Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Wir danken Dr. Jennifer Zallen für die Bereitstellung des Meerschweinchen-Anti-Par-3-Primärantikörpers. Diese Arbeit wurde durch großzügige Mittel (1R15GM143729-01 und 1P20GM139768-01 5743) vom National Institute of General Medical Science (NIGMS), einem der Mitglieder der National Institutes of Health (NIH), sowie dem Arkansas Biosciences Institute (ABI) unterstützt, das den Kauf unseres konfokalen Mikroskops teilweise finanzierte.

     

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	<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging.+Expansion+microscopy.">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Chang, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex.">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li><li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons.">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy.">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li><li>Yu, C. -. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+C.+elegans.">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249 (2020).</li><li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies.">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+in+ionic+gels.">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li><li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues.">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila apple juice-agar plates. , (2011).</li><li>de Matos Sim&#245;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+directs+bazooka/Par-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation.">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Par&#233;, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation.">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization.">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li><li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy.">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy.">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li><li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context.">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).</li><li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+revealing:+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures.">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Manuelle Devitellinisierung Die meisten Protokolle zur Fixierung von Drosophila-Embryonen beinhalten die Entfernung der Vitellinmembran durch Schütteln fixierter Embryonen in einer Emulsion aus Methanol und Heptan, wodurch die Membranen durch osmotischen Bruch platzen26. Während die Methanol-basierte Devitellinisierung (Methanol-Popping) effektiv und für viele Anwendungen geeignet ist, bietet die manuelle Devitellinisierung (Handpeeling) einige wesentliche Vorteile. Erstens ermöglicht das manuelle Peeling die Auswahl von genau inszenierten Embryonen, die devitellinisiert und gesammelt werden sollen, was die Wahrscheinlichkeit, am Ende des Experiments vergrößerte Embryonen in einer brauchbaren Ausrichtung zu erhalten, erheblich erhöht. Diese Anreicherung ist von entscheidender Bedeutung, wenn bestimmte Aspekte schneller Entwicklungsprozesse (z. B. Mesoderm-Invagination oder konvergente Extension) untersucht werden, bei denen entsprechend inszenierte Embryonen nur wenige Prozent aller Embryonen ausmachen können, selbst innerhalb eines eng getakteten Zeitfensters. Natürlich ist für viele Anwendungen das traditionellere Methanol aus einem zeitgesteuerten Entnahmefenster ausreichend, und das Schälen von Hand ist den zusätzlichen Aufwand möglicherweise nicht wert. Zweitens wird die Bindung bestimmter primärer Antikörper und Farbstoffe durch eine vorherige Exposition der Probe gegenüber Methanol negativ beeinflusst. Aus diesem Grund kann das Schälen von Hand im Vergleich zu mit Methanol gepoppten Proben zu einer signifikanten Verbesserung der Immunfluoreszenzsignalqualität führen, was es zu einer nützlichen allgemeinen Technik für Drosophila-Entwicklungsbiologen macht.
Hochauflösende konfokale Mikroskopie in expandierten Drosophila-Embryonen Während die Durchführung der hochauflösenden konfokalen Mikroskopie an expandierten Proben konzeptionell die gleiche ist wie an unexpandierten Proben, bringt ExM einige technische Hürden mit sich. Insbesondere die Embryonenorientierung, die zufällig ist, wird mit zunehmender Stichprobengröße noch wichtiger, da Objektive mit hoher Vergrößerung und hoher NA nur in der Lage sind, Licht von Probenbereichen zu fokussieren, die sich sehr nahe am Deckglas27 befinden. Daher ist es in der Regel nur möglich, sich auf die Zellen an oder nahe der Oberfläche des Embryos zu konzentrieren, die bei der Bildung des Gels neben dem Deckglas gelandet sind. Der beste Weg, um sicherzustellen, dass am Ende Proben mit der richtigen Ausrichtung vorhanden sind, besteht darin, das ExM-Protokoll mit einer eng gestaffelten Entnahme von fixierten Embryonen zu beginnen (z. B. durch Schälen von Hand) und viele Embryonen in jede Vertiefung zu säen (>10). Um Zellen tief im Inneren des Embryos sichtbar zu machen, kann es notwendig sein, spezialisiertere Bildgebungsaufbauten zu verwenden, wie z. B. Lichtblattmikroskopie28. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die Bildqualität verbessert werden kann, indem die konfokale Lochblende auf eine Größe von mehr als einer luftigen Einheit geöffnet wird. Natürlich geht eine größere Lochblende auf Kosten einer verringerten maximalen Auflösung, aber in der Praxis können selbst kleine Erhöhungen der Lochblendengröße die Signalintensität erheblich erhöhen (Daten nicht gezeigt). Zukünftige Studien sollten sich systematisch mit der Größe der Lochblenden und der effektiven Auflösung in ExM-Proben befassen.
