Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Nous tenons à remercier la Dre Jennifer Zallen d’avoir fourni l’anticorps primaire anti-Par-3 du cobaye. Ces travaux ont été soutenus par un généreux financement (1R15GM143729-01 et 1P20GM139768-01 5743) de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS), l’un des membres des National Institutes of Health (NIH), ainsi que de l’Arkansas Biosciences Institute (ABI), qui a fourni un financement partiel pour l’achat de notre microscope confocal.

     

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Dévitellinisation manuelle La plupart des protocoles de fixation d’embryons de drosophile impliquent l’ablation de la membrane vitelline en agitant les embryons fixés dans une émulsion de méthanol et d’heptane, ce qui provoque l’éclatement des membranes par rupture osmotique26. Alors que la désensitinisation à base de méthanol (éclatement du méthanol) est efficace et appropriée pour de nombreuses applications, la dédésensilinisation manuelle (épluchage à la main) offre des avantages significatifs. Tout d’abord, l’épluchage à la main permet de choisir des embryons au stade précis de la devitellinisation et de la collecte, ce qui augmente considérablement la probabilité d’obtenir des embryons élargis dans une orientation utilisable à la fin de l’expérience. Cet enrichissement est essentiel lors de l’étude d’aspects spécifiques des processus de développement rapide (par exemple, l’invagination du mésoderme ou l’extension convergente), pour lesquels les embryons stadifiés de manière appropriée peuvent ne représenter que quelques pour cent de tous les embryons, même dans une fenêtre de collecte très serrée. Bien sûr, pour de nombreuses applications, l’éclatement plus traditionnel au méthanol d’embryons à partir d’une fenêtre de collecte chronométrée sera suffisant, et l’épluchage à la main peut ne pas valoir l’effort supplémentaire. Deuxièmement, la liaison de certains anticorps primaires et colorants est affectée négativement par l’exposition antérieure de l’échantillon au méthanol. Pour cette raison, le peeling à la main peut entraîner des augmentations significatives de la qualité du signal d’immunofluorescence par rapport aux échantillons de méthanol, ce qui en fait une technique générale utile pour les biologistes du développement de la drosophile .
Microscopie confocale à haute résolution dans des embryons de drosophile à montage entier expansé Bien que l’exécution de la microscopie confocale à haute résolution sur des échantillons élargis soit conceptuellement la même que sur des échantillons non étendus, ExM présente certains obstacles techniques. Notamment, l’orientation de l’embryon, qui est aléatoire, devient encore plus importante à mesure que la taille de l’échantillon augmente, car les objectifs à fort grossissement et à NA élevé ne sont capables de focaliser la lumière qu’à partir de régions d’échantillon très proches de la lamelle27. Par conséquent, il n’est généralement possible de se concentrer que sur les cellules situées à la surface ou près de la surface de l’embryon qui se sont retrouvées adjacentes à la lamelle lors de la formation du gel. La meilleure façon de s’assurer qu’il y a des spécimens de la bonne orientation à la fin est de commencer le protocole ExM avec une collection d’embryons fixes par étapes serrées (par exemple, en utilisant l’épluchage à la main) et d’ensemencer de nombreux embryons dans chaque puits (>10). Pour visualiser les cellules situées profondément à l’intérieur de l’embryon, il peut être nécessaire d’utiliser des dispositifs d’imagerie plus spécialisés, tels que la microscopie à feuille de lumière28. De plus, nous constatons que la qualité de l’image peut être améliorée en ouvrant le sténopé confocal à une taille supérieure à une unité aérée. Bien sûr, une augmentation de la taille du sténopé se fera au prix d’une diminution de la résolution maximale, mais dans la pratique, même de petites augmentations de la taille du sténopé peuvent augmenter considérablement l’intensité du signal (données non présentées). Les études futures devraient systématiquement porter sur la taille des trous d’épingle et la résolution effective dans les échantillons ExM.
