طريقة لنفخ عينة مع الحفاظ على التنظيم المكاني النسبي للجزيئات المكونة لها. يمكن بعد ذلك ملاحظة العينة الموسعة بدقة متزايدة بشكل فعال باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي. هنا ، نصف بروتوكولا لتنفيذ ExM في أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة ، والتي تستخدم لفحص توطين Par-3 و myosin II والميتوكوندريا داخل الخلايا الظهارية السطحية. ينتج عن هذا البروتوكول زيادة تقارب أربعة أضعاف في حجم العينة ، مما يسمح بالكشف عن التفاصيل تحت الخلوية غير المرئية باستخدام الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر. كدليل على المبدأ ، يتم استخدام جسم مضاد مضاد ل GFP لتمييز مجموعات متميزة من الميوسين-GFP بين قشرة الخلايا المجاورة ، ويستخدم الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت للكشف عن جزيئات البيوتينيل الداخلية للكشف عن التفاصيل الدقيقة لبنية شبكة الميتوكوندريا. يستخدم هذا البروتوكول الأجسام المضادة والكواشف الشائعة لوضع العلامات الفلورية ، ويجب أن يكون متوافقا مع العديد من بروتوكولات التألق المناعي الحالية.

لتوصيف الفعالية العامة ل ExM في أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة ، تم قياس طول الجنين على طول المحور من الرأس إلى الذيل في أجنة التحكم غير الموسعة مقابل الأجنة الموسعة (الشكل 3A-C). تعرضت الأجنة الضابطة غير الموسعة لنفس ظروف التثبيت وخطوات وضع العلامات المناعية مثل الأجنة الموسعة، باستثناء أنها تم تركيبها باستخدام وسط تركيب صلب قبل التصوير. امتدت الأجنة الفردية غير الموسعة إلى ما يقرب من نصف مجال الرؤية عند استخدام هدف 10x (الشكل 3 أ). على النقيض من ذلك ، امتدت الأجنة الموسعة إلى مجالين كاملين تقريبا للرؤية عند استخدام نفس الهدف 10x (الشكل 3B). لتقييم كيفية اختلاف درجة التوسع داخل التجارب وفيما بينها ، تم إجراء نفس بروتوكول ExM في ثلاث مناسبات منفصلة ، وتم قياس طول الجنين في ثلاث مواد هلامية مختلفة في كل تجربة فردية. كان متوسط طول الأجنة الضابطة غير الموسعة من الرأس إلى الذيل 398.8 ميكرومتر (الانحراف المعياري [SD] = 22.93 ميكرومتر ؛ ن = 74 ؛ الشكل 3 ج). بالنسبة للتجربة 1 والتجربة 2 والتجربة 3 ، كان متوسط أطوال الأجنة 1,596 ميكرومتر (SD = 159.9 ميكرومتر ؛ ن = 57) ، 1,868 ميكرومتر (SD = 150.5 ميكرومتر ؛ ن = 51) ، و 1,954 ميكرومتر (SD = 120.3 ميكرومتر ؛ ن = 44) ، على التوالي ، وهو ما يمثل عوامل تمدد 4.0 أضعاف و 4.7 أضعاف و 4.9 أضعاف على التوالي (الشكل 3C). كان الاختلاف داخل التجربة بين المواد الهلامية أقل وضوحا بكثير من الاختلاف بين التجارب ، والذي كان حوالي 20 ٪ (الشكل 3C). لتقييم آثار ExM على مورفولوجيا الخلايا والأجنة ، تم استخدام جسم مضاد ضد مكون تقاطع adherens Par-3 (Bazooka) 21 لتسمية أغشية الخلايا القمية ، وقمنا بتصوير أجزاء الفم النامية من أجنة ذبابة الفاكهة في المرحلة 11 - وهي مرحلة ذات بنية مجزأة معقدة (الشكل 3D-F). في عينة التحكم ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 4.76 ميكرومتر (SD = 1.053 μm ، n = 25 ؛ الشكل 3D ، F). في العينات الموسعة المصورة باستخدام نفس الهدف 40x وعامل التكبير (1x) ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 19.10 ميكرومتر (SD = 3.966 μm ، n = 18 ؛ الشكل 3E ، F) ، يمثل توسعا بمقدار 4.0 أضعاف. لذلك ، تمشيا مع التقارير السابقة11 ، تمكنا من توسيع أجنة ذبابة الفاكهة الكاملة التركيب بحوالي أربعة أضعاف في الأبعاد الخطية باستخدام ExM دون تمزق العينة أو تشوهات واضحة في مورفولوجيا الخلايا أو الأنسجة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> الشكل 3: تمدد أجنة ذبابة الفاكهة بمقدار أربعة أضعاف. (أ) أجنة ذبابة الفاكهة غير الموسعة و (ب) الموسعة المصورة باستخدام هدف 10x (0.3 NA) عند تكبير 1x. يشار إلى حقول الرؤية الفردية (FOV) بخطوط متقطعة. عبرت الأجنة عن نسخة موسومة ب GFP من سلسلة ضوء الميوسين وكانت ملطخة بجسم مضاد ل GFP. (ج) التحديد الكمي لطول الجنين (على طول المحور من الرأس إلى الذيل) في ثلاث هلاميات مائية لكل تجربة ومن ثلاث تجارب ExM منفصلة مقارنة بالضوابط غير الموسعة. (د، ه) تم تصوير الأجزاء الفكية من (D) غير الموسعة و (E) الأجنة الموسعة من ذبابة الفاكهة في المرحلة 11 باستخدام هدف 40x (1.3 NA) عند تكبير 1x. تم الكشف عن الخطوط العريضة للخلية (تقاطعات الالتصاق) باستخدام جسم مضاد مضاد Par-3 / Bazooka (أبيض). (و) القياس الكمي لعرض الخلية (المحور الطويل) من مجموعات الخلايا المتكافئة من (د) و(ه). تظهر المخططات المربعة في (C) و (F) النطاقات المئوية 25 و 50 و 75 ؛ تشير الشعيرات إلى القيم الدنيا والقصوى ؛ تشير الرموز "+" إلى المتوسط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لإثبات أنه يمكن استخدام ExM لحل التفاصيل تحت الخلوية تحت حد الحيود النموذجي ، تم تصوير الهيكل الخلوي actomyosin في سيطرة غير موسعة مقابل الأجنة الموسعة التي تخضع لتمديد متقارب (المرحلة 7). يتم التحكم إلى حد كبير في أحداث إعادة تشكيل الأنسجة من المعدة والتمديد المتقارب من خلال التغيرات في توطين البروتين الحركي myosin II24. ومع ذلك ، في الظهارة العمودية المكتظة بكثافة في الأديم الظاهر لذبابة الفاكهة المبكرة ، من الصعب ملاحظة العديد من التفاصيل الدقيقة لنمط توطين الميوسين II ، حتى عند تصويرها بتكبير 158x (هدف 63x مع تقريب بصري 2.5x) - قوة حل قصوى نموذجية لمجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. على سبيل المثال ، نظرا لأن الميوسين الثاني هو بروتين قشري (يقع مباشرة أسفل غشاء البلازما) ، فإن برك الميوسين II25 الموجودة على جانبي ملامسات الخلايا الخلوية لم تكن قابلة للحل في أجنة المرحلة 7 ، وظهرت كخط واحد حيث تلتقي الخلايا المجاورة (الشكل 4 أ). على النقيض من ذلك ، في أجنة المرحلة 7 الموسعة ، يمكن ملاحظة خطوط متوازية من الميوسين II عند تقاطعات الخلايا الخلوية ، والتي تمثل تجمعات البروتين القشري في الخلايا المجاورة (الشكل 4B). كانت المسافة بين خطوط الميوسين II المتوازية في العينات الموسعة 892.7 نانومتر (SD = 0.171 نانومتر ، ن = 12) ؛ عند القسمة على أربعة ، ينتج عن هذا مسافة متوقعة تبلغ ~ 220 نانومتر بين خطوط الميوسين في الخلايا المجاورة في الأجنة غير الموسعة ، وهو في الواقع أقل بقليل من حد الحيود للإشارة المكتشفة باستخدام Alexa 488 (ذروة انبعاث ~ 520 نانومتر / 2 = 260 نانومتر).
بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا أيضا ما إذا كان يمكن استخدام ExM لحل بنية شبكة الميتوكوندريا في الخلايا المعبأة بكثافة من أجنة ذبابة الفاكهة المعدة (المرحلة 6). ترتبط وظيفة الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا ببنية الشبكة (أي العضيات المنصهرة مقابل العضيات المجزأة) ، ولكن من الصعب تصور تفاصيل تنظيم شبكة الميتوكوندريا باستخدام المجهر التقليدي متحد البؤر في أنواع الخلايا غير المسطحة و / أو الرقيقة. الميتوكوندريا غنية بشكل طبيعي بجزيئات البيوتينيل، وبالتالي، يمكن تسمية الميتوكوندريا في جنين ذبابة الفاكهة المبكر باستخدام ستربتافيدين26 المسمى بالفلورسنت. في أجنة المرحلة 6 غير الموسعة الموسومة ب streptavidin-Alexa 488 ، ظهرت الإشارة على شكل نقطية سيتوبلازمية غالبا ما كانت متداخلة ويصعب حلها (الشكل 4C). على النقيض من ذلك ، في أجنة المرحلة 6 الموسعة ، كانت العديد من التفاصيل الدقيقة لشبكة الميتوكوندريا مرئية وكانت النقاط قابلة للحل بسهولة أكبر (الشكل 4D)26,27. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام ExM لدراسة تنظيم شبكة الميتوكوندريا في أنواع الخلايا غير المناسبة تقليديا لتحليل الميتوكوندريا.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> الشكل 4: تفاصيل الهيكل الخلوي للأكتوميوسين والميتوكوندريا التي تم الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري للتمدد. (أ ، ب) توطين الميوسين II في خلايا الأديم الظاهر العصبي (النطاق الجرثومي) المصور بهدف 63x (1.4 NA) عند تكبير 2.5x في المرحلة 7 (A) الأجنة غير الموسعة و (B) الموسعة. تم الكشف عن الميوسين الثاني في الأجنة التي تعبر عن نسخة معدلة وراثيا موسومة ب GFP من سلسلة الضوء التنظيمية للميوسين II (sqh-GFP) ، والتي تم اكتشافها بجسم مضاد ل GFP (أحمر). يمكن حل برك مميزة من الميوسين القشري الموجود في الخلايا المجاورة في الجنين الموسع (الأسهم البيضاء). (ج، د) تم تصوير شبكات الميتوكوندريا في خلايا الأديم الظاهر العصبي بهدف 63× (1.4 NA) عند تكبير 2.5x في المرحلة 6 من الأجنة غير الموسعة (C) والموسعة (D). تم الكشف عن الميتوكوندريا باستخدام streptavidin-Alexa 488 (أخضر) ، وتم الكشف عن الخطوط العريضة للخلية باستخدام جسم مضاد مضاد ل Par-3 / Bazooka (أرجواني). أجريت التجارب باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: وصفات الحل. تكوين الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول بترتيب المظهر. جميع الأسهم سوائل ما لم يذكر خلاف ذلك. تم إعادة تعليق المواد الكيميائية أو تخفيفها في المياه المصفاة المعقمة ما لم يذكر خلاف ذلك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتنفيذ الفحص المجهري التوسعي في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي للمسح بالليزر.