Variationen des Basis-ExM Das hier beschriebene Protokoll ist ein relativ einfaches Beispiel für ExM, das für viele Anwendungen funktionieren und in den meisten entwicklungsbiologischen Laboren leicht zu implementieren sein sollte. Es gibt jedoch zahlreiche Variationen des Grundkonzepts von ExM 4,5,7, mit denen die Signalintensität erhöht, noch weitere Expansionsgrade erreicht und Nukleinsäuremoleküle sowie Proteine detektiert werden können. In diesem Protokoll werden die Embryonen vor der Gelierung und Expansion mit Antikörpern inkubiert. Alternativ können die Proben mit Antikörpern behandelt werden, nachdem sie expandiert wurden 6,30, was die Signalintensität aufgrund der erhöhten Epitopzugänglichkeit und des verringerten Verlusts gebundener Antikörper während der Expansionsschritte erhöhen kann. Darüber hinaus können spezifische Vernetzermoleküle verwendet werden, um RNA-Moleküle an das Hydrogel zu binden, um den Nachweis von RNA in expandierten Gelen unter Verwendung des Hybridisierungskettenreaktionsverfahrens30 zu ermöglichen. Schließlich können die Proben mehreren Expansionsrunden unterzogen werden, wie z. B. bei der iterativen Expansionsmikroskopie (iExM)31, der pan-ExM32 und der Expansionsenthüllung (ExR)31, um noch höhere Grade an erhöhter Auflösung zu erreichen.

In der Zell- und Entwicklungsbiologie ist Sehen Glauben, und die Fähigkeit, die Lokalisierungsmuster von Proteinen genau zu bestimmen, ist für viele Arten von Experimenten von grundlegender Bedeutung. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ist das Standardwerkzeug für die dreidimensionale Abbildung fluoreszenzmarkierter Proteine in intakten Proben. Herkömmliche konfokale Mikroskope sind nicht in der Lage, benachbarte Fluoreszenzsignale zu unterscheiden (aufzulösen), die weniger als die Hälfte der Wellenlänge des von ihnen emittierten Lichts voneinander entfernt sind1. Mit anderen Worten, zwei Punktquellen müssen in lateraler Richtung mindestens 200-300 nm (500-700 nm in axialer Richtung) voneinander entfernt sein, um sie als zwei unterschiedliche Signale aufzulösen. Diese technische Barriere wird als Beugungsgrenze bezeichnet und stellt eine grundlegende Hürde für die Untersuchung komplexer subzellulärer Strukturen (z. B. des Aktomyosin-Zytoskeletts oder der mitochondrialen Netzwerke) mit räumlichen Merkmalen unterhalb der Beugungsgrenze dar. Daher sind Techniken zur Erhöhung des Auflösungsvermögens herkömmlicher konfokaler Mikroskope von allgemeinem Interesse für die biologische Gemeinschaft.
Um die Beugungsgrenze zu umgehen, wurden eine Reihe verschiedener hochauflösender Mikroskopietechnologien entwickelt, die eine Auflösung in der Größenordnung von zehn Nanometern oder weniger 1,2,3 ermöglichen und eine Welt biologischer Komplexität offenbaren, die bisher nur durch Elektronenmikroskopie zugänglich war. Trotz der offensichtlichen Vorteile dieser hardwarebasierten Methoden haben hochauflösende Mikroskope oft spezifische Anforderungen an die Probenmarkierung und lange Aufnahmezeiten, was ihre Flexibilität einschränkt oder für einige Labore einfach zu teuer ist. Eine Alternative zur mikroskopischen Superauflösung ist die Expansionsmikroskopie (ExM), bei der es sich nicht um eine Art der Mikroskopie an sich handelt, sondern um eine Methode zum Aufquellen einer Probe unter Beibehaltung der relativen räumlichen Organisation ihrer konstituierenden Moleküle4. Die isotrop expandierten Proben können dann mit einem herkömmlichen konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer effektiv erhöhten Auflösung betrachtet werden. ExM wurde erstmals 2015 von der Boyden-Gruppe beschrieben5, und die grundlegende Technik wurde seitdem für den Einsatz in einer Vielzahl von Experimenten angepasst 6,7,8. ExM wurde auch für den Einsatz in Ganzkörperembryonen angepasst, insbesondere in Drosophila 9,10,11, C. elegans12 und Zebrafisch 13, was es zu einem leistungsstarken Werkzeug für Entwicklungsbiologen macht.