Variations sur ExM de base Le protocole décrit ici est un exemple relativement simple d’ExM qui devrait fonctionner pour de nombreuses applications et être facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires de biologie du développement. Cependant, il existe de nombreuses variantes du concept de base d’ExM 4,5,7 qui peuvent être utilisées pour augmenter l’intensité du signal, atteindre des degrés d’expansion encore plus élevés et détecter des molécules d’acide nucléique ainsi que des protéines. Dans ce protocole, les embryons sont incubés avec des anticorps avant la gélification et l’expansion. Alternativement, les échantillons peuvent être traités avec des anticorps après leur expansion 6,30, ce qui peut augmenter l’intensité du signal en raison de l’accessibilité accrue des épitopes et de la diminution de la perte d’anticorps liés pendant les étapes d’expansion. De plus, des molécules de réticulation spécifiques peuvent être utilisées pour attacher des molécules d’ARN à l’hydrogel afin de permettre la détection de l’ARN dans les gels expansés en utilisant la méthode de réaction en chaîne d’hybridation30. Enfin, les échantillons peuvent être soumis à plusieurs cycles d’expansion, comme dans la microscopie d’expansion itérative (iExM)31, la microscopie pan-ExM32 et la révélatrice d’expansion (ExR)31, pour atteindre des degrés encore plus élevés de résolution accrue.

En biologie cellulaire et du développement, il faut le voir pour le croire, et la capacité de déterminer avec précision les modèles de localisation des protéines est fondamentale pour de nombreux types d’expériences. La microscopie confocale à balayage laser est l’outil standard pour l’imagerie de protéines marquées par fluorescence en trois dimensions dans des échantillons intacts. Les microscopes confocaux conventionnels sont incapables de distinguer (résoudre) les signaux fluorescents adjacents qui sont séparés par moins de la moitié de la longueur d’onde de la lumière qu’ils émettent1. En d’autres termes, deux sources ponctuelles doivent être séparées d’au moins 200 à 300 nm dans la direction latérale (500 à 700 nm dans la direction axiale) pour les résoudre comme deux signaux distincts. Cette barrière technique est connue sous le nom de limite de diffraction, et c’est un obstacle fondamental à l’étude des structures subcellulaires complexes (par exemple, les réseaux cytosquelettiques ou mitochondriaux de l’actomyosine) avec des caractéristiques spatiales inférieures à la limite de diffraction. Par conséquent, les techniques permettant d’augmenter le pouvoir de résolution des microscopes confocaux conventionnels présentent un intérêt général pour la communauté biologique.
Pour contourner la limite de diffraction, un certain nombre de technologies de microscopie à super-résolution ont été développées qui permettent une résolution de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres ou moins 1,2,3, révélant un monde de complexité biologique qui n’était auparavant accessible que par microscopie électronique. Malgré les avantages évidents de ces méthodes matérielles, les microscopes à super-résolution ont souvent des exigences spécifiques en matière d’étiquetage des échantillons et de longs temps d’acquisition, ce qui limite leur flexibilité, ou ils peuvent tout simplement être trop coûteux pour certains laboratoires. Une alternative à la super-résolution au microscope est la microscopie d’expansion (ExM), qui n’est pas un type de microscopie en soi, mais plutôt une méthode de gonflement d’un échantillon tout en préservant l’organisation spatiale relative de ses molécules constitutives4. Les échantillons élargis isotropement peuvent ensuite être observés à une résolution effectivement augmentée à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence traditionnel. L’ExM a été décrite pour la première fois par le groupe de Boyden en 20155, et la technique de base a depuis été adaptée pour être utilisée dans une variété d’expériences 6,7,8. ExM a également été adapté pour être utilisé dans des embryons entiers, notamment chez la drosophile9, 10, 11, C. elegans12 et le poisson-zèbre 13, ce qui en fait un outil puissant pour les biologistes du développement.
