Name: using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging
Uploaded: 2023-04-28T14:30:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить доктора Дженнифер Заллен за предоставление морскому свинке первичного антитела против Par-3. Эта работа была поддержана щедрым финансированием (1R15GM143729-01 и 1P20GM139768-01 5743) от Национального института общих медицинских наук (NIGMS), одного из членов Национальных институтов здоровья (NIH), а также Института биологических наук Арканзаса (ABI), который предоставил частичное финансирование для покупки нашего конфокального микроскопа.

     

<ol>
	<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li><li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging.+Expansion+microscopy.">Optical imaging. Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy.">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li><li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies.">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li><li>Chang, J. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li><li>Cahoon, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+expansion+microscopy+reveals+the+three-dimensional+organization+of+the+Drosophila+synaptonemal+complex.">Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).</li><li>Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+LRP4+promotes+synapse+number+and+function+of+excitatory+CNS+neurons.">Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons.</a> eLife. 6, e27347 (2017).</li><li>Jiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+Drosophila+tissues+using+expansion+microscopy.">Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).</li><li>Yu, C. -. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+C.+elegans.">Expansion microscopy of C. elegans.</a> eLife. 9, e46249 (2020).</li><li>Freifeld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+of+zebrafish+for+neuroscience+and+developmental+biology+studies.">Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+transitions+in+ionic+gels.">Phase transitions in ionic gels.</a> Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).</li><li>Hausen, P., Dreyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+polyacrylamide+as+an+embedding+medium+for+immunohistochemical+studies+of+embryonic+tissues.">The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues.</a> Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins.">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li><li>Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster.">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryo+dechorionation.">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila apple juice-agar plates. , (2011).</li><li>de Matos Sim&#245;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+directs+bazooka/Par-3+planar+polarity+during+drosophila+axis+elongation.">Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation.</a> Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).</li><li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+(U-ExM).">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li><li>Par&#233;, A. C., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+molecular,+and+biophysical+control+of+epithelial+cell+intercalation.">Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).</li><li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos.">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo.">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).</li><li>Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+morphology+and+activity+regulate+furrow+ingression+and+contractile+ring+dynamics+in+Drosophila+cellularization.">Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).</li><li>Stelzer, E. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy.">Light sheet fluorescence microscopy.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).</li><li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues.">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li><li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+labeling+strategy+for+nucleic+acids+in+expansion+microscopy.">A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).</li><li>M'Saad, O., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+proteins+in+their+ultrastructural+context.">Light microscopy of proteins in their ultrastructural context.</a> Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).</li><li>Sarkar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+revealing:+Decrowding+proteins+to+unmask+invisible+brain+nanostructures.">Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures.</a> bioRxiv. , (2020).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Ручная девителлинизация Большинство протоколов фиксации эмбрионов дрозофилы включают удаление вителлиновой мембраны путем встряхивания фиксированных эмбрионов в эмульсии метанола и гептана, что вызывает разрыв мембран в результате осмотического разрыва26. В то время как девителлинизация на основе метанола (лопание метанола) эффективна и подходит для многих применений, ручная девителлинизация (ручной пилинг) имеет ряд существенных преимуществ. Во-первых, ручной пилинг позволяет выбрать точно поставленные эмбрионы для девителлинизации и сбора, что значительно повышает вероятность получения расширенных эмбрионов в пригодной для использования ориентации в конце эксперимента. Это обогащение имеет решающее значение при изучении специфических аспектов процессов быстрого развития (например, инвагинации мезодермы или конвергентного расширения), для которых эмбрионы с соответствующей стадией могут составлять всего несколько процентов всех эмбрионов, даже в пределах ограниченного по времени окна сбора. Конечно, для многих применений будет достаточно более традиционного массового вскрытия эмбрионов метанолом из окна сбора по времени, а ручная очистка может не стоить дополнительных усилий. Во-вторых, на связывание некоторых первичных антител и красителей отрицательно влияет предыдущее воздействие метанола на образец. По этой причине ручной пилинг может привести к значительному повышению качества сигнала иммунофлуоресценции по сравнению с образцами метанола, что делает его полезным общим методом для биологов развития дрозофилы .