ExM basiert auf zwei verschiedenen Hydrogelchemien: 1) quellfähigen Polyelektrolyt-Hydrogelen, die stark an Größe zunehmen, wenn sie in Wasser eingeweicht werden14, und 2) Polyacrylamid-Hydrogele, die einen extrem kleinen Polymerabstand haben, um eine isotrope Probenexpansion zu ermöglichen15. Es gibt zwar viele veröffentlichte ExM-Protokolle, aber sie haben im Allgemeinen die folgenden Schritte gemeinsam: Probenfixierung, Markierung, Aktivierung, Gelierung, Verdauung und Expansion4. Die Fixierungsbedingungen und Fluoreszenzmarkierungsstrategien variieren natürlich je nach den Anforderungen des Experiments und des Systems, und in einigen Protokollen erfolgt die Markierung nach der Expansion. Die Zielmoleküle in der Probe müssen für die Bindung an das Hydrogel vorbereitet (aktiviert) werden, was mit verschiedenen Chemikalien erreicht werdenkann 4. Während der Gelierungsschritte wird die Probe mit Monomeren des zukünftigen Hydrogels gesättigt (Natriumacrylat, Acrylamid und der Vernetzer Bisacrylamid), und das Hydrogel wird dann durch radikalische Polymerisation gebildet, die durch einen Initiator, wie Ammoniumpersulfat (APS), und einen Beschleuniger, wie Tetramethylendiamin (TEMED)4, katalysiert wird. Nach der Gelierung wird die Probe enzymatisch aufgeschlossen, um die Quellbeständigkeit der Probe zu homogenisieren und die isotrope Ausdehnung des Hydrogels4 zu gewährleisten. Schließlich wird das verdaute Hydrogel in Wasser gelegt, wodurch es sich auf etwa das Vierfache seiner ursprünglichen linearen Größe4 ausdehnt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Expansionsmikroskopie in Drosophila-Embryonen . ExM ist ein mehrstufiges Protokoll, das mindestens 4 Tage in Anspruch nimmt. Die Entnahme, Fixierung und Devitellinisierung von Embryonen dauert 1 Tag oder länger, je nachdem, ob Embryonen aus mehreren Sammlungen gepoolt werden. Die Immunfluoreszenzmarkierung dauert 1 Tag oder 2 Tage, je nachdem, ob die Embryonen über Nacht mit den primären Antikörpern inkubiert werden. Die Aktivierung, Gelierung, Verdauung und Expansion des Embryos kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Die Gele können sofort nach der Expansion montiert und abgebildet werden, obwohl es aus praktischen Gründen oft wünschenswert ist, am nächsten Tag mit der Bildgebung zu beginnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Dieses Protokoll beschreibt, wie ExM an Drosophila-Embryonen im frühen bis mittleren Stadium durchgeführt wird16 , um subzelluläre Proteinlokalisierungsmuster mit Superauflösung zu visualisieren (Abbildung 1). Diese Methode verwendet die Chemie des Methylacrylsäure-N-Hydroxysuccinimidylesters (MA-NHS), um Proteinmoleküle zu aktivieren und an dem Hydrogel zu verankern17, und es handelt sich um eine Modifikation eines zuvor veröffentlichten ExM-Protokolls für die Verwendung in Drosophila-Embryonen und -Geweben im späten Stadium11. Dieses Protokoll verwendet Polydimethylsiloxan (PDMS)-Wells, um die Hydrogele zu formen und den Lösungsaustausch während der Aktivierung und Gelierung zu erleichtern. Ein alternatives Verfahren, das die Erzeugung von PDMS-Vertiefungen nicht erfordert, beinhaltet das Absenken von Embryonen, die an Deckgläsern befestigt sind, in Tropfen der Monomerlösung, die auf einem Stück Laborversiegelungsfolie22 sitzen. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur manuellen Entfernung der undurchlässigen Vitellinmembran, die Drosophila-Embryonen umgibt, was eine Voraussetzung für die Immunfluoreszenzfärbung ist. Wichtig ist, dass diese Methode des manuellen Schälens von Embryonen verwendet werden kann, um vor der Probenmarkierung nur richtig stadifizierte Drosophila-Embryonen auszuwählen, was die Wahrscheinlichkeit, dass am Ende erweiterte Proben des richtigen Stadiums und der richtigen Ausrichtung erhalten, erheblich erhöht und somit die nachgelagerte Datenerfassung viel effizienter macht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

