Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ג'ניפר זאלן על מתן הנוגדן הראשוני נגד Par-3 של השרקן. עבודה זו נתמכה על ידי מימון נדיב (1R15GM143729-01 ו- 1P20GM139768-01 5743) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS), אחד מחברי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), כמו גם המכון הביולוגי של ארקנסו (ABI), שסיפק מימון חלקי לרכישת המיקרוסקופ הקונפוקלי שלנו.

     

<ol>
	<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging.+Expansion+microscopy.">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Chang, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex.">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li><li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons.">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy.">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li><li>Yu, C. -. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+C.+elegans.">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249 (2020).</li><li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies.">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+in+ionic+gels.">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li><li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues.">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila apple juice-agar plates. , (2011).</li><li>de Matos Sim&#245;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+directs+bazooka/Par-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation.">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Par&#233;, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation.">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization.">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li><li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy.">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy.">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li><li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context.">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).</li><li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+revealing:+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures.">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

סטייה ידנית רוב פרוטוקולי קיבוע העוברים של דרוזופילה כוללים הסרת קרום ויטלין על ידי ניעור עוברים קבועים בתחליב של מתנול והפטאן, מה שגורם לקרומים להתפוצץ באמצעות קרע אוסמוטי26. בעוד devitellinization מבוסס מתנול (מתנול popping) הוא יעיל ומתאים עבור יישומים רבים, devitellinization ידני (פילינג ידני) מציע כמה יתרונות משמעותיים. ראשית, קילוף ידני מאפשר לבחור עוברים בשלבים מדויקים לסטייה ואיסוף, מה שמגדיל מאוד את הסיכוי להשיג עוברים מורחבים בכיוון שמיש בסוף הניסוי. העשרה זו היא קריטית כאשר לומדים היבטים ספציפיים של תהליכים התפתחותיים מהירים (למשל, חדירה מזודרם או הרחבה מתכנסת), שעבורם עוברים בשלבים מתאימים עשויים לייצג רק אחוזים בודדים מכלל העוברים, אפילו בתוך חלון איסוף מתוזמן היטב. כמובן, עבור יישומים רבים, מתנול בתפזורת מסורתית יותר קופץ של עוברים מחלון איסוף מתוזמן יהיה מספיק, קילוף ידני לא יכול להיות שווה את המאמץ הנוסף. שנית, קשירה של נוגדנים וצבעים ראשוניים מסוימים מושפעת לרעה מחשיפה קודמת של הדגימה למתנול. מסיבה זו, קילוף ידני יכול להניב עלייה משמעותית באיכות האות האימונופלואורסצנטי בהשוואה לדגימות עם מתנול, מה שהופך אותו לטכניקה כללית שימושית עבור ביולוגים התפתחותיים של דרוזופילה .
מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה בעוברי דרוזופילה מורחבים בהרכבה שלמה בעוד ביצוע מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה על דגימות מורחבות זהה מבחינה רעיונית לדגימות לא מורחבות, ExM מציג כמה מכשולים טכניים. יש לציין כי כיוון העובר, שהוא אקראי, הופך חשוב עוד יותר ככל שגודל המדגם גדל, מכיוון שמטרות בעלות הגדלה גבוהה ו-NA גבוהות מסוגלות למקד אור רק מאזורי דגימה הקרובים מאוד לכיסוי27. לכן, בדרך כלל ניתן להתמקד רק בתאים על או בסמוך לפני השטח של העובר שבסופו של דבר היה צמוד לכיסוי כאשר הג'ל נוצר. הדרך הטובה ביותר להבטיח שיש דגימות בכיוון הנכון בסוף היא להתחיל את פרוטוקול ExM עם אוסף מבוים היטב של עוברים קבועים (למשל, באמצעות קילוף ידני) ולזרוע עוברים רבים בכל באר (>10). כדי להמחיש תאים עמוק בתוך העובר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במערכי הדמיה מיוחדים יותר, כגון מיקרוסקופ גיליון אור28. בנוסף, אנו מוצאים כי ניתן לשפר את איכות התמונה על ידי פתיחת חור הסיכה הקונפוקלי לגודל גדול מיחידה אוורירית אחת. כמובן, הגדלת גודל חור הסיכה תבוא במחיר של ירידה ברזולוציה המקסימלית, אך בפועל, אפילו עליות קטנות בגודל חור הסיכה יכולות להגביר משמעותית את עוצמת האות (נתונים שאינם מוצגים). מחקרים עתידיים צריכים להתייחס באופן שיטתי לגודל חור הסיכה ולרזולוציה היעילה בדגימות ExM.