Конфокальная микроскопия высокого разрешения для расширенных цельных эмбрионов дрозофилы Несмотря на то, что выполнение конфокальной микроскопии с высоким разрешением на расширенных образцах концептуально такое же, как и на нерасширенных образцах, ExM создает некоторые технические препятствия. Примечательно, что ориентация эмбриона, которая является случайной, становится еще более важной по мере увеличения размера выборки, потому что объективы с большим увеличением и высокой NA способны фокусировать свет только из областей образца, которые находятся очень близко к покровному стеклу27. Поэтому, как правило, можно сфокусироваться только на тех клетках, которые находятся на поверхности эмбриона или рядом с ней, которые оказались рядом с покровным стеклом в момент формирования геля. Лучший способ убедиться в том, что в конце исследования имеются образцы правильной ориентации, заключается в том, чтобы начать протокол ExM с строго поэтапного сбора фиксированных эмбрионов (например, с помощью ручного пилинга) и посеять много эмбрионов в каждую лунку (>10). Для визуализации клеток, расположенных глубоко внутри эмбриона, может потребоваться использование более специализированных установок визуализации, таких как световая микроскопия28. Кроме того, мы обнаружили, что качество изображения можно улучшить, открыв конфокальное точечное отверстие до размера, превышающего одну единицу воздуха. Конечно, увеличение размера точечного отверстия будет происходить за счет снижения максимального разрешения, но на практике даже небольшое увеличение размера точечного отверстия может значительно повысить интенсивность сигнала (данные не показаны). В будущих исследованиях необходимо систематически изучать размер точечных отверстий и эффективное разрешение в образцах ExM.
Вариации базового ExM Протокол, описанный здесь, является относительно простым примером ExM, который должен работать во многих приложениях и быть простым в реализации в большинстве лабораторий биологии развития. Тем не менее, существует множество вариаций базовой концепции ExM 4,5,7, которые могут быть использованы для увеличения интенсивности сигнала, достижения еще большей степени расширения и обнаружения молекул нуклеиновых кислот, а также белков. В этом протоколе эмбрионы инкубируются с антителами перед гелеобразованием и расширением. В качестве альтернативы, образцы могут быть обработаны антителами после того, как они расширены 6,30, что может увеличить интенсивность сигнала из-за увеличения доступности эпитопов и уменьшения потери связанных антител на этапах расширения. Кроме того, специфические сшивающие молекулы могут быть использованы для присоединения молекул РНК к гидрогелю, что позволяет обнаруживать РНК в расширенных гелях с помощью метода гибридизационной цепной реакции30. Наконец, образцы могут быть подвергнуты нескольким циклам расширения, как в итеративной расширительной микроскопии (iExM)31, pan-ExM32 и раскрытии расширения (ExR)31, для достижения еще более высоких степеней повышенного разрешения.

В клеточной биологии и биологии развития увидеть — значит поверить, и способность точно определять паттерны локализации белков является основополагающей для многих типов экспериментов. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия является стандартным инструментом для визуализации флуоресцентно меченных белков в трех измерениях в интактных образцах. Обычные конфокальные микроскопы не способны различать (разрешать) соседние флуоресцентные сигналы, разделенные менее чем половиной длины волныизлучаемого ими света. Другими словами, два точечных источника должны находиться на расстоянии не менее 200-300 нм в боковом направлении (500-700 нм в осевом направлении), чтобы они были различимы как два различных сигнала. Этот технический барьер известен как дифракционный предел, и он является фундаментальным препятствием для изучения сложных субклеточных структур (например, цитоскелетных или митохондриальных сетей актомиозина) с пространственными особенностями ниже дифракционного предела. Поэтому методы повышения разрешающей способности обычных конфокальных микроскопов представляют общий интерес для биологического сообщества.