ExM est basé sur deux chimies d’hydrogel différentes : 1) les hydrogels polyélectrolytiques gonflables, qui augmentent considérablement en taille lorsqu’ils sont trempés dans l’eau14, et 2) les hydrogels de polyacrylamide, qui ont un espacement extrêmement faible entre les polymères pour permettre une expansion isotrope de l’échantillon15. Bien qu’il existe de nombreux protocoles ExM publiés, ils partagent généralement les étapes suivantes : fixation de l’échantillon, étiquetage, activation, gélification, digestion et expansion4. Les conditions de fixation et les stratégies de marquage par fluorescence varient bien sûr en fonction des besoins de l’expérience et du système, et dans certains protocoles, le marquage se produit après l’expansion. Les molécules cibles de l’échantillon doivent être amorcées (activées) pour se lier à l’hydrogel, ce qui peut être réalisé en utilisant différentes chimies4. Au cours des étapes de gélification, l’échantillon est saturé de monomères du futur hydrogel (acrylate de sodium, acrylamide et bisacrylamide, réticulant), et l’hydrogel est ensuite formé par polymérisation radicalaire catalysée par un initiateur, tel que le persulfate d’ammonium (APS), et un accélérateur, tel que la tétraméthylènediamine (TEMED)4. Après gélification, l’échantillon est digéré enzymatiquement pour homogénéiser la résistance de l’échantillon au gonflement et assurer l’expansion isotrope de l’hydrogel4. Enfin, l’hydrogel digéré est placé dans l’eau, ce qui le fait se dilater jusqu’à environ quatre fois sa taille linéaire d’origine4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la microscopie d’expansion chez les embryons de drosophile. ExM est un protocole en plusieurs étapes qui prend au moins 4 jours à compléter. Le prélèvement, la fixation et la désensilinisation des embryons prennent 1 jour ou plus selon que les embryons provenant de plusieurs collections sont mis en commun ou non. Le marquage par immunofluorescence prend 1 jour ou 2 jours selon que les embryons sont incubés pendant la nuit avec les anticorps primaires. L’activation, la gélification, la digestion et l’expansion de l’embryon peuvent être effectuées en une seule journée. Les gels peuvent être montés et imagés immédiatement après l’expansion, bien que pour des raisons pratiques, il soit souvent souhaitable de commencer l’imagerie le lendemain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ce protocole décrit comment effectuer l’ExM sur des embryons de drosophile à un stade précoce ou intermédiaire16 afin de visualiser les modèles de localisation des protéines subcellulaires à super-résolution (Figure 1). Cette méthode utilise la chimie de l’ester N-hydroxysuccinimidyle de l’acide méthylacrylique (MA-NHS) pour activer et ancrer les molécules de protéines à l’hydrogel17, et il s’agit d’une modification d’un protocole ExM précédemment publié pour une utilisation dans les embryons et les tissus de drosophile à un stade avancé11. Ce protocole utilise des puits de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour mouler les hydrogels et faciliter l’échange de solutions lors de l’activation et de la gélification. Une autre méthode qui ne nécessite pas la création de puits PDMS consiste à abaisser les embryons attachés à des lamelles dans des gouttes de solution monomère posées sur un morceau de film d’étanchéité de laboratoire22. De plus, ce protocole décrit une méthode permettant d’enlever manuellement la membrane vittelline imperméable qui entoure les embryons de drosophile , ce qui est une condition préalable à la coloration par immunofluorescence. Il est important de noter que cette méthode d’épluchage manuel des embryons peut être utilisée pour sélectionner uniquement les embryons de drosophile correctement stadifiés avant l’étiquetage des échantillons, ce qui augmente considérablement la probabilité de se retrouver avec des échantillons élargis du stade et de l’orientation corrects et, par conséquent, rend la collecte de données en aval beaucoup plus efficace.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

