Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer Zallen for å gi marsvin anti-Par-3 primære antistoff. Dette arbeidet ble støttet av sjenerøs finansiering (1R15GM143729-01 og 1P20GM139768-01 5743) fra National Institute of General Medical Science (NIGMS), et av medlemmene i National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som ga delvis finansiering for kjøp av vårt konfokale mikroskop.

Denne protokollen følger University of Arkansas (UARK) retningslinjer for forskning på virvelløse dyr, som Drosophila melanogaster, og ble godkjent av UARK Institutional Biosafety Committee (protokoll # 20001).
1. Drosophila embryofiksering og avvik
MERK: Trinn 1 beskriver en prosedyre (håndpeeling) for manuell fjerning av vitellinemembranen, en gjennomsiktig ugjennomtrengelig membran som omgir embryoet. Det er viktig at håndpeeling gjør det mulig å velge riktig iscenesatte embryoer ved starten av ExM-protokollen, og dermed øke sannsynligheten for å skaffe embryoer i en brukbar orientering på slutten av ExM-protokollen. Imidlertid er denne ExM-protokollen fullstendig kompatibel med bulkembryoinnsamling og standardprosedyrer for metanolbasert fjerning av vitellinemembranen, i så fall kan man hoppe direkte til trinn 2 (immunfluorescensmerking).
<ol><li>Forbered eller kjøp et antall fine glassnåler. De faktiske dimensjonene på nålespissen er ikke kritiske, men sørg for at nålene er stive og skarpe nok til å gjennombore vitellinemembranene til faste embryoer. Lag nåler fra kapillærrør av glass (1 mm ytre diameter, 0,75 mm indre diameter) ved hjelp av en mikropipettrekker, da man ville forberede nåler for embryomikroinjeksjoner18; Alternativt kan du kjøpe ferdigtrukne nåler.</li>
	<li>Samle embryoer ved hjelp av standard Drosophila-teknikker19 ved å plassere >100 voksne Drosophila i en ventilert plastkopp forseglet med en fruktjuice / agarplate20. Bruk tidsbestemte innsamlingsvinduer for å berike embryoer av riktig stadium16. For eksempel, for å berike for gastrulasjonen (trinn 6) og konvergent-forlengelse (trinn 7) stadier, bytt fruktjuiceplaten, samle embryoene i 2 timer ved 25 ° C, fjern deretter platen og alder den i ytterligere 2 timer ved 25 ° C for å oppnå embryoer som er ~ 2-4 timer gamle.</li>
	<li>For å fjerne den eggeskalllignende korionen fra embryoene, dekk overflaten av fruktjuiceplatene med 50% blekemiddel (tabell 1), slipp embryoene fra overflaten av agar ved å røre dem med en liten pensel, og vent 3 minutter på at korionen skal oppløses.</li>
	<li>Overfør de dekorionerte embryoene med en pensel til et 30 ml scintillasjonshetteglass inneholdende 4 ml heptan (organisk toppfase) og 4 ml fikseringsbuffer (vandig bunnfase; Tabell 1). Fortynn formaldehydet fra en nylaget eller nylig åpnet kraft, og bland med 10x PBS og avionisert vann umiddelbart før du tilsetter embryoene. MERK: Forbered formaldehydet fra paraformaldehydkraft eller 16% EM-klasse formaldehyd i glassampuller. Lagre av konsentrert formaldehyd (f.eks. 37% formaldehyd) kan brukes, selv om resultatene kan være mindre konsistente.</li>
	<li>Embryoene vil akkumuleres ved grensesnittet mellom de organiske og vandige faser. Legg til så mange embryoer som vil danne et enkelt lag ved grensesnittet. Hvis for mange embryoer legges til et hetteglass, vil de ikke fikse også.</li>
	<li>Bruk sterk tape, immobiliser scintillasjonsglassene på sidene på en bordplateshaker, og berør dem i 20 minutter ved 220 o / min. For optimal fiksering, oppretthold en kraftig emulsjon mellom de organiske og vandige faser under hele fikseringen.</li>
	<li>I løpet av fikseringstiden, lag ett av følgende for hver av prøvene.<ol><li>Ta en plast 6 cm petriskålbase fylt halvveis med 3% agar og score et ~ 5 cm x 3 cm rektangel i agar med et barberblad eller skalpell. Fruktjuice/agarplater kan også brukes til dette formålet.</li>
		<li>Bruk en liten laboratoriespatel, fjern agarplaten. Inverter bunnen av petriskålen, og sett den på benken. Legg agarplaten på toppen av den omvendte tallerkenen (figur 2A).</li>
		<li>Ta lokket på petriskålen og sørg for at den er tørr. Bruk hansker, legg et stykke dobbeltsidig tape inne i lokket (tapestykket skal være litt større enn agarplaten; Figur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern hetteglassene fra shakeren, sett dem oppreist på benken, og la de organiske og vandige fasene skille seg. Riktig faste embryoer vil forbli i grensesnittet mellom de to fasene.</li>
	<li>Overfør de faste embryoene til agarplaten ved hjelp av en Pasteur-pipett i glass utstyrt med en latexpære. For å forhindre at embryoene fester seg til innsiden av pipeten, prøv å holde embryoene innenfor pipetens smale hals, og overfør embryoene i flere små batcher i stedet for alle samtidig. Når alle embryoene er på agarplaten, fjern det meste av gjenværende heptan fra rundt embryoene ved hjelp av en P200-pipettor. Utfør dette trinnet så raskt som mulig (<3 min) for å unngå å tørke ut de faste embryoene, noe som kan påvirke morfologien negativt.</li>