Чтобы обойти дифракционный предел, был разработан ряд различных технологий микроскопии сверхвысокого разрешения, которые позволяют получать разрешение порядка десятков нанометров или менее 1,2,3, раскрывая мир биологической сложности, который ранее был доступен только с помощью электронной микроскопии. Несмотря на очевидные преимущества этих аппаратных методов, микроскопы сверхвысокого разрешения часто предъявляют особые требования к маркировке образцов и длительному времени сбора, что ограничивает их гибкость или они могут быть просто слишком дорогими для доступа к ним в некоторых лабораториях. Альтернативой микроскопу сверхвысокого разрешения является расширительная микроскопия (ExM), которая не является разновидностью микроскопии как таковой, а скорее представляет собой метод набухания образца с сохранением относительной пространственной организации составляющих его молекул4. Изотропно расширенные образцы затем можно наблюдать с эффективно увеличенным разрешением с помощью традиционного флуоресцентного конфокального микроскопа. ExM был впервые описан группой Бойдена в 2015 г.5, и с тех пор базовая методика была адаптирована для использования в различных экспериментах 6,7,8. ExM также был адаптирован для использования на цельных эмбрионах, в частности, у дрозофилы 9,10,11, C. elegans12 и рыбки данио-рерио 13, что делает его мощным инструментом для биологов развития.
ExM основан на двух различных химических составах гидрогелей: 1) набухающие полиэлектролитные гидрогели, которые значительно увеличиваются в размерах при замачивании в воде14, и 2) полиакриламидные гидрогели, которые имеют чрезвычайно маленькое расстояние между полимерами, что позволяет изотропно расширять образец15. Несмотря на то, что существует множество опубликованных протоколов ExM, они, как правило, имеют следующие общие этапы: фиксация образца, маркировка, активация, гелеобразование, расщепление и расширение4. Условия фиксации и стратегии флуоресцентного мечения, конечно, будут варьироваться в зависимости от потребностей эксперимента и системы, а в некоторых протоколах маркировка происходит после расширения. Молекулы-мишени в образце должны быть загрунтованы (активированы) для связывания с гидрогелем, что может быть достигнуто с использованием различных химических составов4. На этапах гелеобразования образец насыщают мономерами будущего гидрогеля (акрилатом натрия, акриламидом и сшивающим агентом бисакриламидом), а затем гидрогель формируют путем свободнорадикальной полимеризации, катализируемой инициатором, таким как персульфат аммония (APS), и ускорителем, таким как тетраметилендиамин (TEMED)4. После гелеобразования образец ферментативно сбраживают для гомогенизации устойчивости образца к набуханию и обеспечения изотропного расширения гидрогеля4. Наконец, сброженный гидрогель помещают в воду, что заставляет его расширяться примерно в четыре раза по сравнению с первоначальным линейным размером4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig01v2.jpg"> Рисунок 1: Обзор расширительной микроскопии эмбрионов дрозофилы . ExM — это многоступенчатый протокол, который занимает не менее 4 дней. Забор, фиксация и девителлинизация эмбрионов занимают 1 день или более в зависимости от того, объединены ли эмбрионы из нескольких коллекций. Иммунофлуоресцентное мечение занимает 1 или 2 дня в зависимости от того, инкубируются ли эмбрионы в течение ночи с первичными антителами. Активация, гелеобразование, расщепление и расширение эмбриона могут быть выполнены в течение одного дня. Гели могут быть установлены и сфотографированы сразу после расширения, хотя из практических соображений часто желательно начать визуализацию на следующий день. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig01largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В этом протоколе описывается, как проводить ExM на эмбрионах дрозофилы 16 на ранних и средних стадиях развития для визуализации паттернов локализации субклеточных белков в сверхвысоком разрешении (рис. 1). Этот метод использует химический состав N-гидроксисукцинимидилового эфира метилакриловой кислоты (MA-NHS) для активации и привязки белковых молекул к гидрогелю17 и является модификацией ранее опубликованного протокола ExM для использования на поздних стадиях эмбрионов и тканей дрозофилы 11. В этом протоколе используются лунки из полидиметилсилоксана (PDMS) для формования гидрогелей и облегчения обмена раствором во время активации и гелеобразования. Альтернативный метод, не требующий создания лунок PDMS, включает опускание эмбрионов, прикрепленных к покровным стеклам, в капли раствора мономера, сидящие на куске лабораторной герметизирующей пленки22. Кроме того, в этом протоколе описан метод ручного удаления непроницаемой вителлиновой мембраны, окружающей эмбрионы дрозофилы, что является обязательным условием для иммунофлуоресцентного окрашивания. Важно отметить, что этот метод ручной очистки эмбрионов может быть использован для отбора только правильно расположенных эмбрионов дрозофилы перед маркировкой образцов, что значительно повышает вероятность получения расширенных образцов правильной стадии и ориентации и, таким образом, делает последующий сбор данных гораздо более эффективным.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>1490-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP rabbit polyclonal antibody</td>