Le cheval de bataille de la biologie du développement est le microscope confocal, qui permet aux chercheurs de déterminer la localisation tridimensionnelle des molécules marquées dans des échantillons biologiques complexes. Alors que les microscopes confocaux traditionnels permettent de résoudre deux sources ponctuelles fluorescentes adjacentes situées à quelques centaines de nanomètres l’une de l’autre, l’observation des détails les plus fins de la biologie subcellulaire nécessite la capacité de résoudre des signaux de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres. De nombreuses méthodes matérielles de microscopie à super-résolution ont été mises au point pour permettre aux chercheurs de contourner ces limites de résolution, bien que ces méthodes nécessitent des microscopes spécialisés qui ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs. Une méthode alternative pour augmenter le pouvoir de résolution consiste à agrandir isotropement l’échantillon lui-même par un processus connu sous le nom de microscopie à expansion (ExM), qui a été décrit pour la première fois par le groupe de Boyden en 2015. L’ExM n’est pas un type de microscopie en soi, mais plutôt une méthode de gonflement d’un échantillon tout en préservant l’organisation spatiale relative de ses molécules constitutives. L’échantillon élargi peut ensuite être observé à une résolution effectivement augmentée à l’aide d’un microscope confocal traditionnel. Ici, nous décrivons un protocole pour la mise en œuvre de l’ExM dans les embryons de drosophile montés entiers, qui est utilisé pour examiner la localisation de Par-3, de la myosine II et des mitochondries dans les cellules épithéliales de surface. Ce protocole permet de multiplier par quatre la taille de l’échantillon, ce qui permet de détecter des détails subcellulaires qui ne sont pas visibles avec la microscopie confocale conventionnelle. Comme preuve de principe, un anticorps anti-GFP est utilisé pour distinguer des pools distincts de myosine-GFP entre les cortex cellulaires adjacents, et la streptavidine marquée par fluorescence est utilisée pour détecter les molécules biotinylées endogènes afin de révéler les détails fins de l’architecture du réseau mitochondrial. Ce protocole utilise des anticorps et des réactifs courants pour le marquage par fluorescence, et il devrait être compatible avec de nombreux protocoles d’immunofluorescence existants.

Pour caractériser l’efficacité générale de l’ExM chez les embryons de drosophiles montés entiers, la longueur de l’embryon le long de l’axe tête-queue a été mesurée chez des embryons témoins non expansés par rapport à des embryons expansés (Figure 3A-C). Les embryons témoins non expansés ont été soumis aux mêmes conditions de fixation et aux mêmes étapes de marquage par immunofluorescence que les embryons expansés, sauf qu’ils ont été montés à l’aide d’un milieu de montage solidifié avant l’imagerie. Les embryons individuels non expansés couvraient environ la moitié d’un champ de vision lors de l’utilisation d’un objectif 10x (Figure 3A). En revanche, les embryons élargis couvraient environ deux champs de vision complets lorsqu’ils utilisaient le même objectif 10x (Figure 3B). Pour évaluer comment le degré d’expansion variait à la fois à l’intérieur et entre les expériences, le même protocole ExM a été effectué à trois occasions distinctes, et la longueur de l’embryon a été mesurée dans trois gels différents dans chaque expérience individuelle. La longueur moyenne de la tête à la queue des embryons témoins non expansés était de 398,8 μm (écart-type [ET] = 22,93 μm ; n = 74 ; Graphique 3C). Pour l’expérience 1, l’expérience 2 et l’expérience 3, les longueurs moyennes des embryons étaient respectivement de 1 596 μm (écart-type = 159,9 μm ; n = 57), 1 868 μm (écart-type = 150,5 μm ; n = 51) et 1 954 μm (écart-type = 120,3 μm ; n = 44), respectivement, ce qui représente des facteurs d’expansion de 4,0 fois, 4,7 fois et 4,9 fois, respectivement (Figure 3C). La variation intra-expérimentale entre les gels était beaucoup moins perceptible que la variation inter-expérimentale, qui était d’environ 20 % (Figure 3C). Pour évaluer les effets de l’ExM sur la morphologie des cellules et des embryons, un