	<li>Fra en høyde på ~2 cm, slipp lokket med dobbeltsidig tape på agarplaten for å feste embryoene til båndet (figur 2C). Fjern forsiktig lokket fra agarplaten, legg det opp ned på benken, og tilsett deretter nok PBS-Tween (tabell 1) til å dekke embryoene i lokket.</li>
	<li>Ved hjelp av et stereodissekerende mikroskop ved omtrent 100x forstørrelse med indirekte belysning, identifiser riktig iscenesatte embryoer ved hjelp av morfologiske markører. For stadium 6 embryoer, bruk markører som en synlig cephalic fure og invaginated mesoderm; For stadium 7 embryoer, bruk markører som et utvidet germband; For stadium 11 embryoer, bruk markører som en fullt utvidet germband og synlig segmentering langs hode-til-hale akse16.<ol><li>For å samle de ønskede embryoene, stikk først vitellinemembranen (en gjennomsiktig oval membran rundt embryoet) nær den fremre eller bakre enden av embryoet med en fin glassnål; Membranen vil tømmes litt når trykket slipper ut. Deretter, ved hjelp av fin tang eller en metallsonde, skyv forsiktig embryoet i den andre enden gjennom hullet; Vitelline-membranen forblir festet til dobbeltsidig tape. La uønskede embryoer festes til båndet.</li>
	</ol></li>
	<li>Samle regelmessig de flytende devitelliniserte embryoene med en glass Pasteur-pipet, og flytt dem til et 1,5 ml mikrofugerør.</li>
	<li>På dette tidspunktet utfører du ett av følgende trinn.<ol><li>Fortsett direkte til trinnene for immunfluorescensmerking. De avvikende embryoene kan gå direkte inn i blokkeringsløsningen (trinn 2.2). Ikke la embryoene forbli i PBS-Tween eller blokkerende oppløsning (tabell 1) lenger enn 16 timer før du går videre til neste trinn.</li>
		<li>Flytt embryoene til metanol for lagring. Fjern så mye av PBS-Tween som mulig, og tilsett deretter 1 ml metanol. Når embryoene har avgjort, fjern så mye metanol som mulig, og tilsett 1 ml fersk metanol. Oppbevar embryoene ved -20 °C på ubestemt tid. Metanollagring gjør det også mulig å samle embryoer fra flere samlinger.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Merking av immunfluorescens
MERK: Bortsett fra antistoffinkubasjonstrinnene, er eksakte væskemengder og tider ikke kritiske i denne delen. For å utføre en skylling eller vask, la embryoene slå seg til bunnen av røret, fjern så mye væske som mulig uten å suge opp embryoer, og tilsett deretter ~ 1 ml ny væske; bruk en Pasteur-pipett i glass utstyrt med en latekspære for optimal klarhet og kontroll. For skylletrinnet blir embryoene ikke rocket, bare lov til å bosette seg; For vasketrinnet blir embryoene rocket på en nutator i den angitte tiden og får deretter lov til å bosette seg.
<ol><li>Hvis embryoer ikke ble lagret i metanol, gå videre til trinn 2.2. Hvis embryoene ble lagret i metanol, skyll to ganger med PBS-Tween, og vask deretter i 20 minutter to ganger med PBS-Tween.</li>
	<li>Vask embryoene i 30-60 minutter i 1 ml blokkeringsløsning.</li>
	<li>Inkuber embryoene med primære antistoffer fortynnet i antistoffoppløsning (tabell 1) i 2 timer ved romtemperatur eller helst over natten ved 4 °C. Utfør dette trinnet i så lite volum som mulig (50-300 μL) for å bevare de primære antistoffene; Rocking på en mutterator er ikke strengt nødvendig.<ol><li>Øk mengden primært antistoff som brukes i et typisk immunfluorescenseksperiment med minst 50% for ExM. Bruk følgende primære antistoffkonsentrasjoner: 1:200 for anti-Par-3 marsvin polyklonal21 og 1:100 for anti-GFP kanin polyklonal.</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern den primære antistoffoppløsningen (lagre ved 4 °C om ønskelig), skyll to ganger med PBS-Tween, og vask deretter i 15 minutter fire ganger med PBS-Tween.</li>
	<li>Inkuber embryoene med fluorescerende sekundære antistoffer i et endelig volum på 300 μL (fortynnet i antistoffoppløsning) i 1 time ved romtemperatur på en nutator. Fluorescerende merket streptavidin kan tilsettes i løpet av dette trinnet. Fra dette trinnet og fremover, beskytt embryoene mot overdreven og langvarig lyseksponering når det er mulig, for eksempel ved å dekke rørene med et ugjennomsiktig bokslokk eller holde prøvene i en skuff.<ol><li>Bruk følgende konsentrasjoner: 1:500 for anti-kanin IgG geit polyklonal smeltet til Alexa Fluor 488; 1:500 for anti-marsvin IgG geit polyklonal smeltet til Alexa Fluor 568; og 1:1000 for streptavidin-Alexa Fluor 488.</li>
	</ol></li>
	<li>Fjern og kast den sekundære antistoffoppløsningen. Skyll embryoene to ganger med PBS-Tween, og vask i 15 min fire ganger med PBS-Tween.</li>
	<li>På dette tidspunktet kan embryoene lagres ved 4 °C i mørket, men behandle prøvene så raskt som mulig (<24 timer).</li>
</ol>3. Klargjøring av PDMS-brønner
MERK: PDMS-brønnene kan gjøres opptil 2 uker i forveien.