וריאציות על ExM בסיסי הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה פשוטה יחסית של ExM שאמור לעבוד עבור יישומים רבים ולהיות קל ליישום ברוב מעבדות הביולוגיה ההתפתחותית. עם זאת, ישנן וריאציות רבות על הרעיון הבסיסי של ExM 4,5,7 שניתן להשתמש בהן כדי להגביר את עוצמת האות, להשיג דרגות התרחבות נוספות ולזהות מולקולות חומצות גרעין כמו גם חלבונים. בפרוטוקול זה, העוברים מודגרים עם נוגדנים לפני הג'לציה וההרחבה. לחלופין, ניתן לטפל בדגימות באמצעות נוגדנים לאחר הרחבתן 6,30, מה שיכול להגביר את עוצמת האות עקב נגישות מוגברת לאפיטופים וירידה באובדן נוגדנים קשורים במהלך שלבי ההתפשטות. בנוסף, ניתן להשתמש במולקולות קרוסלינקר ספציפיות כדי להצמיד מולקולות RNA להידרוג'ל כדי לאפשר זיהוי של RNA בג'לים מורחבים באמצעות שיטת תגובת שרשרת הכלאה30. לבסוף, הדגימות יכולות להיות נתונות לסבבי הרחבה מרובים, כמו במיקרוסקופ הרחבה איטרטיבי (iExM)31, pan-ExM32 וחשיפת הרחבה (ExR)31, כדי להשיג דרגות גבוהות עוד יותר של רזולוציה מוגברת.

בביולוגיה תאית והתפתחותית, ראייה היא אמונה, והיכולת לקבוע במדויק את דפוסי הלוקליזציה של חלבונים היא בסיסית לסוגים רבים של ניסויים. מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הוא הכלי הסטנדרטי להדמיית חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בשלושה ממדים בתוך דגימות שלמות. מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים אינם מסוגלים להבחין (לפתור) אותות פלואורסצנטיים סמוכים המופרדים על ידי פחות ממחצית אורך הגל של האור שהם פולטים1. במילים אחרות, שני מקורות נקודתיים חייבים להיות מופרדים על ידי לפחות 200-300 ננומטר בכיוון הצידי (500-700 ננומטר בכיוון הצירי) כדי לפתור אותם כשני אותות נפרדים. מחסום טכני זה ידוע כגבול העקיפה, והוא מהווה מכשול בסיסי למחקרים של מבנים תת-תאיים מורכבים (למשל, שלד שלד אקטומיוזין או רשתות מיטוכונדריאליות) עם תכונות מרחביות מתחת לגבול העקיפה. לכן, טכניקות להגדלת כוח הפתרון של מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים הם בעלי עניין כללי לקהילה הביולוגית.
כדי לעקוף את מגבלת העקיפה, פותחו מספר טכנולוגיות שונות של מיקרוסקופיה ברזולוציית על המאפשרות רזולוציה בסדר גודל של עשרות ננומטרים או פחות 1,2,3, וחושפות עולם של מורכבות ביולוגית שהיה נגיש בעבר רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. למרות היתרונות הברורים של שיטות מבוססות חומרה אלה, למיקרוסקופים ברזולוציית על יש לעתים קרובות דרישות ספציפיות לסימון דגימות וזמני רכישה ארוכים, המגבילים את גמישותם, או שהם פשוט יקרים מדי עבור מעבדות מסוימות לגשת אליהם. חלופה לסופר-רזולוציה מבוססת מיקרוסקופ היא מיקרוסקופ התפשטות (ExM), שאינו סוג של מיקרוסקופ כשלעצמו אלא שיטה לניפוח דגימה תוך שמירה על הארגון המרחבי היחסי של המולקולות המרכיבות אותה4. לאחר מכן ניתן לצפות בדגימות המורחבות איזוטרופית ברזולוציה מוגברת ביעילות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי מסורתי. ExM תוארה לראשונה על ידי קבוצת בוידן בשנת 20155, והטכניקה הבסיסית הותאמה מאז לשימוש במגוון ניסויים 6,7,8. ExM הותאם גם לשימוש בעוברים שלמים, בעיקר בדרוזופילה 9,10,11, C. elegans12 ודגי זברה 13, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה עבור ביולוגים התפתחותיים.