			<td>Torrey Pines BioLabs</td>
			<td>TP-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisacrylamide</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (30% solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical tubes, 50 mL</td>
			<td>fisherscientific&#160;</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverlip glass, square 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for pulling needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass microinjection needles (pre-pulled)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TIP10LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101970-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-HX0078-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex pipet bulbs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730300-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge tube, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well plate, 6-well</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>509804487 (Fisher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet (2 mL, short tip)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102092-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>32-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (10x solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution (0.1% solution)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P8920-1ooML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>E00491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation vials (30 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acrylate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101181-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide (powder)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71289</td>
			<td>make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S32354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (50x)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape (double-sided, 1 inch wide)</td>
			<td>Scotch&#160; 3M</td>
			<td>665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI17919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMPO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM8.14681.0005</td>
			<td>catalytic oxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-872</td>
			<td>extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 900</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser scanning microscope used without AiryScan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount drosophila embryos for super-resolution imaging

Рабочей лошадкой биологии развития является конфокальный микроскоп, который позволяет исследователям определять трехмерную локализацию меченых молекул в сложных биологических образцах. В то время как традиционные конфокальные микроскопы позволяют разрешать два соседних источника флуоресцентных точек, расположенных на расстоянии нескольких сотен нанометров друг от друга, наблюдение за более тонкими деталями субклеточной биологии требует способности разрешать сигналы порядка десятков нанометров. Для того, чтобы позволить исследователям обойти такие ограничения разрешения, было разработано множество аппаратных методов для микроскопии сверхвысокого разрешения, хотя эти методы требуют специализированных микроскопов, которые доступны не всем исследователям. Альтернативным методом увеличения разрешающей способности является изотропное увеличение самого образца с помощью процесса, известного как расширительная микроскопия (ExM), который был впервые описан группой Бойдена в 2015 году. ExM не является разновидностью микроскопии как таковой , а скорее представляет собой метод набухания образца с сохранением относительной пространственной организации составляющих его молекул. Затем расширенный образец можно наблюдать с эффективно увеличенным разрешением с помощью традиционного конфокального микроскопа. В данной статье мы опишем протокол реализации ExM в эмбрионах дрозофилы , который используется для изучения локализации Par-3, миозина II и митохондрий в поверхностных эпителиальных клетках. Этот протокол позволяет увеличить размер образца примерно в четыре раза, что позволяет обнаруживать субклеточные детали, которые не видны при обычной конфокальной микроскопии. В качестве доказательства принципа, анти-GFP антитело используется для различения отдельных пулов миозина-GFP между соседними клеточными корами, а флуоресцентно меченный стрептавидин используется для обнаружения эндогенных биотинилированных молекул, чтобы выявить мелкие детали архитектуры митохондриальной сети. Этот протокол использует общие антитела и реагенты для флуоресцентного мечения, и он должен быть совместим со многими существующими протоколами иммунофлуоресценции.