<ol><li>Sett en kuvøse eller kokeplate til 55 °C, og sett en sentrifuge som kan spinne koniske rør til 15 °C.</li>
	<li>For å klargjøre PDMS-løsningen (tabell 1), plasser et 50 ml konisk rør i en sekundær beholder på en skala, og tilsett 10 g silikonelastomerbase til røret ved hjelp av en sprøyte. Deretter tilsettes 1 g silikonelastomerherdemiddel, og vender røret flere ganger for å blande.</li>
	<li>Lag et balanserør ved å tilsette en passende mengde vann til et andre 50 ml konisk rør. Sentrifuger PDMS-løsningen ved 500 x g i 3 minutter ved 15 °C, og hell den deretter i en 10 cm petriskål til en dybde på ~1 mm. Fjern om nødvendig bobler ved å blåse forsiktig på løsningen med en luftslange. La PDMS-oppløsningen stivne over natten ved 55 °C.</li>
	<li>Når PDMS-platen er størknet, ved hjelp av en skalpell, score firkantede områder som er litt mindre enn en 22 mm x 22 mm coverslip. Inne i hver rute, score og fjern en ~ 8 mm bred firkantbrønn.</li>
	<li>Overfør hver firkantede PDMS-brønn til en 22 mm x 22 mm deksel, og fest den godt (figur 2D). Å forberede seks eller flere coverslips bør gi et stort antall utvidede embryoer å avbilde.</li>
</ol>4. Feste embryoene til dekslene
<ol><li>Påfør nok 0,1% poly-L-lysin til å dekke dekkflaten inne i hver brønn (~ 50 μL), og plasser dem i en 55 ° C inkubator for å lufttørke. Gjenta dette trinnet for å øke klebeevnen.</li>
	<li>Skyll embryoene kort en gang i 1x PBS for å fjerne Tween-vaskemiddelet, og overfør deretter >10 embryoer til hver av de poly-L-lysinbelagte brønnene.</li>
	<li>La embryoene slå seg ned til bunnen av brønnene. Fjern overflødig væske fra de festede embryoene ved hjelp av en Pasteur-pipette. Fortsett umiddelbart til neste trinn.</li>
</ol>5. Aktivering og gelering
MERK: Aktivering refererer til tilsetning av MA-NHS til embryoene, som vil modifisere prøveproteinene og antistoffene slik at de kan binde seg til hydrogelen. Gelering refererer til genereringen av en hydrogel i og rundt embryoene i hver brønn. Under gelering gjennomsyres embryoene med en monomerløsning og behandles deretter med en geleringsløsning for å danne hydrogelen.
<ol><li>Aktiver embryoene i 1 time ved romtemperatur ved å fylle brønnene med aktiveringsløsning (1 mM MA-NHS nyfortynnet i 1x PBS; Tabell 1). Bytt denne løsningen omtrent hvert 10. minutt i løpet av 1 time.</li>
	<li>Skyll embryoene med 1x PBS tre ganger. Inkuber embryoene i monomeroppløsning (tabell 1) i 45 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Mens embryoene sitter i monomerløsningen, klargjør geleringsløsningen (tabell 1). Forberedelse av ~ 2 ml geleringsløsning er nok til å dekke PDMS-brønnene fra en hel 10 cm petriskål. Pass på å legge til APS sist, da det vil starte polymerisering og begynne geleringen.<ol><li>Fortynn den katalytiske oksidanten ferskt fra pulver (f.eks. 1 % TEMPO w/v i vann). Kombiner 1,960 μL monomerløsning med 30 μL 10% TEMED og 10 μL 1% TEMPO.</li>
		<li>For å unngå polymerisering av hele batchen av geleringsløsning samtidig, arbeid i små satser. Del geleringsløsningen (uten APS) i 125 μL alikoter mellom de åtte rørene i en PCR-stripe.</li>
		<li>Fjern monomerløsningen fra de tre PDMS-brønnene ved hjelp av vakuum mens du er forsiktig så du ikke forstyrrer embryoene. Tilsett 5 μL APS til et av PCR-rørene som inneholder geleringsoppløsning for å initiere polymerisering. Fordel polymerisasjonsgeleringsløsningen raskt mellom brønnene (~40 μL per brønn). Gjenta dette til alle brønnene og embryoene er dekket.</li>
	</ol></li>
	<li>La prøvene gelere i 1,5-2,5 timer ved 37 °C. Agiter hydrogelene så ofte for å overvåke polymerisasjonen. Størknede hydrogeler vil ikke vrikke. Tykkere hydrogeler vil ta lengre tid å fullføre polymerisering og størkne.</li>
</ol>6. Fordøyelse og ekspansjon
MERK: Tykkere og større geler vil ta lengre tid å utvide, og midten av gelene kan ta flere timer å utvide helt. Dette kan økes ved å trimme kantene på gelen. Når gelene ekspanderer, vil brytningsindeksen deres bli nesten identisk med vannets, og de vil bli svært vanskelig å se.
<ol><li>Etter at gelering er fullført, må du fjerne PDMS-brønnene fra dekselet mens du prøver å ikke forstyrre hydrogelene. Skjær bort overflødig hydrogelmateriale, om ønskelig.</li>
	<li>Overfør hydrogelene (fortsatt festet til dekslene) individuelt inn i brønnene på en seks-brønnplate (figur 2E). Legg merke til at hydrogelene kan ekspandere litt under fordøyelsen.</li>
	<li>Dekk gelene helt med fordøyelsesbuffer (tabell 1) i 1 time ved 37 °C. Generelt er 30 ml fordøyelsesbuffer tilstrekkelig til å dekke gelene i en 6-brønnsplate.</li>
	<li>Etter fordøyelsen, overfør hver hydrogel individuelt til en 6 cm petriskål ved å skyve dem av dekselet. Det kan være nødvendig å bruke et ekstra deksel for å løsne gelen. Fyll hver petriskål med avionisert vann for å utvide gelen. Bytt vannet tre til fire ganger i løpet av 1-2 timer til gelene er helt utvidet (forvent en omtrentlig fire ganger økning i bredden).</li>
</ol>7. Montering og avbildning
MERK: Ekspanderte hydrogeler består nesten utelukkende av vann, noe som gjør dem nesten gjennomsiktige og ekstremt skjøre. Gelene kan manipuleres ved hjelp av lange deksler for å flytte dem rundt og plukke dem opp. Monter og avbilde bare en eller to geler om gangen, da geler gradvis vil frigjøre vann og begynne å glide rundt dekselet.