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في معظم مختبرات البيولوجيا التنموية للمريء ، مما يسمح للباحثين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى المجاهر فائقة الدقة بإنتاج صور فائقة الدقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بتجاوز حد الحيود للمجهر التقليدي متحد البؤر دون الحاجة إلى مجهر فائق الدقة عن طريق توسيع العينة نفسها. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لأولئك الذين يدرسون كيفية تأثير توطين البروتين على مورفولوجيا الخلية أو وظيفتها في الأجنة السليمة ، خاصة عندما يتم تنظيم هذه البروتينات في هياكل أو شبكات تحت خلوية معقدة.المشكلة الأكثر شيوعا التي يواجهها الناس هي فقدان الأجنة في جميع أنحاء البروتوكول. ينصح بتطبيق طبقات متعددة من Poly-L-Lysine للالتصاق بالأجنة بإحكام. بعد الأجنة ، خذ قاعدة طبق بتري بلاستيكية بطول ستة سنتيمترات مملوءة نصفها ب 3٪ أجار.سجل مستطيلا خمسة في ثلاثة سنتيمترات في أجار بشفرة حلاقة أو مشرط. قم بإزالة لوح أجار باستخدام ملعقة مختبر صغيرة. ثم اقلب قاعدة طبق بتري ، وضعه على المقعد ، وضع لوح أجار أعلى الطبق المقلوب.أخرج الغطاء من طبق بتري وتأكد من جفافه. باستخدام القفازات ، ضع قطعة من الشريط على الوجهين داخل الغطاء. أخرج القوارير التي تحتوي على الأجنة المطلية والثابتة من شاكر وضعها عموديا على طاولة العمل.اسمح للمراحل العضوية والمائية بالانفصال. يجب أن تظل الأجنة الثابتة بشكل صحيح في واجهتها. قم بإزالة المرحلة المائية السفلية تماما باستخدام ماصة باستور وماصة P200.استخدم ماصة باستور الزجاجية المزودة بمصباح لاتكس لنقل الأجنة المثبتة على لوح أجار على دفعات صغيرة متعددة حتى لا تلتصق بداخل الماصة. بمجرد أن تصبح الأجنة على لوح الآجار ، استخدم أنبوب P200 لإزالة أي هيبتان متبقي بالقرب من الأجنة. الآن ، أسقط غطاء الشريط على الوجهين على لوح الآجار من ارتفاع سنتيمترين للصق الأجنة بالشريط.قم بإزالة الغطاء برفق من لوح أجار ، وضعه رأسا على عقب على المقعد ، وأضف ما يكفي من PBS Tween لتغطية الأجنة في الغطاء. لجمع الأجنة المطلوبة ، استخدم مجهر تشريح ستيريو بتكبير 100x مع إضاءة غير مباشرة. وخز الغشاء الزجاجي بالقرب من الطرف الأمامي أو الخلفي للجنين بإبرة زجاجية دقيقة لتفريغه وتحرير الضغط.استخدم ملقط رفيعا أو مسبارا معدنيا لدفع الجنين برفق للخارج من خلال الفتحة مع استمرار تمسك غشاء vitelline بالشريط على الوجهين. اترك الأجنة غير المرغوب فيها على الشريط. استخدم بشكل دوري ماصة باستور الزجاجية لجمع أي جنين عائم ونقله إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر.قم بإعداد محلول PDMS في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وإنشاء أنبوب متوازن عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء إلى أنبوب مخروطي ثان سعة 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي حل PDMS عند 500G لمدة ثلاث دقائق عند 15 درجة مئوية. ثم اسكبه في طبق بتري 10 سم على عمق ملليمتر واحد.اسمح لمحلول PDMS بالتصلب طوال الليل عند 55 درجة مئوية. بمجرد أن يتم تثبيت لوح PDMS ، قم بتسجيل مساحات مربعة أصغر قليلا من انزلاق غطاء 22 × 22 مم باستخدام مشرط. داخل كل مربع ، سجل وأزل بئرا مربعا بعرض ثمانية ملليمترات.انقل كل PDMS مربع جيدا على غطاء 22 × 22 ملم وألصقه بإحكام. للصق الأجنة بزلات الغطاء ، ضع ما يكفي من 0.1٪ Poly-L-Lysine لتغطية سطح انزلاق الغطاء داخل كل بئر ووضعها في حاضنة 55 درجة مئوية حتى تجف. شطف لفترة وجيزة الأجنة و PBS لإزالة منظف Tween.ثم انقل أكثر من 10 أجنة إلى كل بئر مطلي ب Poly-L-Lysine. اسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الآبار. قم بإزالة السائل الزائد من الأجنة الملتصقة باستخدام ماصة باستور وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.