Das Arbeitspferd der Entwicklungsbiologie ist das konfokale Mikroskop, mit dem Forscher die dreidimensionale Lokalisierung markierter Moleküle in komplexen biologischen Proben bestimmen können. Während herkömmliche konfokale Mikroskope es ermöglichen, zwei benachbarte Fluoreszenzpunktquellen aufzulösen, die nur wenige hundert Nanometer voneinander entfernt sind, erfordert die Beobachtung der feineren Details der subzellulären Biologie die Fähigkeit, Signale in der Größenordnung von zehn Nanometern aufzulösen. Es wurden zahlreiche hardwarebasierte Methoden für die hochauflösende Mikroskopie entwickelt, die es Forschern ermöglichen, solche Auflösungsgrenzen zu umgehen, obwohl diese Methoden spezielle Mikroskope erfordern, die nicht allen Forschern zur Verfügung stehen. Eine alternative Methode zur Erhöhung des Auflösungsvermögens ist die isotrope Vergrößerung der Probe selbst durch ein Verfahren, das als Expansionsmikroskopie (ExM) bekannt ist und erstmals 2015 von der Boyden-Gruppe beschrieben wurde. ExM ist keine Art der Mikroskopie an sich , sondern vielmehr eine Methode zum Aufquellen einer Probe unter Beibehaltung der relativen räumlichen Organisation ihrer konstituierenden Moleküle. Die expandierte Probe kann dann mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop mit einer effektiv erhöhten Auflösung betrachtet werden. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Implementierung von ExM in Whole-Mount Drosophila-Embryonen , das verwendet wird, um die Lokalisation von Par-3, Myosin II und Mitochondrien in den Oberflächenepithelzellen zu untersuchen. Dieses Protokoll führt zu einer etwa vierfachen Vergrößerung der Probengröße und ermöglicht die Detektion subzellulärer Details, die mit herkömmlicher konfokaler Mikroskopie nicht sichtbar sind. Als Proof of Principle wird ein Anti-GFP-Antikörper verwendet, um unterschiedliche Myosin-GFP-Pools zwischen benachbarten Zellkortexen zu unterscheiden, und fluoreszenzmarkiertes Streptavidin wird verwendet, um endogene biotinylierte Moleküle zu detektieren, um die feinen Details der mitochondrialen Netzwerkarchitektur aufzudecken. Dieses Protokoll verwendet gängige Antikörper und Reagenzien für die Fluoreszenzmarkierung und sollte mit vielen bestehenden Immunfluoreszenzprotokollen kompatibel sein.

Um die allgemeine Wirksamkeit von ExM in Whole-Mount-Drosophila-Embryonen zu charakterisieren, wurde die Embryolänge entlang der Kopf-zu-Schwanz-Achse in nicht expandierten Kontrollembryonen im Vergleich zu expandierten Embryonen gemessen (Abbildung 3A-C). Die nicht expandierten Kontrollembryonen wurden den gleichen Fixierungsbedingungen und Immunfluoreszenz-Markierungsschritten unterzogen wie die expandierten Embryonen, mit der Ausnahme, dass sie vor der Bildgebung mit einem verfestigten Eindeckmedium montiert wurden. Die einzelnen nicht expandierten Embryonen erstreckten sich über etwa die Hälfte eines Gesichtsfeldes, wenn ein 10x-Objektiv verwendet wurde (Abbildung 3A). Im Gegensatz dazu erstreckten sich die expandierten Embryonen über etwa zwei volle Sichtfelder, wenn sie das gleiche 10-fache Objektiv verwendeten (Abbildung 3B). Um zu beurteilen, wie der Grad der Ausdehnung sowohl innerhalb als auch zwischen den Experimenten variierte, wurde das gleiche ExM-Protokoll bei drei verschiedenen Gelegenheiten durchgeführt, und die Embryonallänge wurde in drei verschiedenen Gelen innerhalb jedes einzelnen Experiments gemessen. Die durchschnittliche Kopf-zu-Schwanz-Länge der nicht expandierten Kontrollembryonen betrug 398,8 μm (Standardabweichung [SD] = 22,93 μm; n = 74; Abbildung 3C). Für Experiment 1, Experiment 2 und Experiment 3 betrugen die durchschnittlichen Embryonenlängen 1.596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1.868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) bzw. 1.954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), was Expansionsfaktoren von 4,0-fach, 4,7-fach bzw. 4,9-fach entspricht (Abbildung 3C). Die intraexperimentelle Variation zwischen den Gelen war viel weniger auffällig als die interexperimentelle Variation, die etwa 20 % betrug (Abbildung 3C). Um die Auswirkungen von ExM auf die Zell- und Embryomorphologie zu