<ol><li>Bruk en Pasteur-pipet, fjern så mye overflødig vann fra petriskålen som mulig for å minimere geleene som beveger seg rundt når de håndteres.</li>
	<li>Manøvrer hver ekspanderte gel, med embryoene på bunnflaten, på et stort deksel (f.eks. 24 mm x 40 mm) for avbildning.</li>
	<li>Monter hver coverslip med gel over målet med et invertert laserskanning konfokalmikroskop. Finn riktig iscenesatte og orienterte prøver ved hjelp av epifluorescens- eller brightfield-mikroskopimodusene på mikroskopet med luftmål med lav forstørrelse (5x eller 10x) eller middels forstørrelse (20x).</li>
	<li>Hvis du vil ta bilder med høy oppløsning, bytter du til et olje- eller nedsenkingsmål med høy forstørrelse (60x, 63x eller 100x). Overflaten av embryoene må være innenfor fokusområdet til målet (<300 μm fra dekselet for et 63x objektiv) for å bli avbildet.</li>
	<li>Samle inn data fra prøver ved hjelp av laserskanning konfokalmodus på mikroskopet. Sørg for å samle ikke-mettede bilder med godt dynamisk område, og bruk et passende antall piksler per bilde for å fange maksimalt mulig informasjon om prøven23.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig02.jpg"> Figur 2: Manuell avviktellinisering og arbeid med hydrogeler . (A) Kutte en agarplate fra en agar / fruktjuiceplate. (B) Plassering av dobbeltsidig tape inne i lokket på en 6 cm petriskål. (C) Feste embryoer til det teipede lokket. (D) En PDMS-plate med en firkantet brønn festet til et 22 mm x 22 mm deksel. (E) Coverslip med en PDMS godt inne i en 6-brønns plate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

     

<ol>
	<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging.+Expansion+microscopy.">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Chang, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex.">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li><li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons.">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy.">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li><li>Yu, C. -. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+C.+elegans.">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249 (2020).</li><li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies.">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+in+ionic+gels.">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li><li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues.">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila apple juice-agar plates. , (2011).</li><li>de Matos Sim&#245;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+directs+bazooka/Par-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation.">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Par&#233;, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation.">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization.">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li><li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy.">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy.">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li><li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context.">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).</li><li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+revealing:+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures.">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Manuell avvik De fleste Drosophila-embryofikseringsprotokoller innebærer å fjerne vitellinmembranen ved å riste faste embryoer i en emulsjon av metanol og heptan, noe som får membranene til å briste av via osmotisk brudd26. Mens metanolbasert avviktellinisering (metanolpopping) er effektiv og egnet for mange applikasjoner, gir manuell avviktellinisering (håndpeeling) noen betydelige fordeler. For det første tillater håndpeeling en å velge nøyaktig iscenesatte embryoer å avvike og samle, noe som øker sannsynligheten for å oppnå utvidede embryoer i en brukbar orientering på slutten av forsøket. Denne anrikningen er kritisk når man studerer spesifikke aspekter av raske utviklingsprosesser (f.eks. Mesoderminvaginasjon eller konvergent forlengelse), for hvilke passende iscenesatte embryoer kan representere bare noen få prosent av alle embryoer, selv innenfor et tett tidsbestemt samlingsvindu. Selvfølgelig, for mange applikasjoner, vil den mer tradisjonelle bulkmetanolpopping av embryoer fra et tidsbestemt innsamlingsvindu være tilstrekkelig, og håndpeeling er kanskje ikke verdt den ekstra innsatsen. For det andre påvirkes bindingen av visse primære antistoffer og fargestoffer negativt av tidligere eksponering av prøven for metanol. Av denne grunn kan håndpeeling gi betydelige økninger i immunfluorescenssignalkvaliteten sammenlignet med metanolpoppprøver, noe som gjør det til en nyttig generell teknikk for Drosophila utviklingsbiologer.
Høyoppløselig konfokalmikroskopi i utvidede helmonterte Drosophila-embryoer Mens utførelse av høyoppløselig konfokalmikroskopi på utvidede prøver er konseptuelt det samme som på uutvidede prøver, introduserer ExM noen tekniske hindringer. Spesielt blir embryoorientering, som er tilfeldig, enda viktigere når prøvestørrelsen øker, fordi høyforstørrelse, høy-NA-mål bare er i stand til å fokusere lys fra prøveområder som er svært nær dekselet27. Derfor er det vanligvis bare mulig å fokusere på cellene på eller nær overflaten av embryoet som endte opp ved siden av dekselet da gelen ble dannet. Den beste måten å sikre at det er prøver av riktig orientering på slutten, er å starte ExM-protokollen med en tett iscenesatt samling av faste embryoer (f.eks. ved å bruke håndpeeling) og å frø mange embryoer i hver brønn (>10). For å visualisere celler dypt inne i embryoet, kan det være nødvendig å benytte mer spesialiserte bildeoppsett, for eksempel lysarkmikroskopi28. I tillegg finner vi at bildekvaliteten kan forbedres ved å åpne det konfokale pinhole til en størrelse større enn en luftig enhet. Selvfølgelig vil en økt pinhole størrelse komme på bekostning av redusert maksimal oppløsning, men i praksis kan selv små økninger i pinhole størrelse øke signalintensiteten betydelig (data ikke vist). Fremtidige studier bør systematisk adressere pinhole størrelse og effektiv oppløsning i ExM-prøver.
Variasjoner over grunnleggende ExM Protokollen beskrevet her er et relativt enkelt eksempel på ExM som skal fungere for mange applikasjoner og være enkel å implementere i de fleste utviklingsbiologiske laboratorier. Imidlertid er det mange variasjoner på det grunnleggende konseptet med ExM 4,5,7 som kan brukes til å øke signalintensiteten, oppnå enda flere ekspansjonsgrader og oppdage nukleinsyremolekyler så vel som proteiner. I denne protokollen inkuberes embryoene med antistoffer før gelering og ekspansjon. Alternativt kan prøvene behandles med antistoffer etter at de er utvidet 6,30, noe som kan øke signalintensiteten på grunn av økt epitoptilgjengelighet og redusert tap av bundne antistoffer under ekspansjonstrinnene. I tillegg kan spesifikke tverrbindingsmolekyler brukes til å feste RNA-molekyler til hydrogelen for å tillate deteksjon av RNA i ekspanderte geler ved bruk av hybridiseringskjedereaksjonsmetoden30. Til slutt kan prøvene bli utsatt for flere ekspansjonsrunder, som i iterativ ekspansjonsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 og ekspansjonsavslørende (ExR)31, for å oppnå enda høyere grader av økt oppløsning.