بينما تجلس الأجنة في محلول المونومر ، قم بإعداد محلول الهلام لتغطية آبار PDMS. تمييع المؤكسد الحفاز طازجا من مسحوق. اجمع بين 3،920 ميكرولتر من محلول المونومر مع 60 ميكرولتر من 10٪ TEMED و 20 ميكرولتر من 1٪ TEMPO.قم بتقسيم محلول الهلام إلى حصص 125 ميكرولتر إلى أنابيب PCR متعددة. قم بإزالة محلول المونومر من آبار PDMS باستخدام فراغ أو أنبوب مع الحرص على عدم تعطيل الأجنة. أضف خمسة ميكرولترات من APS إلى أحد أنابيب PCR التي تحتوي على محلول الهلام لبدء البلمرة.قم بتوزيع محلول البلمرة بسرعة بين الآبار الثلاثة. كرر هذا حتى يتم تغطية جميع الآبار والأجنة. دع العينات تتكاثر لمدة 1.5 إلى 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية.سوف تستغرق الهلاميات المائية السميكة وقتا أطول لإكمال البلمرة والتصلب. تحريك الهلاميات المائية في كثير من الأحيان لمراقبة البلمرة. بمجرد التصلب ، لن تذبذب الهلاميات المائية.بعد الهلام ، قشر آبار PDMS من انزلاق الغطاء دون إزعاج الهلاميات المائية. نقل الهلاميات المائية بشكل فردي إلى آبار لوحة ستة آبار. قد تتوسع الهلاميات المائية قليلا أثناء الهضم.تغطية المواد الهلامية تماما مع العازلة الهضم. 30 ملليلتر من محلول الهضم يكفي لتغطيتها في صفيحة ستة آبار واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم ، انقل الهلاميات المائية إلى طبق بتري طوله ستة سنتيمترات واملأه بالماء منزوع الأيونات للتمدد.قد تنفصل الهلاميات المائية عن انزلاقات الغطاء عند هذه النقطة وتتوسع أربع طيات في البعد الخطي. باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الزائد من طبق بتري لتقليل حركة المواد الهلامية عند التعامل معها. قم بمناورة المواد الهلامية الموسعة مع الأجنة على السطح السفلي على زلة غطاء كبيرة للتصوير.قم بتركيب كل غطاء بجل فوق هدف مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب. بعد تحديد موقع العينات التي تم تنظيمها وتوجيهها بشكل صحيح ، تحولت إلى زيت عالي التكبير أو هدف غمر في الماء إلى صورة بدقة عالية. أظهر قياس طول الجنين على طول محور الرأس إلى الذيل تحت هدف 10x أن الأجنة غير الموسعة امتدت ما يقرب من نصف مجال الرؤية ، في حين أن الأجنة الموسعة امتدت تقريبا إلى مجالين كاملين للرؤية.كان متوسط طول الرأس إلى الذيل للأجنة الضابطة غير الموسعة 398.8 ميكرومتر. بالنسبة للتجارب الأولى والثانية والثالثة، كان متوسط أطوال الجنين هو 4.0 أضعاف و4.7 أضعاف و4.9 أضعاف على الترتيب. في عينة التحكم ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 4.76 ميكرومتر.في العينات الموسعة ، كان متوسط عرض الخلايا في الجزء الفكي العلوي 19.10 ميكرومتر ، وهو ما يمثل توسعا بمقدار 4.0 أضعاف. تم تصوير الهيكل الخلوي actomyosin في السيطرة غير الموسعة مقابل الأجنة الموسعة ، التي تخضع لتمديد متقارب. ظهرت كخط واحد حيث التقت الخلايا المجاورة.على النقيض من ذلك، في المرحلة السابعة الموسعة من الأجنة، يمكن ملاحظة خطوط متوازية من الميوسين اثنين عند تقاطعات الخلايا الخلوية، وهو ما يمثل تجمعات البروتين القشري في الخلايا المجاورة. في المرحلة السادسة من الأجنة غير الموسعة ، ظهرت الميتوكوندريا الموصوفة بالستربتافيدين كضباب سيتوبلازمي غير متجانس دون أي تفاصيل واضحة تحت الخلية. ومع ذلك ، في الأجنة الموسعة ، كانت العديد من النقاط قابلة للحل داخل السيتوبلازم ، ومن المحتمل أن تمثل الميتوكوندريا المجزأة أو أجزاء من شبكة الميتوكوندريا.أحد الأشياء المهمة التي يجب تذكرها عند محاولة هذا الإجراء هو حماية الأجنة من التعرض المفرط للضوء بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

الجامعة-جبل [كنفوكل] الفحص المجهري للجلد الإذن الكبار: نظام نموذجي لدراسة Morphogenesis المتفرعة العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...