Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

हम गिनी पिग एंटी-पार -3 प्राथमिक एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए डॉ जेनिफर ज़लेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंस (एनआईजीएमएस), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के सदस्यों में से एक, साथ ही अर्कांसस बायोसाइंसेज इंस्टीट्यूट (एबीआई) से उदार वित्त पोषण (1R15GM143729-01 और 1P20GM139768-01 5743) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसने हमारे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की खरीद के लिए आंशिक धन प्रदान किया था।

     

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लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

मैनुअल डेविटेलिनाइजेशन अधिकांश ड्रोसोफिला भ्रूण निर्धारण प्रोटोकॉल में मेथनॉल और हेप्टेन के इमल्शन में निश्चित भ्रूण को हिलाकर विटेलिन झिल्ली को हटाना शामिल है, जिसके कारण झिल्ली आसमाटिक टूटनेके माध्यम से फट जाती है। जबकि मेथनॉल-आधारित डेविटेलिनाइजेशन (मेथनॉल पॉपिंग) कई अनुप्रयोगों के लिए प्रभावी और उपयुक्त है, मैनुअल डेविटेलिनाइजेशन (हाथ से छीलना) कुछ महत्वपूर्ण फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, हाथ छीलने से किसी को सटीक रूप से मंचित भ्रूण चुनने और इकट्ठा करने की अनुमति मिलती है, जिससे प्रयोग के अंत में एक उपयोग योग्य अभिविन्यास में विस्तारित भ्रूण प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है। तेजी से विकास प्रक्रियाओं (जैसे, मेसोडर्म इनवेजिनेशन या अभिसरण विस्तार) के विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन करते समय यह संवर्धन महत्वपूर्ण है, जिसके लिए उचित रूप से मंचित भ्रूण सभी भ्रूणों के केवल कुछ प्रतिशत का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, यहां तक कि कसकर समयबद्ध संग्रह खिड़की के भीतर भी। बेशक, कई अनुप्रयोगों के लिए, समयबद्ध संग्रह खिड़की से भ्रूण का अधिक पारंपरिक थोक मेथनॉल पॉपिंग पर्याप्त होगा, और हाथ से छीलना अतिरिक्त प्रयास के लायक नहीं हो सकता है। दूसरा, मेथनॉल के नमूने के पिछले जोखिम से कुछ प्राथमिक एंटीबॉडी और रंजक का बंधन नकारात्मक रूप से प्रभावित होता है। इस कारण से, हाथ छीलने से मेथनॉल-पॉप्ड नमूनों की तुलना में इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण वृद्धि हो सकती है, जिससे यह ड्रोसोफिला विकास जीवविज्ञानी के लिए एक उपयोगी सामान्य तकनीक बन जाती है।
विस्तारित पूरे माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जबकि विस्तारित नमूनों पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करना वैचारिक रूप से अविस्तारित नमूनों के समान है, एक्सएम कुछ तकनीकी बाधाओं को पेश करता है। विशेष रूप से, भ्रूण अभिविन्यास, जो यादृच्छिक है, नमूना आकार बढ़ने के साथ और भी महत्वपूर्ण हो जाता है, क्योंकि उच्च-आवर्धन, उच्च-एनए उद्देश्य केवल नमूना क्षेत्रों से प्रकाश पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम होते हैं जो कवरस्लिप27 के बहुत करीब हैं। इसलिए, आमतौर पर केवल भ्रूण की सतह पर या उसके पास की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करना संभव होता है जो जेल बनने पर कवरस्लिप के निकट समाप्त हो जाते हैं। यह सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है कि अंत में सही अभिविन्यास के नमूने हैं, निश्चित भ्रूण के कसकर मंचित संग्रह के साथ एक्सएम प्रोटोकॉल शुरू करना है (उदाहरण के लिए, हाथ से छीलने का उपयोग करके) और प्रत्येक कुएं में कई भ्रूणों को बीज देना (>10). भ्रूण के इंटीरियर में गहरी कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, अधिक विशेष इमेजिंग सेटअप का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है, जैसे कि लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी28। इसके अतिरिक्त, हम पाते हैं कि कॉन्फोकल पिनहोल को एक हवादार इकाई से अधिक आकार में खोलकर छवि की गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है। बेशक, एक बढ़ा हुआ पिनहोल आकार कम अधिकतम रिज़ॉल्यूशन की कीमत पर आएगा, लेकिन व्यवहार में, पिनहोल आकार में छोटी वृद्धि भी सिग्नल तीव्रता को काफी बढ़ा सकती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। भविष्य के अध्ययनों को व्यवस्थित रूप से एक्सएम नमूनों में पिनहोल आकार और प्रभावी संकल्प को संबोधित करना चाहिए।
मूल ExM पर भिन्नताएं यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक्सएम का एक अपेक्षाकृत सरल उदाहरण है जिसे कई अनुप्रयोगों के लिए काम करना चाहिए और अधिकांश विकासात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में लागू करना आसान होना चाहिए। हालांकि, एक्सएम 4,5,7 की मूल अवधारणा पर कई भिन्नताएं हैं जिनका उपयोग सिग्नल तीव्रता को बढ़ाने, विस्तार की और भी डिग्री प्राप्त करने और न्यूक्लिक एसिड अणुओं के साथ-साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, भ्रूण को गेलेशन और विस्तार से पहले एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को 6,30 का विस्तार करने के बाद एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जा सकता है, जो विस्तार चरणों के दौरान एपिटोप पहुंच में वृद्धि और बाध्य एंटीबॉडी के नुकसान में कमी के कारण सिग्नल की तीव्रता बढ़ा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट क्रॉसलिंकर अणुओं का उपयोग हाइड्रोगेल में आरएनए अणुओं को संलग्न करने के लिए किया जा सकता है ताकि संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया विधि30 का उपयोग करके विस्तारित जैल में आरएनए का पता लगाया जा सके। अंत में, नमूनों को विस्तार के कई दौरों के अधीन किया जा सकता है, जैसे कि पुनरावृत्ति विस्तार माइक्रोस्कोपी (iExM)31, पैन-ExM32, और विस्तार प्रकटीकरण (ExR)31 में, बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन की उच्च डिग्री प्राप्त करने के लिए।

सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में, देखना विश्वास है, और प्रोटीन के स्थानीयकरण पैटर्न को सटीक रूप से निर्धारित करने की क्षमता कई प्रकार के प्रयोगों के लिए मौलिक है। लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी बरकरार नमूनों के भीतर तीन आयामों में फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन इमेजिंग के लिए मानक उपकरण है। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप आसन्न फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग करने (हल करने) में असमर्थ हैं जो उनके द्वारा उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के आधे से भी कम से अलग होतेहैं। दूसरे शब्दों में, दो बिंदु स्रोतों को दो अलग-अलग संकेतों के रूप में हल करने के लिए पार्श्व दिशा (अक्षीय दिशा में 500-700 एनएम) में कम से कम 200-300 एनएम से अलग किया जाना चाहिए। इस तकनीकी बाधा को विवर्तन सीमा के रूप में जाना जाता है, और यह विवर्तन सीमा से नीचे स्थानिक विशेषताओं के साथ जटिल उपकोशिकीय संरचनाओं (जैसे, एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटल या माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क) के अध्ययन के लिए एक मौलिक बाधा है। इसलिए, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की समाधान शक्ति बढ़ाने की तकनीक जैविक समुदाय के लिए सामान्य रुचि है।
विवर्तन सीमा को दरकिनार करने के लिए, कई अलग-अलग सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं जो दसियों नैनोमीटर या उससे कम 1,2,3 के क्रम में रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती हैं, जिससे जैविक जटिलता की दुनिया का पता चलता है जो पहले केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सुलभ था। इन हार्डवेयर-आधारित विधियों के स्पष्ट लाभों के बावजूद, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप में अक्सर विशिष्ट नमूना लेबलिंग आवश्यकताएं और लंबे समय तक अधिग्रहण समय होता है, जिससे उनके लचीलेपन को सीमित किया जाता है, या वे कुछ प्रयोगशालाओं तक पहुंचने के लिए बहुत महंगे हो सकते हैं। माइक्रोस्कोप-आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन का एक विकल्प विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) है, जो प्रति माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार नहीं है, बल्कि इसकेघटक अणुओं के सापेक्ष स्थानिक संगठन को संरक्षित करते हुए एक नमूने को सूजन देने की एक विधि है। आइसोट्रोपिक रूप से विस्तारित नमूने तब पारंपरिक प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रभावी रूप से बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन पर देखे जा सकते हैं। एक्सएम को पहली बार 20155 में बॉयडेन समूह द्वारा वर्णित किया गया था, और मूल तकनीक को तब सेविभिन्न प्रयोगों 6,7,8 में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। एक्सएम को पूरे-माउंट भ्रूण में उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया गया है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला 9,10,11, सी एलिगेंस12, और ज़ेब्राफिश 13 में, जिससे यह विकासात्मक जीवविज्ञानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है।