I celle- og utviklingsbiologi er det å se å tro, og evnen til nøyaktig å bestemme lokaliseringsmønstrene til proteiner er grunnleggende for mange typer eksperimenter. Laserskanning konfokalmikroskopi er standardverktøyet for avbildning av fluorescerende merkede proteiner i tre dimensjoner i intakte prøver. Konvensjonelle konfokale mikroskoper er ikke i stand til å skille (løse) tilstøtende fluorescerende signaler som er skilt med mindre enn halvparten av bølgelengden til lyset de avgir:1. Med andre ord må to punktkilder skilles med minst 200-300 nm i sideretningen (500-700 nm i aksial retning) for å løse dem som to forskjellige signaler. Denne tekniske barrieren er kjent som diffraksjonsgrensen, og det er en grunnleggende hindring for studier av komplekse subcellulære strukturer (f.eks. Actomyosincytoskeletal eller mitokondrielle nettverk) med romlige egenskaper under diffraksjonsgrensen. Derfor er teknikker for å øke oppløsningskraften til konvensjonelle konfokale mikroskoper av generell interesse for det biologiske samfunnet.
For å omgå diffraksjonsgrensen er det utviklet en rekke forskjellige superoppløsningsmikroskopiteknologier som muliggjør oppløsning i størrelsesordentitalls nanometer eller mindre 1,2,3, og avslører en verden av biologisk kompleksitet som tidligere bare var tilgjengelig via elektronmikroskopi. Til tross for de åpenbare fordelene med disse maskinvarebaserte metodene, har superoppløsningsmikroskoper ofte spesifikke krav til prøvemerking og lange anskaffelsestider, noe som begrenser fleksibiliteten, eller de kan ganske enkelt være for dyre for noen laboratorier å få tilgang til. Et alternativ til mikroskopbasert superoppløsning er ekspansjonsmikroskopi (ExM), som ikke er en type mikroskopi i seg selv, men snarere er en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler 4 opprettholdes. De isotropisk utvidede prøvene kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM ble først beskrevet av Boyden-gruppen i 20155, og grunnteknikken har siden blitt tilpasset for bruk i en rekke eksperimenter 6,7,8. ExM har også blitt tilpasset for bruk i helmonterte embryoer, spesielt i Drosophila 9,10,11, C. elegans12 og sebrafisk 13, noe som gjør det til et kraftig verktøy for utviklingsbiologer.
ExM er basert på to forskjellige hydrogelkjemikalier: 1) svulmende polyelektrolytthydrogeler, som øker kraftig i størrelse når de er gjennomvåt i vann14, og 2) polyakrylamidhydrogeler, som har ekstremt liten polymeravstand for å tillate isotropisk prøveutvidelse15. Selv om det er mange publiserte ExM-protokoller, deler de vanligvis følgende trinn: prøvefiksering, merking, aktivering, gelering, fordøyelse og utvidelse4. Fikseringsbetingelsene og fluorescensmerkingsstrategiene vil selvfølgelig variere basert på eksperimentets og systemets behov, og i noen protokoller skjer merking etter utvidelse. Målmolekylene i prøven må primes (aktiveres) for binding til hydrogelen, som kan oppnås ved bruk av forskjellige kjemikalier4. Under geleringstrinnene blir prøven mettet med monomerer av den fremtidige hydrogelen (natriumakrylat, akrylamid og tverrbindingsbisakrylamid), og hydrogelen dannes deretter ved friradikalpolymerisasjon katalysert av en initiator, slik som ammoniumpersulfat (APS) og en akselerator, slik som tetrametylendiamin (TEMED)4. Etter gelering fordøyes prøven enzymatisk for å homogenisere prøvemotstand mot hevelse og sikre isotrop ekspansjon av hydrogelen4. Til slutt plasseres den fordøyede hydrogelen i vann, noe som får den til å utvide seg til omtrent fire ganger sin opprinnelige lineære størrelse4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Figur 1: Oversikt over ekspansjonsmikroskopi i Drosophila-embryoer . ExM er en flertrinnsprotokoll som tar minst 4 dager å fullføre. Embryoinnsamling, fiksering og avvik tar 1 dag eller mer, avhengig av om embryoer fra flere samlinger er samlet. Immunfluorescensmerking tar 1 dag eller 2 dager, avhengig av om embryoene inkuberes over natten med de primære antistoffene. Embryoaktivering, gelering, fordøyelse og ekspansjon kan utføres på en enkelt dag. Gelene kan monteres og avbildes umiddelbart etter ekspansjon, men av praktiske årsaker er det ofte ønskelig å starte avbildningen dagen etter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører ExM på helmonterte Drosophila-embryoer 16 i tidlig til midtfase for å visualisere lokaliseringsmønstre for subcellulært protein ved superoppløsning (figur 1). Denne metoden bruker metylakrylsyre N-hydroksysuccinimidylester (MA-NHS) kjemi for å aktivere og forankre proteinmolekyler til hydrogelen17, og det er en modifikasjon av en tidligere publisert ExM-protokoll for bruk i sent stadium Drosophila embryoer og vev11. Denne protokollen bruker polydimetylsiloksan (PDMS) brønner for å støpe hydrogelene og lette løsningsutveksling under aktivering og gelering. En alternativ metode som ikke krever opprettelse av PDMS-brønner, innebærer å senke embryoer festet til deksler i dråper monomerløsning som sitter på et stykke laboratorieforseglingsfilm22. I tillegg beskriver denne protokollen en metode for manuelt å fjerne den ugjennomtrengelige vitellinemembranen som omgir Drosophila-embryoer , noe som er en forutsetning for immunfluorescensfarging. Det er viktig at denne metoden for håndpeeling av embryoer kan brukes til å velge bare riktig iscenesatte Drosophila-embryoer før prøvemerking, noe som øker sannsynligheten for å ende opp med utvidede prøver av riktig stadium og orientering og dermed gjør nedstrøms datainnsamling mye mer effektiv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

Arbeidshesten til utviklingsbiologi er det konfokale mikroskopet, som gjør det mulig for forskere å bestemme den tredimensjonale lokaliseringen av merkede molekyler i komplekse biologiske prøver. Mens tradisjonelle konfokale mikroskoper tillater en å løse to tilstøtende fluorescerende punktkilder som ligger noen hundre nanometer fra hverandre, krever observasjon av de finere detaljene i subcellulær biologi evnen til å løse signaler i størrelsesorden titalls nanometer. Tallrike maskinvarebaserte metoder for superoppløsningsmikroskopi er utviklet for å tillate forskere å omgå slike oppløsningsgrenser, selv om disse metodene krever spesialiserte mikroskoper som ikke er tilgjengelige for alle forskere. En alternativ metode for å øke oppløsningsevnen er å isotropisk forstørre prøven selv gjennom en prosess kjent som ekspansjonsmikroskopi (ExM), som først ble beskrevet av Boyden-gruppen i 2015. ExM er ikke en type mikroskopi i seg selv , men er snarere en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler opprettholdes. Den utvidede prøven kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt konfokalmikroskop. Her beskriver vi en protokoll for implementering av ExM i helmonterte Drosophila-embryoer , som brukes til å undersøke lokaliseringen av Par-3, myosin II og mitokondrier i overflateepitelcellene. Denne protokollen gir en omtrent fire ganger økning i prøvestørrelsen, noe som muliggjør deteksjon av subcellulære detaljer som ikke er synlige med konvensjonell konfokalmikroskopi. Som prinsippbevis brukes et anti-GFP-antistoff for å skille forskjellige bassenger av myosin-GFP mellom tilstøtende cellekortiker, og fluorescerende merket streptapavidin brukes til å oppdage endogene biotinylerte molekyler for å avsløre de fine detaljene i mitokondrienettverksarkitekturen. Denne protokollen bruker vanlige antistoffer og reagenser for fluorescensmerking, og den skal være kompatibel med mange eksisterende immunfluorescensprotokoller.