anticorps dirigé contre le composant de la jonction adhérente Par-3 (Bazooka)21 a été utilisé pour marquer les membranes cellulaires apicales, et nous avons imagé les segments buccaux en développement d’embryons de drosophile de stade 11, un stade avec une structure segmentée complexe (Figure 3D-F). Dans l’échantillon témoin, les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 4,76 μm (ET = 1,053 μm, n = 25 ; Graphique 3D, F). Dans les échantillons élargis imagés à l’aide du même objectif 40x et du même facteur de zoom (1x), les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 19,10 μm (ET = 3,966 μm, n = 18 ; Figure 3E, F), représentant une expansion de 4,0 fois. Par conséquent, conformément aux rapports précédents11, nous avons été en mesure d’agrandir les embryons de drosophile montés en entier d’environ quatre fois en dimensions linéaires en utilisant ExM sans déchirure de l’échantillon ni distorsion évidente de la morphologie cellulaire ou tissulaire.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Figure 3 : Quadruplement de l’expansion des embryons de drosophile. (A) Embryons de drosophile non expansés et (B) expansés imagés à l’aide d’un objectif 10x (0,3 NA) avec un zoom 1x. Les champs de vision individuels (FOV) sont indiqués par des lignes pointillées. Les embryons exprimaient une version de la chaîne légère de myosine marquée par la GFP et étaient colorés avec un anticorps anti-GFP. (C) Quantification de la longueur de l’embryon (le long de l’axe tête-queue) dans trois hydrogels par expérience et à partir de trois expériences ExM distinctes par rapport à des témoins non étendus. (D,E) Segments maxillaires d’embryons de drosophile de stade 11 (D) non expansés et (E) élargis imagés à l’aide d’un objectif 40x (1,3 NA) avec un zoom 1x. Les contours des cellules (jonctions adhérentes) ont été détectés avec un anticorps anti Par-3/Bazooka (blanc). (F) Quantification de la largeur de cellule (grand axe) à partir de groupes équivalents de cellules de (D) et (E). Les boîtes à moustaches des paragraphes (C) et (F) montrent les fourchettes des 25e, 50e et 75e percentiles ; les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales ; Les symboles « + » indiquent la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour démontrer que l’ExM peut être utilisé pour résoudre des détails subcellulaires en dessous de la limite de diffraction typique, le cytosquelette de l’actomyosine a été imagé chez des embryons témoins non expansés par rapport à des embryons expansés subissant une extension convergente (stade 7). Les événements de remodelage tissulaire de la gastrulation et de l’extension convergente sont largement contrôlés par des changements dans la localisation de la protéine motrice myosine II24. Cependant, dans l’épithélium colonnaire densément emballé de l’ectoderme précoce de la drosophile , il est difficile d’observer de nombreux détails fins du modèle de localisation de la myosine II, même lorsqu’il est imagé à un grossissement de 158x (objectif 63x avec un zoom optique 2,5x) – un pouvoir de résolution maximal typique pour un microscope confocal à balayage laser. Par exemple, parce que la myosine II est une protéine corticale (située directement sous la membrane plasmique), les pools de myosine II25 situés de part et d’autre des contacts cellule-cellule n’étaient pas solubles dans les embryons de stade 7, et ils apparaissaient comme une seule ligne où les cellules voisines se rencontraient (Figure 4A). En revanche, dans les embryons de stade 7 élargi, des lignées parallèles de myosine II ont pu être observées au niveau des jonctions cellule-cellule, représentant des pools de protéines corticales dans les cellules adjacentes (Figure 4B). La distance entre les raies parallèles de myosine II dans les échantillons élargis était de 892,7 nm (ET = 0,171 nm, n = 12) ; lorsqu’il est divisé par quatre, cela donne une distance prédite de ~220 nm entre les raies de myosine dans les cellules adjacentes dans les embryons non développés, ce qui est en effet juste en dessous de la limite de diffraction pour un signal détecté avec Alexa 488 (émission maximale de ~520 nm/2 = 260 nm).