एक्सएम दो अलग-अलग हाइड्रोगेल केमिस्टरी पर आधारित है: 1) सूजन योग्य पॉलीइलेक्ट्रोलाइट हाइड्रोगेल, जो पानी में भिगोने पर आकार में बहुत बढ़ जाते हैं14, और 2) पॉलीक्रिलामाइड हाइड्रोगेल, जिसमें आइसोट्रोपिक नमूना विस्तारकी अनुमति देने के लिए बेहद कम बहुलक रिक्ति होती है। जबकि कई प्रकाशित एक्सएम प्रोटोकॉल हैं, वे आम तौर पर निम्नलिखित चरणों को साझा करते हैं: नमूना निर्धारण, लेबलिंग, सक्रियण, गेलेशन, पाचन और विस्तार4। निर्धारण की स्थिति और प्रतिदीप्ति लेबलिंग रणनीतियाँ निश्चित रूप से प्रयोग और प्रणाली की आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न होंगी, और कुछ प्रोटोकॉल में, विस्तार के बाद लेबलिंग होती है। नमूने में लक्ष्य अणुओं को हाइड्रोगेल से बांधने के लिए प्राइमेड (सक्रिय) किया जाना चाहिए, जिसे विभिन्नरसायनज्ञों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। गेलेशन चरणों के दौरान, नमूना भविष्य के हाइड्रोगेल (सोडियम एक्रिलेट, एक्रिलामाइड, और क्रॉस-लिंकर बिसैक्रिलामाइड) के मोनोमर्स से संतृप्त होता है, और हाइड्रोगेल तब एक सर्जक द्वारा उत्प्रेरित फ्री-रेडिकल पोलीमराइजेशन द्वारा बनता है, जैसे अमोनियम परसल्फेट (एपीएस), और एक त्वरक, जैसे टेट्रामेथिलीनडायमाइन (टीईएमईडी)4। गेलेशन के बाद, सूजन के लिए नमूना प्रतिरोध को समरूप करने और हाइड्रोगेल4 के आइसोट्रोपिक विस्तार को सुनिश्चित करने के लिए नमूना को एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। अंत में, पचा हुआ हाइड्रोगेल पानी में रखा जाता है, जिससे यह अपने मूल रैखिक आकार4 से लगभग चार गुना तक फैल जाता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> चित्रा 1: ड्रोसोफिला भ्रूण में विस्तार माइक्रोस्कोपी का अवलोकन। ExM एक बहु-चरण प्रोटोकॉल है जिसे पूरा करने में कम से कम 4 दिन लगते हैं। भ्रूण संग्रह, निर्धारण, और डेविटेलिनाइजेशन में 1 दिन या उससे अधिक समय लगता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि कई संग्रहों से भ्रूण पूल किए गए हैं या नहीं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग में 1 दिन या 2 दिन लगते हैं, जो इस बात पर निर्भर करता है कि भ्रूण को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर इनक्यूबेट किया जाता है या नहीं। भ्रूण सक्रियण, गेलेशन, पाचन, और विस्तार एक ही दिन में किया जा सकता है। जैल को विस्तार के तुरंत बाद लगाया और चित्रित किया जा सकता है, हालांकि व्यावहारिक कारणों से अगले दिन इमेजिंग शुरू करना अक्सर वांछनीय होता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
यह प्रोटोकॉल बताता है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 1) पर उपकोशिकीय प्रोटीन स्थानीयकरण पैटर्न की कल्पना करने के लिए पूरे-माउंट प्रारंभिक से मध्य-चरण ड्रोसोफिला भ्रूण16 पर एक्सएम कैसे करें। यह विधि हाइड्रोगेल17 में प्रोटीन अणुओं को सक्रिय करने और लंगर डालने के लिए मिथाइलऐक्रेलिक एसिड एन-हाइड्रॉक्सीसुक्सिनिमिडिल एस्टर (एमए-एनएचएस) रसायन विज्ञान का उपयोग करती है, और यह अंतिम चरण के ड्रोसोफिला भ्रूण और ऊतकों में उपयोग के लिए पहले प्रकाशित एक्सएम प्रोटोकॉल का एक संशोधनहै। यह प्रोटोकॉल हाइड्रोगेल को ढालने और सक्रियण और गेलेशन के दौरान समाधान विनिमय की सुविधा के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) कुओं का उपयोग करता है। एक वैकल्पिक विधि जिसमें पीडीएमएस कुओं के निर्माण की आवश्यकता नहीं होती है, उसमें प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म22 के एक टुकड़े पर बैठे मोनोमर समाधान की बूंदों में कवरलिप्स से जुड़े भ्रूण को कम करना शामिल है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूण को घेरने वाली अभेद्य विटेलिन झिल्ली को मैन्युअल रूप से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए एक शर्त है। महत्वपूर्ण रूप से, हाथ से छीलने वाले भ्रूण की इस विधि का उपयोग नमूना लेबलिंग से पहले केवल ठीक से मंचित ड्रोसोफिला भ्रूण का चयन करने के लिए किया जा सकता है, जो सही चरण और अभिविन्यास के विस्तारित नमूनों के साथ समाप्त होने की संभावना को बढ़ाता है और इस प्रकार, डाउनस्ट्रीम डेटा संग्रह को बहुत अधिक कुशल बनाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