For å karakterisere den generelle effekten av ExM i helmonterte Drosophila-embryoer, ble embryolengden langs hode-til-hale-aksen målt i ikke-ekspanderte kontrollembryoer versus utvidede embryoer (figur 3A-C). De ikke-ekspanderte kontrollembryoene ble utsatt for de samme fikseringsbetingelsene og immunfluorescensmerkingstrinnene som de utvidede embryoene, bortsett fra at de ble montert ved hjelp av et størknet monteringsmedium før avbildning. De enkelte uutvidede embryoene strakte seg over omtrent halvparten av synsfeltet ved bruk av et 10x-objektiv (figur 3A). Derimot strakte de utvidede embryoene seg over omtrent to fulle synsfelt når de brukte det samme 10x-målet (figur 3B). For å vurdere hvordan ekspansjonsgraden varierte både innenfor og mellom eksperimenter, ble den samme ExM-protokollen utført ved tre separate anledninger, og embryolengden ble målt i tre forskjellige geler i hvert enkelt eksperiment. Gjennomsnittlig hode-til-hale-lengde for de ikke-ekspanderte kontrollembryoene var 398,8 μm (standardavvik [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figur 3C). For eksperiment 1, eksperiment 2 og eksperiment 3 var de gjennomsnittlige embryolengdene henholdsvis 1,596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1,868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) og 1,954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), som representerer ekspansjonsfaktorer på henholdsvis 4,0 ganger, 4,7 ganger og 4,9 ganger (figur 3C). Den intraeksperimentelle variasjonen mellom gelene var mye mindre merkbar enn den intereksperimentelle variasjonen, som var ca. 20% (figur 3C). For å vurdere effekten av ExM på celle- og embryomorfologi, ble et antistoff mot adherenskrysskomponenten Par-3 (Bazooka)21 brukt til å merke de apikale cellemembranene, og vi avbildet de utviklende munnsegmentene i stadium 11 Drosophila-embryoer - et stadium med en kompleks segmentert struktur (figur 3D-F). I kontrollprøven hadde cellene i maxillarsegmentet en gjennomsnittlig bredde på 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figur 3D,F). I de utvidede prøvene avbildet med samme 40x-objektiv og zoomfaktor (1x) hadde cellene i maxillarsegmentet en gjennomsnittlig bredde på 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figur 3E,F), som representerer en utvidelse på 4,0 ganger. Derfor, i samsvar med tidligere rapporter11, var vi i stand til å utvide helmonterte Drosophila-embryoer omtrent fire ganger i lineære dimensjoner ved bruk av ExM uten prøveriving eller åpenbare forvrengninger i cellulær eller vevsmorfologi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Figur 3: Firedobling av Drosophila-embryoer. (A) Uutvidede og (B) utvidede Drosophila-embryoer avbildet ved hjelp av et 10x objektiv (0,3 NA) ved 1x zoom. Individuelle synsfelt (FOV) er indikert med stiplede linjer. Embryoene uttrykte en GFP-merket versjon av myosin lettkjede og ble farget med et anti-GFP antistoff. (C) Kvantifisering av embryolengde (langs hode-til-hale-aksen) i tre hydrogeler per eksperiment og fra tre separate ExM-eksperimenter sammenlignet med ikke-utvidede kontroller. (D,E) Maxillarsegmenter fra (D) uutvidede og (E) utvidede stadium 11 Drosophila-embryoer avbildet ved hjelp av et 40x objektivt (1,3 NA) ved 1x zoom. Cellekonturene (adherens junctions) ble påvist med et anti Par-3/Bazooka antistoff (hvitt). (F) Kvantifisering av cellebredden (lang akse) fra ekvivalente grupper av celler fra (D) og (E). Boksplottene i (C) og (F) viser persentilområdene 25., 50. og 75. whiskers angir minimums- og maksimumsverdiene; "+"-symbolene indikerer gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å demonstrere at ExM kan brukes til å løse subcellulære detaljer under den typiske diffraksjonsgrensen, ble actomyosincytoskjelettet avbildet i uutvidet kontroll versus utvidede embryoer som gjennomgikk konvergent forlengelse (trinn 7). Vevsremodelleringshendelsene av gastrulering og konvergent forlengelse styres i stor grad av endringer i lokaliseringen av motorproteinet myosin II24. I det tettpakkede søyleepitelet i den tidlige Drosophila-ektodermen er det imidlertid vanskelig å observere mange fine detaljer i myosin II-lokaliseringsmønsteret, selv når det avbildes ved 158x forstørrelse (63x objektiv med 2,5x optisk zoom) - en typisk maksimal oppløsningsevne for et laserskanning konfokalmikroskop. For eksempel, fordi myosin II er et kortikalt protein (lokalisert rett under plasmamembranen), var bassenger av myosin II25 plassert på hver side av cellekontakter ikke oppløselige i stadium 7-embryoer, og de dukket opp som en enkelt linje der naboceller møttes (figur 4A). I utvidede stadium 7-embryoer kunne derimot parallelle linjer med myosin II observeres ved celle-celle-veikryss, som representerte kortikale proteinpooler i tilstøtende celler (figur 4B). Avstanden mellom parallelle myosin II-linjer i utvidede prøver var 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); når delt på fire, gir dette en predikert avstand på ~ 220 nm mellom myosinlinjene i tilstøtende celler i uutvidede embryoer, som faktisk er like under diffraksjonsgrensen for et signal oppdaget med Alexa 488 (topputslipp på ~ 520 nm / 2 = 260 nm).