De plus, nous avons également testé si ExM pouvait être utilisé pour résoudre l’architecture du réseau mitochondrial dans des cellules densément emballées d’embryons de drosophile en gastrulation (stade 6). La fonction mitochondriale est étroitement liée à la structure du réseau (c’est-à-dire les organites fusionnés ou fragmentés), mais les détails de l’organisation du réseau mitochondrial sont difficiles à visualiser à l’aide de la microscopie confocale conventionnelle dans les types de cellules qui ne sont pas plats et/ou minces. Les mitochondries sont naturellement riches en molécules biotinylées et, par conséquent, les mitochondries peuvent être marquées dans l’embryon précoce de la drosophile à l’aide de streptavidine26 marquée par fluorescence. Dans les embryons de stade 6 non expansés marqués avec la streptavidine-Alexa 488, le signal est apparu sous forme de ponctuations cytoplasmiques qui se chevauchaient souvent et étaient difficiles à résoudre (Figure 4C). En revanche, dans les embryons de stade 6 élargi, beaucoup plus de détails fins du réseau mitochondrial étaient visibles et les puncta étaient plus faciles à résoudre (Figure 4D)26,27. Ces résultats indiquent que l’ExM peut être utilisé pour étudier l’organisation du réseau mitochondrial dans des types cellulaires qui ne sont pas traditionnellement adaptés à l’analyse mitochondriale.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Figure 4 : Détails du cytosquelette et des mitochondries de l’actomyosine révélés par microscopie d’expansion. (A,B) Localisation de la myosine II dans des cellules neuroectodermiques (germane) imagées avec un objectif 63x (1,4 NA) à un zoom de 2,5x dans les embryons de stade 7 (A) non expansés et (B) expansés. La myosine II a été détectée dans les embryons exprimant une version transgénique marquée à la GFP de la chaîne légère régulatrice de la myosine II (SQH-GGP), qui a été détectée avec un anticorps anti-GFP (rouge). Des pools distincts de myosine corticale situés dans les cellules adjacentes peuvent être résolus dans l’embryon expansé (flèches blanches). (C,D) Réseaux mitochondriaux dans des cellules neuroectodermiques imagées avec un objectif de 63× (1,4 NA) à un zoom de 2,5x dans des embryons non expansés (C) et expansés (D) de stade 6. Les mitochondries ont été détectées avec la streptavidine-Alexa 488 (vert), et les contours des cellules ont été détectés avec un anticorps anti-Par-3/Bazooka (magenta). Les expériences ont été réalisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Recettes de solutions. Composition des solutions utilisées dans ce protocole par ordre d’apparition. Tous les stocks sont liquides, sauf indication contraire. Les produits chimiques ont été remis en suspension ou dilués dans de l’eau filtrée autoclave, sauf indication contraire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Ici, un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie d’expansion dans les embryons précoces de drosophile afin d’obtenir une imagerie à super-résolution à l’aide d’un microscope confocal conventionnel à balayage laser est présenté.