विकासात्मक जीव विज्ञान का वर्कहॉर्स कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप है, जो शोधकर्ताओं को जटिल जैविक नमूनों के भीतर टैग किए गए अणुओं के त्रि-आयामी स्थानीयकरण को निर्धारित करने की अनुमति देता है। जबकि पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कुछ सौ नैनोमीटर की दूरी पर स्थित दो आसन्न फ्लोरोसेंट बिंदु स्रोतों को हल करने की अनुमति देते हैं, उपकोशिकीय जीव विज्ञान के बेहतर विवरणों को देखने के लिए दसियों नैनोमीटर के क्रम में संकेतों को हल करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए कई हार्डवेयर-आधारित तरीकों को शोधकर्ताओं को ऐसी रिज़ॉल्यूशन सीमाओं को दरकिनार करने की अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है, हालांकि इन विधियों के लिए विशेष माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है जो सभी शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं। समाधान शक्ति बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक तरीका विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) नामक एक प्रक्रिया के माध्यम से नमूने को आइसोट्रोपिक रूप से बढ़ाना है, जिसे पहली बार 2015 में बॉयडेन समूह द्वारा वर्णित किया गया था। ईएक्सएम प्रति माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार नहीं है, बल्कि इसके घटक अणुओं के सापेक्ष स्थानिक संगठन को संरक्षित करते हुए एक नमूने को सूजन देने की एक विधि है। विस्तारित नमूना तब पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रभावी रूप से बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन पर देखा जा सकता है। यहां, हम पूरे-माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्सएम को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग सतह उपकला कोशिकाओं के भीतर पार -3, मायोसिन II और माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल नमूना आकार में लगभग चार गुना वृद्धि देता है, जिससे उपकोशिकीय विवरणों का पता लगाने की अनुमति मिलती है जो पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाई नहीं देते हैं। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग आसन्न सेल कॉर्टिकल्स के बीच मायोसिन-जीएफपी के अलग-अलग पूल को अलग करने के लिए किया जाता है, और फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क आर्किटेक्चर के ठीक विवरण को प्रकट करने के लिए अंतर्जात बायोटिनीलेटेड अणुओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए सामान्य एंटीबॉडी और अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और यह कई मौजूदा इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ संगत होना चाहिए।