ExM מבוסס על שני כימי הידרוג'ל שונים: 1) הידרוג'ל פוליאלקטרוליטים מתנפחים, אשר גדלים מאוד כאשר הם מושרים במים14, ו -2) הידרוג'ל פוליאקרילאמיד, שיש להם מרווח פולימרי קטן מאוד כדי לאפשר הרחבת דגימה איזוטרופית15. למרות שישנם פרוטוקולי ExM רבים שפורסמו, הם בדרך כלל חולקים את השלבים הבאים: קיבוע דגימה, תיוג, הפעלה, ג'לציה, עיכול והרחבה4. תנאי הקיבוע ואסטרטגיות התיוג הפלואורסצנטי ישתנו כמובן בהתאם לצרכי הניסוי והמערכת, ובחלק מהפרוטוקולים התיוג מתרחש לאחר הרחבה. מולקולות המטרה בדגימה חייבות להיות מוכנות (מופעלות) להיקשרות להידרוג'ל, דבר שניתן להשיג באמצעות כימיות שונות4. במהלך שלבי הג'לציה, הדגימה רוויה במונומרים של ההידרוג'ל העתידי (נתרן אקרילט, אקרילאמיד וביסקרלאמיד קרוס-לינקר ), וההידרוג'ל נוצר לאחר מכן על ידי פילמור רדיקלים חופשיים המזורז על ידי יוזם, כגון אמוניום פרסולפט (APS), ומאיץ, כגון טטרמתילאנדיאמין (TEMED)4. לאחר הג'לציה, הדגימה מתעכלת אנזימטית כדי ליצור הומוגניזציה של עמידות הדגימה לנפיחות ולהבטיח את ההתרחבות האיזוטרופית של ההידרוג'ל4. לבסוף, הידרוג'ל מעוכל ממוקם במים, מה שגורם לו להתרחב בערך פי ארבעה בגודל ליניארי המקורי שלה4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> איור 1: סקירה כללית של מיקרוסקופ התפשטות בעוברי דרוזופילה . ExM הוא פרוטוקול רב-שלבי שהשלמתו נמשכת לפחות 4 ימים. איסוף, קיבוע ודייטליניזציה של עוברים נמשכים יום אחד או יותר, תלוי אם עוברים מאוספים מרובים מאוגמים. תיוג immunofluorescence לוקח 1 יום או 2 ימים, תלוי אם העוברים מודגרים לילה עם הנוגדנים הראשוניים. הפעלת עוברים, גלציה, עיכול והרחבה יכולים להתבצע ביום אחד. הג'לים יכולים להיות מורכבים והדמיה מיד לאחר הרחבה, אם כי מסיבות מעשיות רצוי לעתים קרובות להתחיל הדמיה למחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ExM בעוברי דרוזופילה 16 בשלב מוקדם עד בינוני כדי להמחיש תבניות לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים ברזולוציית על (איור 1). שיטה זו משתמשת בכימיה של חומצה מתילאקרילית N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) כדי להפעיל ולעגן מולקולות חלבון להידרוג'ל17, והיא שינוי של פרוטוקול ExM שפורסם בעבר לשימוש בעוברים ורקמות דרוזופילה בשלב מאוחר11. פרוטוקול זה משתמש בבארות פולידימתילסילוקסאן (PDMS) כדי לעצב את ההידרוג'לים ולהקל על החלפת תמיסות במהלך ההפעלה והג'לציה. שיטה חלופית שאינה דורשת יצירת בארות PDMS כוללת הורדת עוברים המחוברים לכיסויים לטיפות של תמיסת מונומר המונחת על פיסת סרט איטום מעבדה22. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של קרום ויטלין בלתי חדיר המקיף עוברי דרוזופילה , שהוא תנאי מוקדם לצביעת אימונופלואורסצנטיות. חשוב לציין, שיטה זו של קילוף ידני של עוברים יכולה לשמש לבחירת רק עוברי דרוזופילה בשלבים נכונים לפני תיוג הדגימה, מה שמגדיל מאוד את הסיכוי להגיע לדגימות מורחבות של השלב והכיוון הנכונים, ובכך הופך את איסוף הנתונים במורד הזרם להרבה יותר יעיל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