Чтобы охарактеризовать общую эффективность ExM у цельных эмбрионов дрозофилы, длина эмбриона вдоль оси от головы до хвоста была измерена у нерасширенных контрольных эмбрионов по сравнению с расширенными эмбрионами (рис. 3A-C). Нерасширенные контрольные эмбрионы были подвергнуты тем же условиям фиксации и иммунофлуоресцентному мечению, что и расширенные эмбрионы, за исключением того, что они были установлены с использованием затвердевшей монтажной среды перед визуализацией. Отдельные нерасширенные эмбрионы охватывали примерно половину поля зрения при использовании 10-кратного объектива (рис. 3A). Напротив, расширенные эмбрионы охватывали примерно два полных поля зрения при использовании одного и того же 10-кратного объектива (рис. 3B). Чтобы оценить, как изменяется степень экспансии как внутри, так и между экспериментами, один и тот же протокол ExM был выполнен в трех отдельных случаях, и длина эмбриона была измерена в трех разных гелях в каждом отдельном эксперименте. Средняя длина от головы до хвоста у нерасширенных контрольных эмбрионов составила 398,8 мкм (стандартное отклонение [SD] = 22,93 мкм; n = 74; Рисунок 3В). Для экспериментов 1, 2 и 3 средняя длина эмбриона составила 1596 мкм (SD = 159,9 мкм; n = 57), 1868 мкм (SD = 150,5 мкм; n = 51) и 1954 мкм (SD = 120,3 мкм; n = 44) соответственно, что соответствует коэффициентам расширения 4,0, 4,7 и 4,9 раза соответственно (рис. 3C). Внутриэкспериментальная вариабельность между гелями была значительно менее заметной, чем межэкспериментальная, которая составляла примерно 20% (рис. 3В). Для оценки влияния ExM на морфологию клеток и эмбрионов было использовано антитело против компонента адгезивного соединения Par-3 (Bazooka)21 для мечения апикальных клеточных мембран, и мы визуализировали развивающиеся ротовые сегменты эмбрионов дрозофилы 11-й стадии — стадии со сложной сегментированной структурой (рис. 3D-F). В контрольной выборке клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 4,76 мкм (SD = 1,053 мкм, n = 25; Рисунок 3D,F). В расширенных образцах, полученных с использованием того же 40-кратного объектива и коэффициента масштабирования (1x), клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 19,10 мкм (SD = 3,966 мкм, n = 18; 3E,F), представляющий собой 4,0-кратное расширение. Таким образом, в соответствии с предыдущими отчетами11, мы смогли увеличить целые эмбрионы дрозофилы примерно в четыре раза по линейным размерам с помощью ExM без разрыва образца или явных искажений в клеточной или тканевой морфологии.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig03.jpg"> Рисунок 3: Четырехкратное расширение эмбрионов дрозофилы. (A) Нерасширенные и (B) расширенные эмбрионы дрозофилы, полученные с помощью 10-кратного объектива (0,3 NA) при 1-кратном увеличении. Отдельные поля зрения (FOV) обозначены пунктирными линиями. Эмбрионы экспрессировали GFP-меченую версию легкой цепи миозина и были окрашены антителами против GFP. (C) Количественная оценка длины эмбриона (вдоль оси «от головы до хвоста») в трех гидрогелях за эксперимент и в трех отдельных экспериментах ExM по сравнению с нерасширенной контрольной группой. (Д,Э) Верхнечелюстные сегменты из (D) нерасширенных и (E) расширенных эмбрионов дрозофилы 11-й стадии, визуализированные с помощью 40-кратного объектива (1,3 NA) при 1-кратном увеличении. Контуры клеток (адгезивные соединения) были обнаружены антителами против Par-3/Bazooka (белого цвета). (F) Количественная оценка ширины ячейки (длинная ось) из эквивалентных групп ячеек из (D) и (E). Ящичковые диаграммы на рисунках (C) и (F) показывают диапазоны 25-го, 50-го и 75-го процентилей; усы обозначают минимальное и максимальное значения; Символы «+» обозначают среднее значение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Чтобы продемонстрировать, что ExM может быть использован для разрешения субклеточных деталей ниже типичного дифракционного предела, цитоскелет актомиозина был визуализирован в нерасширенном контроле по сравнению с расширенными эмбрионами, подвергающимися конвергентному расширению (стадия 7). События ремоделирования тканей гаструляции и конвергентного растяжения в значительной степени контролируются изменениями локализации моторного белка миозина II24. Однако в плотно упакованном столбчатом эпителии ранней эктодермы дрозофилы трудно разглядеть многие мелкие детали картины локализации миозина II даже при 158-кратном увеличении (63-кратный объектив с 2,5-кратным оптическим зумом) — типичная максимальная разрешающая способность для лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Например, из-за того, что миозин II является кортикальным белком (расположенным непосредственно под плазматической мембраной), пулы миозина II25 , расположенные по обе стороны от межклеточных контактов, были неразрешимы у эмбрионов 7-й стадии, и они выглядели как одна линия, где соседние клетки встречались (рис. Напротив, у расширенных эмбрионов 7-й стадии в межклеточных соединениях можно было наблюдать параллельные линии миозина II, представляющие собой пулы кортикальных белков в соседних клетках (рис. 4B). Расстояние между параллельными линиями миозина II в расширенных образцах составило 892,7 нм (SD = 0,171 нм, n = 12); При делении на четыре это дает предсказанное расстояние ~220 нм между линиями миозина в соседних клетках у нерасширенных эмбрионов, что действительно чуть ниже дифракционного предела для сигнала, обнаруженного с помощью Alexa 488 (пиковое излучение ~520 нм/2 = 260 нм).