beurteilen, wurde ein Antikörper gegen die adhärenzköpfige Verbindungskomponente Par-3 (Bazooka)21 verwendet, um die apikalen Zellmembranen zu markieren, und wir bildeten die sich entwickelnden Mundsegmente von Drosophila-Embryonen im Stadium 11 ab – einem Stadium mit einer komplexen segmentierten Struktur (Abbildung 3D-F). In der Kontrollprobe wiesen die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 4,76 μm auf (SD = 1,053 μm, n = 25; Abbildung 3D,F). In den erweiterten Proben, die mit dem gleichen 40-fachen Objektiv und Zoomfaktor (1x) abgebildet wurden, hatten die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Abbildung 3E,F), die eine 4,0-fache Ausdehnung darstellt. Daher waren wir in Übereinstimmung mit früheren Berichten11 in der Lage, Drosophila-Embryonen mit Hilfe von ExM in linearen Dimensionen um etwa das Vierfache zu erweitern, ohne dass die Proben zerrissen oder offensichtliche Verzerrungen in der Zell- oder Gewebemorphologie auftraten.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Abbildung 3: Vierfache Expansion von Drosophila-Embryonen. (A) Unexpandierte und (B) expandierte Drosophila-Embryonen, aufgenommen mit einem 10-fachen Objektiv (0,3 NA) bei 1-fachem Zoom. Einzelne Sichtfelder (FOV) sind mit gestrichelten Linien gekennzeichnet. Die Embryonen exprimierten eine GFP-markierte Version der Myosin-Leichtkette und wurden mit einem Anti-GFP-Antikörper gefärbt. (C) Quantifizierung der Embryonenlänge (entlang der Kopf-zu-Schwanz-Achse) in drei Hydrogelen pro Experiment und aus drei separaten ExM-Experimenten im Vergleich zu nicht expandierten Kontrollen. (D,E) Oberkiefersegmente von (D) unexpandierten und (E) expandierten Drosophila-Embryonen im Stadium 11, aufgenommen mit einem 40-fachen Objektiv (1,3 NA) bei 1-fachem Zoom. Die Zellumrisse (adhärens junctions) wurden mit einem Anti-Par-3/Bazooka-Antikörper (weiß) detektiert. (F) Quantifizierung der Zellbreite (Längsachse) aus äquivalenten Zellgruppen aus (D) und (E). Die Boxplots in (C) und (F) zeigen den Bereich des 25., 50. und 75. Perzentils. die Schnurrhaare zeigen die Minimal- und Maximalwerte an; Die "+"-Symbole geben den Mittelwert an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um zu zeigen, dass ExM verwendet werden kann, um subzelluläre Details unterhalb der typischen Beugungsgrenze aufzulösen, wurde das Actomyosin-Zytoskelett in unexpandierter Kontrolle im Vergleich zu expandierten Embryonen in konvergenter Extension (Stadium 7) abgebildet. Die Gewebeumbauereignisse der Gastrulation und konvergenten Extension werden weitgehend durch Veränderungen in der Lokalisation des Motorproteins Myosin II II24 gesteuert. Im dicht gepackten säulenförmigen Epithel des frühen Drosophila-Ektoderms ist es jedoch schwierig, viele feine Details des Myosin-II-Lokalisierungsmusters zu beobachten, selbst wenn es mit 158-facher Vergrößerung (63-faches Objektiv mit einem 2,5-fachen optischen Zoom) aufgenommen wird – ein typisches maximales Auflösungsvermögen für ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Da es sich bei Myosin II beispielsweise um ein kortikales Protein handelt (das sich direkt unter der Plasmamembran befindet), waren Pools von Myosin II25 , die sich auf beiden Seiten der Zell-Zell-Kontakte befanden, in Embryonen im Stadium 7 nicht auflösbar, und sie erschienen als eine einzige Linie, in der benachbarte Zellen aufeinandertrafen (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu konnten in expandierten Embryonen im Stadium 7 parallele Linien von Myosin II an Zell-Zell-Verbindungen beobachtet werden, die kortikale Proteinpools in benachbarten Zellen darstellen (Abbildung 4B). Der Abstand zwischen parallelen Myosin-II-Linien in expandierten Proben betrug 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); geteilt durch vier ergibt dies einen vorhergesagten Abstand von ~220 nm zwischen den Myosinlinien in benachbarten Zellen in unexpandierten Embryonen, was in der Tat knapp unter der Beugungsgrenze für ein mit Alexa 488 detektiertes Signal liegt (maximale Emission von ~520 nm/2 = 260 nm).