Utilisation de la microscopie d’expansion pour agrandir physiquement des embryons de drosophile entiers pour l’imagerie à super-résolution

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Ce protocole peut être mis en œuvre dans la plupart des laboratoires de biologie du développement de l’œsophage, ce qui permet aux chercheurs qui n’ont pas accès à des microscopes à super résolution de produire des images à super résolution. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs de contourner la limite de diffraction de la microscopie confocale conventionnelle sans avoir besoin d’un microscope à super résolution en élargissant l’échantillon lui-même. Ce protocole sera bénéfique pour ceux qui étudient comment la localisation des protéines affecte la morphologie ou la fonction cellulaire dans les embryons intacts, en particulier lorsque ces protéines sont organisées en structures ou réseaux subcellulaires complexes.Le problème le plus courant que les gens rencontrent est la perte d’embryons tout au long du protocole. Il est conseillé d’appliquer plusieurs couches de Poly-L-Lysine pour faire adhérer fermement les embryons. Après les embryons, prenez une base de boîte de Pétri en plastique de six centimètres remplie à moitié d’agar-agar à 3%.Marquez un rectangle de cinq centimètres sur trois dans l’agar avec une lame de rasoir ou un scalpel. Retirez la plaque de gélose à l’aide d’une petite spatule de laboratoire. Retournez ensuite la base de la boîte de Pétri, placez-la sur le banc et placez la plaque de gélose sur le dessus de la boîte inversée.Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et assurez-vous qu’il est sec. À l’aide de gants, fixez un morceau de ruban adhésif double face à l’intérieur du couvercle. Sortez les flacons contenant les embryons enrobés et fixés du shaker et placez-les verticalement sur l’établi.Laisser les phases organique et aqueuse se séparer. Les embryons correctement fixés doivent rester à leur interface. Retirez complètement la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pipette P200.À l’aide d’une pipette Pasteur en verre munie d’une poire en latex, transférer les embryons fixés sur une plaquette de gélose en plusieurs petits lots afin qu’ils n’adhèrent pas à l’intérieur de la pipette. Une fois que les embryons sont sur la plaque de gélose, utilisez une pipette P200 pour retirer tout heptane restant près des embryons. Maintenant, déposez le couvercle du ruban adhésif double face sur la dalle de gélose d’une hauteur de deux centimètres pour faire adhérer les embryons au ruban.Retirez délicatement le couvercle de la dalle de gélose, placez-le à l’envers sur la paillasse et ajoutez suffisamment de PBS Tween pour couvrir les embryons dans le couvercle. Pour prélever les embryons souhaités, utilisez un microscope à dissection stéréoscopique à grossissement de 100x avec éclairage indirect. Piquez la membrane vitelline près de l’extrémité antérieure ou postérieure de l’embryon avec une fine aiguille de verre pour la dégonfler et relâcher la pression.À l’aide d’une pince fine ou d’une sonde métallique, poussez doucement l’embryon à travers le trou avec la membrane vitelline encore collée au ruban adhésif double face. Laissez les embryons non désirés sur le ruban. Utiliser périodiquement une pipette Pasteur en verre pour recueillir tout embryon devitellinisé flottant et le déplacer dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.Préparez la solution PDMS dans un tube conique de 50 millilitres et créez un tube équilibré en ajoutant une quantité appropriée d’eau à un deuxième tube conique de 50 millilitres. Centrifugez la solution PDMS à 500 G pendant trois minutes à 15 degrés Celsius. Versez-le ensuite dans une boîte de Pétri de 10 centimètres à une profondeur d’un millimètre.Laissez la solution PDMS se solidifier pendant la nuit à 55 degrés Celsius. Une fois la dalle PDMS solidifiée, marquez des zones carrées légèrement plus petites qu’une lamelle de 22 x 22 millimètres à l’aide d’un scalpel. À l’intérieur de chaque carré, entaillez et retirez un puits carré de huit millimètres de large.transférez chaque puits PDMS carré sur une lamelle de 22 x 22 millimètres et collez-la fermement. Pour faire adhérer les embryons aux lamelles de couverture, appliquez suffisamment de poly-L-lysine à 0,1 % pour couvrir la surface de la lamelle de couverture à l’intérieur de chaque puits et placez-les dans un incubateur à 55 degrés Celsius pour les faire sécher. Rincez brièvement les embryons et le PBS pour éliminer le détergent pour préadolescents.Ensuite, transférez plus de 10 embryons dans chaque puits enrobé de Poly-L-Lysine. Laissez les embryons s’installer au fond des puits. Retirez l’excès de liquide des embryons collés à l’aide d’une pipette Pasteur et passez immédiatement à l’étape suivante.Pendant que les embryons reposent dans la solution de monomère, préparez une