סוס העבודה של הביולוגיה ההתפתחותית הוא המיקרוסקופ הקונפוקלי, המאפשר לחוקרים לקבוע את הלוקליזציה התלת-ממדית של מולקולות מתויגות בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. בעוד שמיקרוסקופים קונפוקליים מסורתיים מאפשרים לזהות שני מקורות נקודתיים פלואורסצנטיים סמוכים הממוקמים במרחק של כמה מאות ננומטרים זה מזה, התבוננות בפרטים הקטנים יותר של הביולוגיה התת-תאית דורשת יכולת לפענח אותות בסדר גודל של עשרות ננומטרים. שיטות מבוססות חומרה רבות למיקרוסקופיה ברזולוציית על פותחו כדי לאפשר לחוקרים לעקוף מגבלות רזולוציה כאלה, אם כי שיטות אלה דורשות מיקרוסקופים מיוחדים שאינם זמינים לכל החוקרים. שיטה חלופית להגדלת כוח הפענוח היא הגדלה איזוטרופית של הדגימה עצמה באמצעות תהליך המכונה מיקרוסקופ הרחבה (ExM), אשר תואר לראשונה על ידי קבוצת בוידן בשנת 2015. ExM אינו סוג של מיקרוסקופ כשלעצמו אלא שיטה לניפוח דגימה תוך שמירה על הארגון המרחבי היחסי של המולקולות המרכיבות אותה. לאחר מכן ניתן לצפות בדגימה המורחבת ברזולוציה מוגברת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מסורתי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ליישום ExM בעוברי דרוזופילה שלמים, המשמש לבחינת לוקליזציה של Par-3, מיוזין II ומיטוכונדריה בתוך תאי אפיתל פני השטח. פרוטוקול זה מניב גידול של בערך פי ארבעה בגודל הדגימה, ומאפשר זיהוי של פרטים תת-תאיים שאינם נראים במיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונלי. כהוכחה עקרונית, נוגדן אנטי-GFP משמש להבחנה בין מאגרים נפרדים של מיוזין-GFP בין קליפות תאים סמוכות, וסטרפטאבידין המסומן פלואורסצנטית משמש לזיהוי מולקולות ביוטיניליות אנדוגניות כדי לחשוף את הפרטים הקטנים של ארכיטקטורת הרשת המיטוכונדריאלית. פרוטוקול זה משתמש בנוגדנים וריאגנטים נפוצים לסימון פלואורסצנטי, והוא צריך להיות תואם לפרוטוקולים חיסוניים קיימים רבים.

כדי לאפיין את היעילות הכללית של ExM בעוברי דרוזופילה שלמים, אורך העובר לאורך ציר הראש-זנב נמדד בעוברי ביקורת לא מורחבים לעומת עוברים מורחבים (איור 3A-C). עוברי הבקרה הבלתי מורחבים היו נתונים לאותם תנאי קיבוע ושלבי תיוג אימונופלואורסנציה כמו העוברים המורחבים, אלא שהם הותקנו באמצעות אמצעי הרכבה מוצק לפני ההדמיה. העוברים הבודדים שלא התרחבו השתרעו על פני כמחצית משדה הראייה כאשר השתמשו במטרה של פי 10 (איור 3A). לעומת זאת, העוברים המורחבים השתרעו על פני כשני שדות ראייה מלאים כאשר השתמשו באותה מטרה של פי 10 (איור 3B). כדי להעריך כיצד מידת ההתפשטות השתנתה בתוך ובין ניסויים, אותו פרוטוקול ExM בוצע בשלוש הזדמנויות שונות, ואורך העובר נמדד בשלושה ג'לים שונים בתוך כל ניסוי בנפרד. אורך הראש עד הזנב הממוצע של עוברי הביקורת הבלתי מורחבים היה 398.8 מיקרומטר (סטיית תקן [SD] = 22.93 מיקרומטר; n = 74; איור 3C). עבור ניסוי 1, ניסוי 2 וניסוי 3, אורכי העובר הממוצעים היו 1,596 מיקרומטר (SD = 159.9 מיקרומטר; n = 57), 1,868 מיקרומטר (SD = 150.5 מיקרומטר; n = 51), ו- 1,954 מיקרומטר (SD = 120.3 מיקרומטר; n = 44), בהתאמה, המייצגים גורמי התפשטות של פי 4.0, פי 4.7 ופי 4.9, בהתאמה (איור 3C). השונות התוך-ניסויית בין הג'לים הייתה הרבה פחות מורגשת מאשר השונות הבין-ניסויית, שהייתה בערך 20% (איור 3C). כדי להעריך את ההשפעות של ExM על המורפולוגיה של התאים והעוברים, נעשה שימוש בנוגדן כנגד רכיב צומת הדבקים