Darüber hinaus haben wir auch getestet, ob ExM verwendet werden kann, um die mitochondriale Netzwerkarchitektur in dicht gepackten Zellen von gastrulierenden Drosophila-Embryonen (Stadium 6) aufzulösen. Die mitochondriale Funktion ist eng mit der Netzwerkstruktur verbunden (d. h. fusionierte vs. fragmentierte Organellen), aber die Details der mitochondrialen Netzwerkorganisation sind mit konventioneller konfokaler Mikroskopie in Zelltypen, die nicht flach und/oder dünn sind, schwer zu visualisieren. Mitochondrien sind von Natur aus reich an biotinylierten Molekülen, und daher können Mitochondrien im frühen Drosophila-Embryo mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidinmarkiert werden 26. Bei den nicht expandierten Embryonen im Stadium 6, die mit Streptavidin-Alexa 488 markiert waren, erschien das Signal als zytoplasmatische Punkte, die sich oft überlappten und schwer aufzulösen waren (Abbildung 4C). Im Gegensatz dazu waren in den erweiterten Embryonen im Stadium 6 viel mehr feine Details des mitochondrialen Netzwerks sichtbar und die Puncta waren leichter auflösbar (Abbildung 4D)26,27. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ExM verwendet werden kann, um die mitochondriale Netzwerkorganisation in Zelltypen zu untersuchen, die traditionell nicht für die mitochondriale Analyse geeignet sind.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Details des Actomyosin-Zytoskeletts und der Mitochondrien, die durch Expansionsmikroskopie enthüllt wurden. (A,B) Myosin-II-Lokalisation in Neuroektodermzellen (Keimband), aufgenommen mit einem 63-fachen Objektiv (1,4 NA) bei 2,5-fachem Zoom in Stadium 7 (A) unexpandierten und (B) expandierten Embryonen. Myosin II wurde in den Embryonen nachgewiesen, die eine transgene GFP-markierte Version der Myosin II regulatorischen Leichtkette (sqh-GFP) exprimierten, die mit einem Anti-GFP-Antikörper (rot) nachgewiesen wurde. Unterschiedliche Pools von kortikalem Myosin, die sich in benachbarten Zellen befinden, können im expandierten Embryo aufgelöst werden (weiße Pfeile). (C,D) Mitochondriale Netzwerke in Neuroektodermzellen, die mit einem 63× Objektiv (1,4 NA) bei 2,5-fachem Zoom in unexpandierten (C) und expandierten (D) Embryonen im Stadium 6 abgebildet wurden. Die Mitochondrien wurden mit Streptavidin-Alexa 488 (grün) und die Zellumrisse mit einem Anti-Par-3/Bazooka-Antikörper (magenta) detektiert. Die Experimente wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Rezepte für Lösungen. Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen in der Reihenfolge ihres Auftretens. Alle Aktien sind, sofern nicht anders angegeben, liquid. Die Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, in autoklaviertem gefiltertem Wasser resuspendiert oder verdünnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Implementierung der Expansionsmikroskopie in frühen Drosophila-Embryonen vorgestellt, um eine hochauflösende Bildgebung mit einem konventionellen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu erreichen.