solution gélifiante pour couvrir les puits du PDMS. Diluez l’oxydant catalytique fraîchement extrait de la poudre. Combinez 3 920 microlitres de solution monomère avec 60 microlitres de 10 % TEMED et 20 microlitres de 1 % de TEMPO.Divisez la solution de gélification en aliquotes de 125 microlitres en plusieurs tubes PCR. Retirer la solution de monomère des puits PDMS à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette en prenant soin de ne pas perturber les embryons. Ajoutez cinq microlitres d’APS à l’un des tubes PCR contenant une solution gélifiante pour initier la polymérisation.Répartissez rapidement la solution gélifiante polymérisante entre les trois puits. Répétez cette opération jusqu’à ce que tous les puits et embryons soient couverts. Laissez les échantillons se gélimer pendant 1,5 à 2,5 heures à 37 degrés Celsius.Les hydrogels plus épais mettront plus de temps à terminer la polymérisation et à se solidifier. Agitez souvent les hydrogels pour surveiller la polymérisation. Une fois solidifiés, les hydrogels ne bougent pas.Après la gélification, décollez les puits PDMS de la lamelle de recouvrement sans perturber les hydrogels. Transférez les hydrogels individuellement dans les puits d’une plaque à six puits. Les hydrogels peuvent se dilater légèrement pendant la digestion.Recouvrez complètement les gels d’un tampon de digestion. 30 millilitres de tampon de digestion suffisent pour les recouvrir d’une plaque à six puits et les incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après la digestion, déplacez les hydrogels dans une boîte de Pétri de six centimètres et remplissez-la d’eau déminéralisée pour qu’elle se dilate.Les hydrogels peuvent se détacher des lamelles de recouvrement à ce stade et se dilater quatre fois en dimension linéaire. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez autant d’eau que possible de la boîte de Pétri afin de minimiser le mouvement des gels lorsqu’ils sont manipulés. Manœuvrez les gels expansés avec les embryons sur la surface inférieure sur une grande lamelle de recouvrement pour l’imagerie.Montez chaque lamelle de recouvrement avec du gel sur l’objectif d’un microscope confocal à balayage laser inversé. Après avoir localisé les spécimens correctement mis en scène et orientés, passez à un objectif à immersion dans l’huile ou l’eau à fort grossissement pour obtenir une image à haute résolution. La mesure de la longueur de l’embryon le long de l’axe tête-queue sous un objectif 10x a montré que les embryons non expansés couvraient environ la moitié d’un champ de vision, tandis que les embryons expansés couvraient environ deux champs de vision complets.La longueur moyenne de la tête à la queue des embryons témoins non expansés était de 398,8 micromètres. Pour les expériences un, deux et trois, les longueurs moyennes des embryons étaient des facteurs d’expansion de 4,0 fois, 4,7 fois et 4,9 fois respectivement. Dans l’échantillon témoin, les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 4,76 micromètres.Dans les échantillons élargis, les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 19,10 micromètres, ce qui représente une expansion de 4,0 fois. Le cytosquelette de l’actomyosine a été imagé chez des embryons témoins non expansés par rapport à des embryons expansés, subissant une extension convergente. Ils apparaissaient comme une seule ligne où les cellules voisines se rencontraient.En revanche, dans les embryons de stade sept élargi, des lignées parallèles de myosine deux ont pu être observées aux jonctions cellulaires, représentant des pools de protéines corticales dans les cellules adjacentes. Dans les embryons non expansés de stade six, les mitochondries marquées avec la streptavidine sont apparues sous la forme d’un voile cytoplasmique hétérogène sans aucun détail subcellulaire clair. Cependant, dans les embryons expansés, de nombreux puncta étaient solubles dans le cytoplasme, représentant probablement des mitochondries fragmentées ou des parties du réseau mitochondrial.Une chose importante à retenir lors de cette procédure est de protéger les embryons d’une exposition excessive à la lumière après l’incubation secondaire des anticorps.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-cible chromogénique totalité montage<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation pour la comparaison des gènes domaines d&#39;expression dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Recherche

Biologie du développement

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Analyse quantitative Immunofluorescence entier-montent des Populations de progéniteurs cardiaques chez des embryons de souris

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Imagerie multimodale de hiérarchique de coupes sériées, pour trouver les cibles cellulaires spécifiques au sein de grands Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...