Par-3 (Bazooka)21 כדי לסמן את קרומי התאים האפיקאליים, ודימנו את מקטעי הפה המתפתחים של עוברי דרוזופילה בשלב 11 – שלב עם מבנה מקוטע מורכב (איור 3D-F). במדגם הבקרה, התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 4.76 מיקרומטר (SD = 1.053 מיקרומטר, n = 25; איור 3D,F). בדגימות המורחבות שצולמו באמצעות אותו גורם מטרה וזום של 40x (1x), התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 19.10 מיקרומטר (SD = 3.966 מיקרומטר, n = 18; איור 3E,F), המייצג התרחבות של פי 4.0. לכן, בהתאם לדיווחים קודמים11, הצלחנו להרחיב עוברי דרוזופילה שלמים בערך פי ארבעה בממדים ליניאריים באמצעות ExM ללא קריעת דגימה או עיוותים ברורים במורפולוגיה התאית או הרקמה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> איור 3: התרחבות פי ארבעה של עוברי דרוזופילה. (A) עוברי דרוזופילה לא מורחבים ו-(B) מורחבים שצולמו באמצעות מטרה של 10x (0.3 NA) בזום 1x. שדות תצוגה בודדים (FOV) מסומנים בקווים מקווקוים. העוברים ביטאו גרסה מתויגת GFP של שרשרת אור מיוזין והיו מוכתמים בנוגדן אנטי GFP. (C) כימות אורך העובר (לאורך ציר הראש-זנב) בשלושה הידרוג'לים בכל ניסוי ומשלושה ניסויי ExM נפרדים בהשוואה לבקרות לא מורחבות. (ד,ה) מקטעים מקסילריים מ-(D) עוברים לא מורחבים ו-(E) שלב 11 מורחב של דרוזופילה שצולמו באמצעות מטרה של 40x (1.3 NA) בזום 1x. קווי המתאר של התא (צמתים נצמדים) זוהו עם נוגדן אנטי Par-3/Bazooka (לבן). (F) כימות רוחב התא (ציר ארוך) מקבוצות מקבילות של תאים מ-(D) ו-(E). תרשימי התיבות ב-(C) ו-(F) מציגים את טווחי האחוזונים ה-25, ה-50 וה-75; השפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום; הסמלים "+" מציינים את הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי להדגים שניתן להשתמש ב-ExM כדי לפתור פרטים תת-תאיים מתחת לגבול העקיפה האופייני, שלד הציטו-טקטומיוסין צולם בבקרה לא מורחבת לעומת עוברים מורחבים שעברו הרחבה מתכנסת (שלב 7). אירועי עיצוב מחדש של רקמות של גסטרולציה והרחבה מתכנסת נשלטים במידה רבה על ידי שינויים בלוקליזציה של החלבון המוטורי מיוזין II24. עם זאת, באפיתל העמודים הצפוף של אקטודרם דרוזופילה המוקדם, קשה להבחין בפרטים עדינים רבים של תבנית הלוקליזציה של מיוזין II, אפילו כאשר הם מצולמים בהגדלה של 158x (63x אובייקטיבי עם זום אופטי של 2.5x) – עוצמת פתרון מקסימלית טיפוסית עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. לדוגמה, מאחר שמיוזין II הוא חלבון בקליפת המוח (הממוקם ישירות מתחת לקרום הפלזמה), מאגרים של מיוזין II25 הממוקמים משני צדי המגעים של תאי התא לא היו פתירים בעוברים בשלב 7, והם הופיעו כקו יחיד שבו תאים שכנים נפגשו (איור 4A). לעומת זאת, בעוברים מורחבים בשלב 7 ניתן היה לראות קווים מקבילים של מיוזין II בצמתים בין תאים, המייצגים מאגרי חלבונים בקליפת המוח בתאים סמוכים (איור 4B). המרחק בין קווי מיוזין II מקבילים בדגימות מורחבות היה 892.7 ננומטר (SD = 0.171 ננומטר, n = 12); כאשר מחלקים זאת בארבעה, זה מניב מרחק חזוי של ~220 ננומטר בין קווי המיוזין בתאים סמוכים בעוברים לא מורחבים, שהוא אכן מעט מתחת לגבול העקיפה עבור אות שזוהה עם Alexa 488 (פליטת שיא של ~520 ננומטר / 2 = 260 ננומטר).