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Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

यहां, पारंपरिक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में विस्तार माइक्रोस्कोपी के कार्यान्वयन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए पूरे-माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण को शारीरिक रूप से बढ़ाने के लिए विस्तार माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

इस प्रोटोकॉल को अधिकांश एसोफैगल विकासात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को सुपर रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करने के लिए सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप तक पहुंच नहीं है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को नमूने का विस्तार करके सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता के बिना पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बायपास करने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल उन लोगों के लिए फायदेमंद होगा जो अध्ययन करते हैं कि प्रोटीन स्थानीयकरण बरकरार भ्रूण में कोशिका आकृति विज्ञान या कार्य को कैसे प्रभावित करता है, खासकर जब उन प्रोटीनों को जटिल उपकोशिकीय संरचनाओं या नेटवर्क में व्यवस्थित किया जाता है।लोगों का सामना करने वाली सबसे आम समस्या पूरे प्रोटोकॉल में भ्रूण खोना है। भ्रूण को मजबूती से पालन करने के लिए पॉली-एल-लाइसिन के कई कोट लगाने की सलाह दी जाती है। भ्रूण के बाद, 3% आगर से भरे छह सेंटीमीटर प्लास्टिक पेट्री डिश बेस लें।रेजर ब्लेड या स्केलपेल के साथ आगर में पांच बाई तीन सेंटीमीटर आयत स्कोर करें। एक छोटे से लैब स्पैटुला का उपयोग करके अगर स्लैब को हटा दें। फिर पेट्री डिश के आधार को उल्टा करें, इसे बेंच पर सेट करें, और उल्टे पकवान के ऊपर आगर स्लैब रखें।पेट्री डिश से ढक्कन हटा दें और सुनिश्चित करें कि यह सूखा है। दस्ताने का उपयोग करते हुए, ढक्कन के अंदर दो तरफा टेप का एक टुकड़ा चिपकाएं। लेपित और स्थिर भ्रूण युक्त शीशियों को शेकर से बाहर निकालें और उन्हें वर्कबेंच पर लंबवत रखें।कार्बनिक और जलीय चरणों को अलग होने दें। ठीक से तय भ्रूण उनके इंटरफ़ेस पर रहना चाहिए। पाश्चर पिपेट और पी 200 पिपेट का उपयोग करके निचले जलीय चरण को पूरी तरह से हटा दें।एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें जो लेटेक्स बल्ब के साथ फिट किया गया है ताकि निश्चित भ्रूण को कई छोटे बैचों में एक आगर स्लैब पर स्थानांतरित किया जा सके ताकि वे पिपेट के अंदर का पालन न करें। एक बार जब भ्रूण आगर स्लैब पर होते हैं, तो भ्रूण के पास किसी भी शेष हेप्टेन को हटाने के लिए पी 200 पिपेटर का उपयोग करें। अब, भ्रूण को टेप से चिपकाने के लिए दो सेंटीमीटर की ऊंचाई से आगर स्लैब पर दो तरफा टेप ढक्कन गिरा दें।धीरे से आगर स्लैब से ढक्कन हटा दें, इसे बेंच पर उल्टा रखें, और ढक्कन में भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस ट्वीन जोड़ें। वांछित भ्रूण एकत्र करने के लिए, अप्रत्यक्ष प्रकाश व्यवस्था के साथ 100x आवर्धन पर एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। भ्रूण के पूर्ववर्ती या पीछे के छोर के पास विटेलिन झिल्ली को कांच की सुई से चुभोएं ताकि इसे कम किया जा सके और दबाव छोड़ा जा सके।भ्रूण को छेद के माध्यम से धीरे-धीरे बाहर धकेलने के लिए बारीक बल या धातु की जांच का उपयोग करें, जिसमें विटेलिन झिल्ली अभी भी दो तरफा टेप का पालन करती है। टेप पर अवांछित भ्रूण छोड़ दें। समय-समय पर किसी भी फ्लोटिंग डेविटेलिनाइज्ड भ्रूण को इकट्ठा करने और उन्हें 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ले जाने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।