Verwendung von Expansionsmikroskopie zur physikalischen Vergrößerung ganzer Drosophila-Embryonen für hochauflösende Bildgebung

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Dieses Protokoll kann in den meisten Labors für Entwicklungsbiologie der Speiseröhre implementiert werden, so dass Forscher, die keinen Zugang zu hochauflösenden Mikroskopen haben, hochauflösende Bilder erstellen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, die Beugungsgrenze der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie zu umgehen, ohne dass ein hochauflösendes Mikroskop erforderlich ist, indem sie die Probe selbst erweitern. Dieses Protokoll wird für diejenigen von Vorteil sein, die untersuchen, wie sich die Lokalisierung von Proteinen auf die Zellmorphologie oder -funktion in intakten Embryonen auswirkt, insbesondere wenn diese Proteine in komplexen subzellulären Strukturen oder Netzwerken organisiert sind.Das häufigste Problem, auf das Menschen stoßen, ist der Verlust von Embryonen während des gesamten Protokolls. Es ist ratsam, mehrere Schichten Poly-L-Lysin aufzutragen, um die Embryonen fest zu kleben. Nach den Embryonen nehmen Sie eine sechs Zentimeter lange Petrischale aus Kunststoff, die zur Hälfte mit 3%igem Agar gefüllt ist.Ein fünf mal drei Zentimeter großes Rechteck mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell in den Agar ritzen. Entfernen Sie die Agarplatte mit einem kleinen Laborspatel. Drehen Sie dann den Boden der Petrischale um, stellen Sie sie auf die Bank und legen Sie die Agarplatte auf die umgedrehte Schale.Nehmen Sie den Deckel von der Petrischale ab und stellen Sie sicher, dass sie trocken ist. Kleben Sie mit Handschuhen ein Stück doppelseitiges Klebeband auf die Innenseite des Deckels. Nehmen Sie die Fläschchen mit den beschichteten und fixierten Embryonen aus dem Schüttler und stellen Sie sie senkrecht auf die Werkbank.Lassen Sie die organische und die wässrige Phase trennen. Richtig fixierte Embryonen sollten an ihrer Schnittstelle verbleiben. Entfernen Sie die untere wässrige Phase mit einer Pasteurpipette und einer P200-Pipette vollständig.Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, die mit einem Latexkolben ausgestattet ist, um die fixierten Embryonen in mehreren kleinen Chargen auf eine Agarplatte zu übertragen, damit sie nicht an der Innenseite der Pipette haften. Sobald sich die Embryonen auf der Agarplatte befinden, verwenden Sie eine P200-Pipette, um das verbleibende Heptan in der Nähe der Embryonen zu entfernen. Lassen Sie nun den doppelseitigen Klebebanddeckel aus einer Höhe von zwei Zentimetern auf die Agarplatte fallen, um die Embryonen auf das Klebeband zu kleben.Nehmen Sie vorsichtig den Deckel von der Agarplatte ab, legen Sie ihn kopfüber auf die Bank und fügen Sie genügend PBS Tween hinzu, um die Embryonen im Deckel zu bedecken. Um die gewünschten Embryonen zu entnehmen, verwenden Sie ein Stereo-Präpariermikroskop mit 100-facher Vergrößerung und indirekter Beleuchtung. Stechen Sie mit einer feinen Glasnadel in die Vitellinmembran in der Nähe des vorderen oder hinteren Endes des Embryos, um sie zu entleeren und den Druck abzulassen.Verwenden Sie eine feine Pinzette oder eine Metallsonde, um den Embryo vorsichtig durch das Loch zu drücken, während die Vitelline-Membran noch auf dem doppelseitigen Klebeband klebt. Lassen Sie unerwünschte Embryonen auf dem Band. Verwenden Sie regelmäßig eine Pasteurpipette aus Glas, um schwimmende devitellinisierte Embryonen aufzufangen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen zu bringen.Bereiten Sie die PDMS-Lösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor und erstellen Sie ein ausgeglichenes Röhrchen, indem Sie eine geeignete Menge Wasser in ein zweites konisches 50-Milliliter-Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die PDMS-Lösung bei 500 G drei Minuten lang bei 15 Grad Celsius. Anschließend gießen Sie es in eine 10 Zentimeter lange Petrischale bis zu einer Tiefe von einem Millimeter.Lassen Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 55 Grad Celsius erstarren. Sobald die PDMS-Platte erstarrt ist, ritzen Sie quadratische Bereiche, die etwas kleiner als ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas sind, mit einem Skalpell ein. In jedem Quadrat eine acht Millimeter breite quadratische Mulde einritzen und entfernen.Übertragen Sie jede quadratische PDMS-Mulde auf ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas und kleben Sie es fest. Um die Embryonen auf die Deckgläser zu kleben, tragen Sie genügend 0,1%Poly-L-Lysin auf, um die Deckglasoberfläche in jeder Vertiefung zu bedecken, und legen Sie sie zum Trocknen in einen 55 Grad Celsius heißen Inkubator. Spülen Sie die Embryonen und PBS kurz ab, um das Tween-Reinigungsmittel zu entfernen.