בנוסף, בדקנו גם אם ניתן להשתמש ב-ExM כדי לפתור את ארכיטקטורת הרשת המיטוכונדריאלית בתאים צפופים של עוברי דרוזופילה גסטרולטים (שלב 6). תפקוד המיטוכונדריה קשור קשר הדוק למבנה הרשת (כלומר, אברונים מאוחים לעומת אברונים מקוטעים), אך קשה לדמיין את פרטי ארגון הרשת המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי בסוגי תאים שאינם שטוחים ו/או דקים. מיטוכונדריה עשירים באופן טבעי במולקולות ביוטינילציה, ולכן ניתן לתייג מיטוכונדריה בעובר דרוזופילה מוקדם באמצעות סטרפטאבידין26 המסומן באופן פלואורסצנטי. בעוברים בשלב 6 הלא מורחבים שסומנו עם סטרפטווידין-אלקסה 488, האות הופיע כפונקטה ציטופלזמית שלעתים קרובות הייתה חופפת וקשה לפתור אותה (איור 4C). לעומת זאת, בעוברים המורחבים בשלב 6, פרטים עדינים רבים יותר של הרשת המיטוכונדריאלית נראו לעין ופונקטה היו ניתנים לפתרון בקלות רבה יותר (איור 4D)26,27. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש ב- ExM לחקר ארגון הרשת המיטוכונדריאלית בסוגי תאים שאינם מתאימים באופן מסורתי לניתוח מיטוכונדריאלי.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> איור 4: פרטים על שלד ציטו-כונדריה של אקטומיוזין ומיטוכונדריה שנחשפו במיקרוסקופ הרחבה. (A,B) לוקליזציה של מיוזין II בתאי נוירואקטודרם (germband) שצולמו עם מטרה של 63x (1.4 NA) בזום של 2.5x בשלב 7 (A) עוברים לא מורחבים ו-(B) מורחבים. מיוזין II זוהה בעוברים המבטאים גרסה טרנסגנית עם תג GFP של שרשרת האור הרגולטורית מיוזין II (SQH-GFP), אשר זוהתה עם נוגדן אנטי-GFP (אדום). מאגרים נפרדים של מיוזין קורטיקלי הממוקם בתאים סמוכים יכולים להיפתר בעובר המורחב (חיצים לבנים). (ג,ד) רשתות מיטוכונדריאליות בתאי נוירואקטודרם שצולמו עם מטרה של 63× (1.4 NA) בזום של 2.5x בשלב 6 עוברים לא מורחבים (C) ומורחבים (D). המיטוכונדריה זוהו עם סטרפטווידין-אלקסה 488 (ירוק), וקווי המתאר של התאים זוהו עם נוגדן אנטי-Par-3/בזוקה (מגנטה). הניסויים בוצעו במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מתכוני תמיסות. הרכב עבור הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה לפי סדר הופעתם. כל המניות נזילות אלא אם כן צוין אחרת. הכימיקלים הושעו מחדש או דוללו במים מסוננים אוטוקלאביים, אלא אם כן צוין אחרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ברוב מעבדות הביולוגיה ההתפתחותית של הוושט, ומאפשר לחוקרים שאין להם גישה למיקרוסקופים ברזולוציית על להפיק תמונות ברזולוציית על. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לעקוף את גבול העקיפה של מיקרוסקופ קונפוקלי קונקונבנציונלי ללא צורך במיקרוסקופ ברזולוציית על על ידי הרחבת הדגימה עצמה. פרוטוקול זה יועיל לאלה החוקרים כיצד לוקליזציה של חלבונים משפיעה על המורפולוגיה של התא או על תפקודו בעוברים שלמים, במיוחד כאשר חלבונים אלה מאורגנים במבנים תת-תאיים מורכבים או ברשתות.הבעיה הנפוצה ביותר שאנשים נתקלים בה היא אובדן עוברים לאורך כל הפרוטוקול. מומלץ להחיל מעילים מרובים של פולי-L-ליזין כדי להדביק את העוברים בחוזקה. לאחר העוברים יש לקחת בסיס צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר שישה ס"מ המלא בחציו ב-3% אגר.