I tillegg testet vi også om ExM kunne brukes til å løse mitokondriell nettverksarkitektur i tettpakkede celler av gastrulaterende Drosophila-embryoer (trinn 6). Mitokondriell funksjon er nært knyttet til nettverksstruktur (dvs. smeltet vs. fragmenterte organeller), men detaljene i mitokondriell nettverksorganisasjon er vanskelig å visualisere ved bruk av konvensjonell konfokalmikroskopi i celletyper som ikke er flate og / eller tynne. Mitokondrier er naturlig rike på biotinylerte molekyler, og dermed kan mitokondrier merkes i det tidlige Drosophila-embryoet ved bruk av fluorescerende merket streptavidin26. I de uutvidede stadium 6-embryoene merket med streptavidin-Alexa 488 fremsto signalet som cytoplasmatisk puncta som ofte var overlappende og vanskelige å løse (figur 4C). I de utvidede stadium 6-embryoene var derimot mange flere fine detaljer i mitokondrienettverket synlige, og puncta var lettere løselige (figur 4D)26,27. Disse resultatene indikerer at ExM kan brukes til å studere mitokondriell nettverksorganisering i celletyper som ikke tradisjonelt er egnet for mitokondrieanalyse.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Figur 4: Detaljer om aktomyosincytoskjelett og mitokondrier påvist ved ekspansjonsmikroskopi. (A,B) Myosin II lokalisering i nevroektodermceller (germband) avbildet med en 63x objektiv (1,4 NA) ved 2,5x zoom i stadium 7 (A) uutvidet og (B) utvidede embryoer. Myosin II ble påvist i embryoene som uttrykk for en transgen GFP-merket versjon av myosin II regulatorisk lyskjede (sqh-GFP), som ble påvist med et anti-GFP-antistoff (rødt). Distinkte bassenger av kortikal myosin lokalisert i tilstøtende celler kan løses i det utvidede embryoet (hvite piler). (C,D) Mitokondrielle nettverk i nevroektodermceller avbildet med et 63× objektivt (1,4 NA) ved 2,5x zoom i stadium 6 uutvidede (C) og utvidede (D) embryoer. Mitokondriene ble påvist med streptavidin-Alexa 488 (grønn), og cellekonturene ble påvist med et anti-Par-3/Bazooka-antistoff (magenta). Forsøkene ble utført med et laserskanning konfokalmikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Løsningsoppskrifter. Sammensetning for løsningene som brukes i denne protokollen i rekkefølge etter utseende. Alle aksjene er væsker med mindre annet er angitt. Kjemikaliene ble resuspendert eller fortynnet i autoklavert filtrert vann med mindre annet er angitt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Her presenteres en protokoll for implementering av ekspansjonsmikroskopi i tidlige Drosophila-embryoer for å oppnå superoppløsningsavbildning ved hjelp av et konvensjonelt laserskanning konfokalmikroskop.

Bruk av ekspansjonsmikroskopi for fysisk å forstørre helmonterte Drosophila-embryoer for superoppløsningsavbildning

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Denne protokollen kan implementeres i de fleste esophagal utviklingsbiologi laboratorier, slik at forskere som ikke har tilgang til superoppløsningsmikroskoper for å produsere superoppløsningsbilder. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater forskere å omgå diffraksjonsgrensen for konvensjonell konfokalmikroskopi uten å kreve et superoppløsningsmikroskop ved å utvide prøven selv. Denne protokollen vil være gunstig for de som studerer hvordan proteinlokalisering påvirker cellemorfologi eller funksjon i intakte embryoer, spesielt når disse proteinene er organisert i komplekse subcellulære strukturer eller nettverk.Det vanligste problemet folk støter på er å miste embryoer gjennom hele protokollen. Det anbefales å bruke flere strøk av poly-L-lysin for å feste embryoene fast. Etter embryoene, ta en seks centimeter plast petriskålbase fylt halvparten med 3% agar.Score et fem ganger tre centimeter rektangel i agar med et barberblad eller skalpell. Fjern agarplaten med en liten laboratoriespatel. Snu deretter bunnen av petriskålen, sett den på benken og legg agarplaten på toppen av den omvendte parabolen.Fjern lokket fra petriskålen og sørg for at det er tørt. Bruk hansker til å feste et stykke dobbeltsidig tape på innsiden av lokket. Ta hetteglassene med de belagte og faste embryoene ut av shakeren og plasser dem vertikalt på arbeidsbenken.La de organiske og vandige fasene skille seg. Riktig faste embryoer bør forbli på grensesnittet. Fjern den bunnvandige fasen helt med en Pasteur-pipette og en P200-pipette.Bruk en Pasteur-pipette i glass utstyrt med en latexpære for å overføre de faste embryoene til en agarplate i flere små batcher slik at de ikke fester seg til innsiden av pipetten. Når embryoene er på agarplaten, bruk en P200 pipetter for å fjerne gjenværende heptan nær embryoene. Slipp nå det dobbeltsidige tapelokket på agarplaten fra en høyde på to centimeter for å feste embryoene til båndet.Fjern forsiktig lokket fra agarplaten, legg det opp ned på benken, og legg til nok PBS Tween til å dekke embryoene i lokket. For å samle de ønskede embryoene, bruk et stereodisseksjonsmikroskop ved 100x forstørrelse med indirekte belysning. Stikk vitellinemembranen nær den fremre eller bakre enden av embryoet med en fin glassnål for å tømme den og frigjøre trykk.Bruk fin tang eller en metallsonde for å skyve embryoet forsiktig ut gjennom hullet med vitellinemembranen fortsatt festet til dobbeltsidig tape. La uønskede embryoer ligge på båndet. Bruk regelmessig en glass Pasteur-pipette