पीडीएमएस समाधान को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तैयार करें और दूसरे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में उचित मात्रा में पानी जोड़कर एक संतुलित ट्यूब बनाएं। पीडीएमएस घोल को 15 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए 500 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर इसे एक मिलीमीटर की गहराई तक 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में डालें।पीडीएमएस घोल को 55 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जमने दें। एक बार पीडीएमएस स्लैब ठोस हो जाने के बाद, स्केलपेल का उपयोग करके 22 बाय 22 मिलीमीटर कवर स्लिप से थोड़ा छोटा वर्ग क्षेत्र स्कोर करें। प्रत्येक वर्ग के अंदर, स्कोर करें और आठ मिलीमीटर चौड़े वर्ग को अच्छी तरह से हटा दें।प्रत्येक वर्ग पीडीएमएस को 22 बाय 22 मिलीमीटर कवर स्लिप पर अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और दृढ़ता से इसका पालन करें। भ्रूण को कवर स्लिप से चिपकाने के लिए, प्रत्येक कुएं के अंदर कवर स्लिप सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त 0.1% पॉली-एल-लाइसिन लागू करें और उन्हें सूखने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। ट्वीन डिटर्जेंट को हटाने के लिए भ्रूण और पीबीएस को संक्षेप में कुल्ला करें।फिर प्रत्येक पॉली-एल-लाइसिन में 10 से अधिक भ्रूण को अच्छी तरह से लेपित करें। भ्रूण को कुओं के तल पर बसने दें। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पालन किए गए भ्रूण से अतिरिक्त तरल निकालें और तुरंत अगले चरण में आगे बढ़ें।जबकि भ्रूण मोनोमर समाधान में बैठते हैं, पीडीएमएस कुओं को कवर करने के लिए एक गेलेशन समाधान तैयार करें। पाउडर से उत्प्रेरक ऑक्सीडेंट को ताजा पतला करें। मोनोमर समाधान के 3, 920 माइक्रोलीटर को 10% टीईएमईडी के 60 माइक्रोलीटर और 1% टेम्पो के 20 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं।125 माइक्रोलीटर एलिकोट में गेलेशन समाधान को कई पीसीआर ट्यूबों में विभाजित करें। भ्रूण को बाधित न करने के लिए सावधान रहते हुए वैक्यूम या पिपेटर का उपयोग करके पीडीएमएस कुओं से मोनोमर समाधान को हटा दें। पोलीमराइजेशन शुरू करने के लिए गेलेशन समाधान युक्त पीसीआर ट्यूबों में से एक में एपीएस के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें।जल्दी से तीन कुओं के बीच पोलीमराइजिंग गेलेशन समाधान वितरित करें। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कुएं और भ्रूण कवर न हो जाएं। नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 से 2.5 घंटे तक जेल में रहने दें।मोटे हाइड्रोगेल को पोलीमराइजेशन पूरा करने और जमने में अधिक समय लगेगा। पोलीमराइजेशन की निगरानी के लिए अक्सर हाइड्रोगेल को उत्तेजित करें। एक बार जमने के बाद, हाइड्रोगेल हिलेंगे नहीं।गेलेशन के बाद, हाइड्रोगेल को परेशान किए बिना कवर स्लिप से पीडीएमएस कुओं को छील लें। हाइड्रोगेल को व्यक्तिगत रूप से छह कुएं प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें। पाचन के दौरान हाइड्रोगेल थोड़ा विस्तार कर सकते हैं।जैल को पाचन बफर के साथ पूरी तरह से कवर करें। 30 मिलीलीटर पाचन बफर उन्हें छह अच्छी प्लेट में कवर करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए पर्याप्त है। पाचन के बाद, हाइड्रोगेल को छह सेंटीमीटर पेट्री डिश में ले जाएं और इसे विस्तार ति करने के लिए विआयनीकृत पानी से भरें।