ציון מלבן חמישה על שלושה סנטימטרים באגר עם סכין גילוח או אזמל. מוציאים את לוח האגר בעזרת מרית מעבדה קטנה. לאחר מכן הופכים את בסיס צלחת הפטרי, מניחים אותה על הספסל ומניחים את לוח האגר על גבי הצלחת ההפוכה.הסירו את המכסה מצלחת הפטרי וודאו שהוא יבש. בעזרת כפפות, הדביקו פיסת סרט דו-צדדי לחלק הפנימי של המכסה. הוציאו את הבקבוקונים המכילים את העוברים המצופים והקבועים מהשייקר והניחו אותם במאונך על שולחן העבודה.אפשרו לשלב האורגני ולשלב המימי להיפרד. עוברים קבועים כראוי צריכים להישאר בממשק שלהם. הסר לחלוטין את הפאזה המימית התחתונה באמצעות פיפטת פסטר ופיפטה P200.השתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית המצוידת בנורת לטקס כדי להעביר את העוברים הקבועים על לוח אגר במספר אצוות קטנות, כך שלא יידבקו לחלק הפנימי של הפיפטה. ברגע שהעוברים נמצאים על לוח האגר, השתמש בפיטר P200 כדי להסיר את כל הפטן שנותר ליד העוברים. כעת, שחררו את מכסה הסרט הדו-צדדי על לוח האגר מגובה של שני סנטימטרים כדי להדביק את העוברים לקלטת.הסירו בעדינות את המכסה מלוח האגר, הניחו אותו הפוך על הספסל והוסיפו מספיק PBS Tween כדי לכסות את העוברים במכסה. כדי לאסוף את העוברים הרצויים, השתמש במיקרוסקופ מנתח סטריאו בהגדלה של פי 100 עם תאורה עקיפה. דוקרים את קרום הוויטלין ליד הקצה הקדמי או האחורי של העובר עם מחט זכוכית עדינה כדי לנפח אותו ולשחרר לחץ.השתמש במלקחיים עדינים או בבדיקה מתכתית כדי לדחוף בעדינות את העובר החוצה דרך החור כאשר קרום ויטלין עדיין דבוק לסרט הדו-צדדי. השאירו עוברים לא רצויים על הקלטת. מעת לעת להשתמש פיפטה פסטר זכוכית לאסוף כל עובר devitellinized צף ולהעביר אותם לצינור microfuge 1.5 מיליליטר.הכינו את תמיסת PDMS בצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצרו צינור מאוזן על ידי הוספת כמות מתאימה של מים לצינור חרוטי שני של 50 מיליליטר. צנטריפוגו את תמיסת PDMS ב-500G למשך שלוש דקות ב-15 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ לעומק של מילימטר אחד.אפשרו לתמיסת PDMS להתמצק במהלך הלילה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. לאחר מיצוי לוח PDMS, הניחו שטחים מרובעים הקטנים מעט מהחלקת כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר באמצעות אזמל. בתוך כל ריבוע, הניקוד והסר היטב ריבוע ברוחב שמונה מילימטר.העבירו היטב כל PDMS מרובע על מכסה בגודל 22 על 22 מ"מ והדביקו אותו היטב. כדי להדביק את העוברים לפתקי הכיסוי, יש למרוח מספיק 0.1% פולי-ל-ליזין כדי לכסות את משטח הכיסוי בתוך כל באר ולהניח אותם באינקובטור של 55 מעלות צלזיוס לייבוש. שטפו בקצרה את העוברים ואת PBS כדי להסיר את חומר הניקוי Tween.לאחר מכן להעביר יותר מ -10 עוברים לתוך כל פולי-L-ליזין מצופה היטב. אפשרו לעוברים לשקוע לתחתית הבארות. הסר את עודפי הנוזל מן העוברים דבק באמצעות פיפטה פסטר ומיד להמשיך לשלב הבא.בזמן שהעוברים יושבים בתמיסת המונומר, הכינו תמיסת ג'לציה לכיסוי בארות PDMS. לדלל את המחמצן הקטליטי טרי מהאבקה. שלב 3, 920 מיקרוליטר של תמיסת מונומר עם 60 מיקרוליטר של 10% TEMED ו 20 מיקרוליטר של 1% TEMPO.