for å samle et flytende devitellinisert embryo og flytte dem til et 1,5 milliliter mikrofugerør.Forbered PDMS-løsningen i et 50 milliliter konisk rør og opprett et balansert rør ved å tilsette en passende mengde vann til et andre 50 milliliter konisk rør. Sentrifuger PDMS-løsningen ved 500G i tre minutter ved 15 grader Celsius. Hell den deretter i en 10 centimeter petriskål til en dybde på en millimeter.La PDMS-løsningen stivne over natten ved 55 grader Celsius. Når PDMS-platen er størknet, scorer du firkantede områder litt mindre enn en 22 x 22 millimeter dekselslipp ved hjelp av en skalpell. Inne i hver rute, score og fjern en åtte millimeter bred firkantbrønn.Overfør hver firkantede PDMS-brønn til en 22 x 22 millimeter dekselslip og fest den godt. For å feste embryoene til dekselslippene, bruk nok 0,1% Poly-L-lysin til å dekke dekselglideoverflaten inne i hver brønn og plasser dem i en 55 graders Celsius-inkubator for å tørke. Skyll embryoene og PBS kort for å fjerne mellomvaskemiddelet.Overfør deretter mer enn 10 embryoer til hver poly-L-lysinbelagt brønn. La embryoene slå seg ned til bunnen av brønnene. Fjern overflødig væske fra de vedheftede embryoene ved hjelp av en Pasteur-pipette og fortsett umiddelbart til neste trinn.Mens embryoene sitter i monomerløsningen, lag en geleringsløsning for å dekke PDMS-brønnene. Fortynn den katalytiske oksidanten ferskt fra pulveret. Kombiner 3.920 mikroliter monomeroppløsning med 60 mikroliter 10% TEMED og 20 mikroliter 1% TEMPO.Del geleringsløsningen i 125 mikroliter aliquots i flere PCR-rør. Fjern monomerløsningen fra PDMS-brønnene ved hjelp av vakuum eller pipe mens du er forsiktig så du ikke forstyrrer embryoene. Tilsett fem mikroliter APS til et av PCR-rørene som inneholder geleringsløsning for å initiere polymerisering.Fordel polymerisasjonsgeleringsløsningen raskt mellom de tre brønnene. Gjenta dette til alle brønner og embryoer er dekket. La prøvene gel i 1,5 til 2,5 timer ved 37 grader Celsius.Tykkere hydrogeler vil ta lengre tid å fullføre polymerisering og størkne. Agiter hydrogelene ofte for å overvåke polymerisasjonen. Når de er størknet, vil hydrogeler ikke vrikke.Etter gelering, skrell PDMS-brønnene fra dekselet uten å forstyrre hydrogelene. Overfør hydrogelene individuelt inn i brønnene på en seks brønnplate. Hydrogelene kan ekspandere litt under fordøyelsen.Dekk gelene helt med fordøyelsesbuffer. 30 ml fordøyelsesbuffer er tilstrekkelig til å dekke dem i en seks brønnplate og inkubere dem i en time ved 37 grader Celsius. Etter fordøyelsen, flytt hydrogelene inn i en seks centimeter petriskål og fyll den med avionisert vann for å ekspandere.Hydrogelene kan løsne fra dekselslippene på dette punktet og utvide seg fire ganger i lineær dimensjon. Bruk en Pasteur-pipette til å fjerne så mye overflødig vann fra petriskålen som mulig for å minimere bevegelsen av gelene når de håndteres. Manøvrer de ekspanderte gelene med embryoene på bunnflaten på en stor dekselslipp for avbildning.Monter hvert deksel med gel over målet med et invertert laserskanning konfokalmikroskop. Etter å ha funnet de riktig iscenesatte og orienterte prøvene, byttet til et olje- eller vannnedsenkingsmål med høy forstørrelse for å avbilde med høy oppløsning. Måling av embryolengde langs hode-til-hale-aksen under et 10x objektiv viste at uutvidede embryoer strakte seg over omtrent halvparten av et synsfelt, mens de utvidede embryoene strakte seg over omtrent to fulle synsfelt.Den gjennomsnittlige hode til hale lengden på de uutvidede kontrollembryoene var 398,8 mikrometer. For eksperiment en, to og tre var de gjennomsnittlige embryolengdene ekspansjonsfaktorer på henholdsvis 4,0 ganger, 4,7 ganger og 4,9 ganger. I kontrollprøven hadde cellene i det maksillære segmentet en gjennomsnittlig bredde på 4, 76 mikrometer.I de utvidede prøvene hadde cellene i det maksillære segmentet en gjennomsnittlig bredde på 19, 10 mikrometer, noe som representerte en 4, 0 ganger ekspansjon. Actomyosincytoskjelettet ble avbildet i uutvidet kontroll versus utvidede embryoer, som gjennomgikk konvergent forlengelse. De dukket opp som en enkelt linje der naboceller møttes.I kontrast, i utvidede stadium syv embryoer, kunne parallelle linjer av myosin to observeres ved cellecellekryss, som representerer kortikale proteinbassenger i tilstøtende celler. I det uutvidede stadium seks embryoer fremsto mitokondriene merket med streptavidin som en heterogen cytoplasmatisk dis uten noen klare subcellulære detaljer. I de utvidede embryoene var imidlertid mange puncta oppløselige i cytoplasma, som sannsynligvis representerte fragmenterte mitokondrier eller deler av mitokondrienettverket.En viktig ting å huske når du prøver denne prosedyren er å beskytte embryoer fra overdreven lyseksponering etter sekundært antistoff inkubasjon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Flere hierarkisk Imaging av føljetong delene for å finne konkrete mobilnettet mål i store volumer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hele-mount AC Confocal mikroskopi for voksen øre hud: et modellsystem Nevro-vaskulær Branching Morphogenesis og immun celle distribusjon

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse av Cardiac kammer utvikling under musen Embryogenesis bruke hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...