हाइड्रोजेल इस बिंदु पर कवर स्लिप से अलग हो सकते हैं और रैखिक आयाम में चार गुना विस्तार कर सकते हैं। पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, हैंडल किए जाने पर जैल की गति को कम करने के लिए पेट्री डिश से जितना संभव हो उतना अतिरिक्त पानी निकालें। इमेजिंग के लिए एक बड़ी कवर स्लिप पर नीचे की सतह पर भ्रूण के साथ विस्तारित जैल को पैंतरेबाज़ी करें।उल्टे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उद्देश्य पर जेल के साथ प्रत्येक कवर स्लिप माउंट करें। ठीक से मंचित और उन्मुख नमूनों का पता लगाने के बाद, उच्च रिज़ॉल्यूशन पर छवि बनाने के लिए उच्च आवर्धन तेल या जल विसर्जन उद्देश्य पर स्विच किया गया। 10x उद्देश्य के तहत सिर से पूंछ की धुरी तक भ्रूण की लंबाई के माप से पता चला कि अविस्तारित भ्रूण दृश्य के क्षेत्र के लगभग आधे हिस्से में फैले हुए थे, जबकि विस्तारित भ्रूण दृश्य के लगभग दो पूर्ण क्षेत्रों में फैले हुए थे।अविस्तारित नियंत्रण भ्रूण की औसत सिर से पूंछ की लंबाई 398.8 माइक्रोमीटर थी। प्रयोगों के लिए एक, दो, और तीन, औसत भ्रूण की लंबाई क्रमशः 4.0 गुना, 4.7 गुना और 4.9 गुना के विस्तार कारक थे। नियंत्रण नमूने में, मैक्सिलरी खंड में कोशिकाओं की औसत चौड़ाई 4.76 माइक्रोमीटर थी।विस्तारित नमूनों में, मैक्सिलरी सेगमेंट में कोशिकाओं की औसत चौड़ाई 19.10 माइक्रोमीटर थी, जो 4.0 गुना विस्तार का प्रतिनिधित्व करती थी। एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन को विस्तारित भ्रूण बनाम विस्तारित भ्रूण में चित्रित किया गया था, जो अभिसरण विस्तार से गुजर रहा था। वे एक एकल रेखा के रूप में दिखाई दिए जहां पड़ोसी कोशिकाएं मिलीं।इसके विपरीत, विस्तारित चरण सात भ्रूणों में, मायोसिन दो की समानांतर रेखाएं सेल सेल जंक्शनों पर देखी जा सकती हैं, जो आसन्न कोशिकाओं में कॉर्टिकल प्रोटीन पूल का प्रतिनिधित्व करती हैं। अविस्तारित चरण छह भ्रूण ों में, स्ट्रेप्टाविडिन के साथ लेबल किए गए माइटोकॉन्ड्रिया बिना किसी स्पष्ट उपकोशिकीय विवरण के विषम साइटोप्लाज्मिक धुंध के रूप में दिखाई दिए। हालांकि, विस्तारित भ्रूण में, साइटोप्लाज्म के भीतर कई पंक्टा हल करने योग्य थे, संभवतः खंडित माइटोकॉन्ड्रिया या माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के कुछ हिस्सों का प्रतिनिधित्व करते थे।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने वाली एक महत्वपूर्ण बात यह है कि द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद भ्रूण को अत्यधिक प्रकाश जोखिम से बचाना है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

क्षैतिज पूरे माउंट: मोटा, तीन आयामी ऊतक के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative सुपर संकल्प और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी Zebrafish रेटिना में प्रोटीन स्थानीयकरण को हल करने के लिए

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

बड़ी मात्रा में विशिष्ट सेलुलर लक्ष्य खोजने के लिए धारावाहिक वर्गों के Multimodal पदानुक्रमित इमेजिंग

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

पूरे माउंट-वयस्क कान त्वचा के लिए फोकल माइक्रोस्कोप: एक मॉडल प्रणाली न्यूरो संवहनी Morphogenesis और प्रतिरक्षा कोशिका वितरण शाखाओं का अध्ययन करने के लिए

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

पूरे माउंट Epifluorescence का उपयोग कर माउस Embryogenesis के दौरान कार्डिएक चैंबर विकास का विश्लेषण

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...