לפצל את תמיסת הג'לציה ב 125 microliter aliquots למספר צינורות PCR. הסר את תמיסת המונומר מבארות PDMS באמצעות ואקום או פיפטר תוך זהירות שלא להפריע לעוברים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של APS לאחד מצינורות ה- PCR המכילים תמיסת ג'לציה כדי להתחיל פילמור.מפזרים במהירות את תמיסת הג'לציה המתפלמרת בין שלוש הבארות. חזור על פעולה זו עד שכל הבארות והעוברים מכוסים. תן את הדגימות ג'ל במשך 1.5 עד 2.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.הידרוג'לים עבים יותר ייקח זמן רב יותר להשלים פילמור ולהתמצק. להתסיס את hydrogels לעתים קרובות כדי לפקח על פילמור. לאחר שהתמצקו, הידרוג'לים לא יתנוועעו.לאחר הג'לציה, מקלפים את בארות ה-PDMS מחליק הכיסוי מבלי להפריע להידרוג'לים. מעבירים את ההידרוג'לים בנפרד לבארות של צלחת שש בארות. ההידרוג'לים עשויים להתרחב מעט במהלך העיכול.מכסים את הג'לים לחלוטין עם חיץ העיכול. 30 מיליליטר של חיץ העיכול מספיק כדי לכסות אותם בצלחת שש בארות לדגור אותם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, להעביר את הידרוג'ל לתוך צלחת פטרי שישה ס"מ ולמלא אותו עם מים deionized כדי להתרחב.ההידרוג'לים עשויים להתנתק מחליקי הכיסוי בנקודה זו ולהתרחב ארבעה קפלים בממד ליניארי. בעזרת פיפטה של פסטר, הסירו כמה שיותר מים מצלחת הפטרי כדי למזער את תנועת הג'לים בעת הטיפול. תמרנו את הג'לים המורחבים עם העוברים על המשטח התחתון על גבי כיסוי גדול להדמיה.יש להרכיב כל כיסוי בג'ל מעל המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר. לאחר איתור הדגימות המבוימות והמכוונות כראוי עברו למטרת שמן או טבילה במים בהגדלה גבוהה לתמונה ברזולוציה גבוהה. מדידת אורך העובר לאורך ציר הראש עד הזנב תחת מטרה של פי 10 הראתה כי עוברים לא מורחבים השתרעו על פני כמחצית משדה הראייה, בעוד שהעוברים המורחבים השתרעו על פני כשני שדות ראייה מלאים.אורך הראש לזנב הממוצע של עוברי הביקורת הבלתי מורחבים היה 398.8 מיקרומטר. בניסויים אחד, שניים ושלושה, אורכי העובר הממוצע היו גורמי התפשטות של פי 4.0, פי 4.7 ופי 4.9 בהתאמה. במדגם הבקרה, התאים בקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 4.76 מיקרומטר.בדגימות המורחבות, התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 19.10 מיקרומטר, המייצג התפשטות של פי 4.0. שלד הציטומיוזין של האקטומיוזין צולם בבקרה לא מורחבת לעומת עוברים מורחבים, שעברו הרחבה מתכנסת. הם הופיעו כקו אחד שבו נפגשו תאים שכנים.לעומת זאת, בשלב מורחב של שבעה עוברים, ניתן היה לראות קווים מקבילים של מיוזין 2 בצמתים של תאים, המייצגים מאגרי חלבונים בקליפת המוח בתאים סמוכים. בשלב השישי הלא מורחב, המיטוכונדריה שסומנה עם סטרפטאבידין הופיעה כאובך ציטופלזמי הטרוגני ללא פרטים תת-תאיים ברורים. עם זאת, בעוברים המורחבים, פונקטה רבים היו פתירים בתוך הציטופלסמה, ככל הנראה מייצגים מיטוכונדריה מפוצלת או חלקים של הרשת המיטוכונדריאלית.דבר אחד חשוב לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא להגן על העוברים מפני חשיפה מוגזמת לאור לאחר הדגירה השניונית של הנוגדנים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...