Übertragen Sie dann mehr als 10 Embryonen in jede mit Poly-L-Lysin beschichtete Vertiefung. Lassen Sie die Embryonen sich auf dem Boden der Vertiefungen niederlassen. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Pasteurpipette aus den verklebten Embryonen und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.Während die Embryonen in der Monomerlösung sitzen, bereiten Sie eine Gelierungslösung vor, um die PDMS-Vertiefungen zu bedecken. Verdünnen Sie das katalytische Oxidationsmittel frisch aus dem Pulver. Kombinieren Sie 3.920 Mikroliter Monomerlösung mit 60 Mikrolitern 10 % TEMED und 20 Mikrolitern 1 % TEMPO.Teilen Sie die Gelierlösung in 125-Mikroliter-Aliquoten in mehrere PCR-Röhrchen auf. Entfernen Sie die Monomerlösung mit einem Vakuum oder einer Pipette aus den PDMS-Vertiefungen, wobei Sie darauf achten müssen, die Embryonen nicht zu stören. Geben Sie fünf Mikroliter APS in eines der PCR-Röhrchen mit der Gelierlösung, um die Polymerisation einzuleiten.Verteilen Sie die polymerisierende Gelierungslösung schnell auf die drei Vertiefungen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Vertiefungen und Embryonen bedeckt sind. Lassen Sie die Proben 1,5 bis 2,5 Stunden bei 37 Grad Celsius gelieren.Dickere Hydrogele brauchen länger, um die Polymerisation abzuschließen und sich zu verfestigen. Rühren Sie die Hydrogele häufig um, um die Polymerisation zu überwachen. Einmal erstarrt, wackeln Hydrogele nicht mehr.Ziehen Sie nach der Gelierung die PDMS-Vertiefungen aus dem Deckglas ab, ohne die Hydrogele zu stören. Übertragen Sie die Hydrogele einzeln in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Die Hydrogele können sich während der Verdauung leicht ausdehnen.Bedecken Sie die Gele vollständig mit Verdauungspuffer. 30 Milliliter Aufschlusspuffer reichen aus, um sie in eine Sechs-Well-Platte zu hüllen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Nach dem Aufschluss werden die Hydrogele in eine sechs Zentimeter lange Petrischale gegeben und mit deionisiertem Wasser gefüllt, um sich auszudehnen.Die Hydrogele können sich an dieser Stelle von den Deckgläsern lösen und sich in linearer Dimension um vier Faltungen ausdehnen. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette so viel überschüssiges Wasser wie möglich aus der Petrischale, um die Bewegung der Gele bei der Handhabung zu minimieren. Manövrieren Sie die expandierten Gele mit den Embryonen auf der Unterseite auf ein großes Deckglas für die Bildgebung.Montieren Sie jedes Deckglas mit Gel über das Objektiv eines inversen konfokalen Laserscanning-Mikroskops. Nach der Lokalisierung der richtig inszenierten und ausgerichteten Proben wurde auf ein Öl- oder Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung umgestellt, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. Die Messung der Embryonenlänge entlang der Kopf-Schwanz-Achse unter einem 10-fachen Objektiv zeigte, dass nicht expandierte Embryonen etwa die Hälfte eines Gesichtsfeldes umfassten, während die expandierten Embryonen etwa zwei volle Gesichtsfelder umfassten.Die durchschnittliche Kopf-zu-Schwanz-Länge der unexpandierten Kontrollembryonen betrug 398,8 Mikrometer. Für die Experimente eins, zwei und drei betrugen die durchschnittlichen Embryolängen Expansionsfaktoren um das 4,0-fache, 4,7-fache bzw. 4,9-fache. In der Kontrollprobe wiesen die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 4,76 Mikrometern auf.In den expandierten Proben wiesen die Zellen im Oberkiefersegment eine durchschnittliche Breite von 19,10 Mikrometern auf, was einer 4,0-fachen Ausdehnung entspricht. Das Actomyosin-Zytoskelett wurde in unexpandierter Kontrolle im Vergleich zu expandierten Embryonen mit konvergenter Extension abgebildet. Sie erschienen als eine einzige Linie, in der benachbarte Zellen aufeinandertrafen.Im Gegensatz dazu konnten bei Embryonen im erweiterten Stadium sieben parallele Linien von Myosin zwei an Zellübergängen beobachtet werden, die kortikale Proteinpools in benachbarten Zellen darstellen. In den nicht expandierten Embryonen des sechsten Stadiums erschienen die mit Streptavidin markierten Mitochondrien als heterogener zytoplasmatischer Schleier ohne klare subzelluläre Details. In den expandierten Embryonen waren jedoch zahlreiche Punkte im Zytoplasma auflösbar, die wahrscheinlich fragmentierte Mitochondrien oder Teile des mitochondrialen Netzwerks darstellten.Eine wichtige Sache, die Sie bei diesem Verfahren beachten sollten, ist, die Embryonen nach der Inkubation der sekundären Antikörper vor übermäßiger Lichtexposition zu schützen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...