Кроме того, мы также проверили, можно ли использовать ExM для разрешения архитектуры митохондриальной сети в плотно упакованных клетках гаструлирующих эмбрионов дрозофилы (стадия 6). Функция митохондрий тесно связана со структурой сети (т.е. сросшимися или фрагментированными органеллами), но детали организации митохондриальной сети трудно визуализировать с помощью обычной конфокальной микроскопии в типах клеток, которые не являются плоскими и/или тонкими. Митохондрии естественным образом богаты биотинилированными молекулами, и, таким образом, митохондрии могут быть помечены в раннем эмбрионе дрозофилы с помощью флуоресцентно меченного стрептавидина26. У нерасширенных эмбрионов 6-й стадии, помеченных стрептавидином-Alexa 488, сигнал проявлялся в виде цитоплазматических точек, которые часто перекрывались и трудно разрешались (рис. 4C). Напротив, у расширенных эмбрионов 6-й стадии было видно гораздо больше мелких деталей митохондриальной сети, а пункты были легче различимы (рис. 4D)26,27. Эти результаты указывают на то, что ExM может быть использован для изучения организации митохондриальной сети в типах клеток, традиционно не подходящих для митохондриального анализа.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2.jpg"> Рисунок 4: Детали цитоскелета и митохондрий актомиозина, выявленные с помощью расширительной микроскопии. (A,B) Локализация миозина II в клетках нейроэктодермы (зародышевой полосы), визуализированная с помощью 63-кратного объектива (1,4 NA) при 2,5-кратном увеличении на стадии 7 (A) нерасширенные и (B) расширенные эмбрионы. Миозин II был обнаружен у эмбрионов, экспрессирующих трансгенную GFP-меченую версию регуляторной легкой цепи миозина II (sqh-GFP), которая была обнаружена с антителом к GFP (красный). Отчетливые пулы кортикального миозина, расположенные в соседних клетках, могут быть разрешены в расширенном эмбрионе (белые стрелки). (С,Д) Митохондриальные сети в клетках нейроэктодермы, визуализированные с помощью объектива 63× (1,4 NA) при 2,5-кратном увеличении у нерасширенных (C) и расширенных (D) эмбрионов 6-й стадии. Митохондрии были обнаружены с помощью стрептавидина-Alexa 488 (зеленый), а контуры клеток были обнаружены с помощью антитела против Par-3/Bazooka (пурпурного). Эксперименты проводили с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/64662fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Рецепты растворов. Состав для растворов, используемых в данном протоколе, в порядке появления. Все акции являются ликвидными, если не указано иное. Химические вещества были ресуспендированы или разбавлены в автоклавной фильтрованной воде, если не указано иное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64662/JOVE_Parveen%202023_Revision_Recipes.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging at JoVE.com

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Представлен протокол реализации расширительной микроскопии у ранних эмбрионов дрозофилы для получения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычного лазерно-сканирующего конфокального микроскопа.

Использование расширительной микроскопии для физического увеличения эмбрионов дрозофилы для визуализации сверхвысокого разрешения

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Этот протокол может быть реализован в большинстве лабораторий биологии развития пищевода, позволяя исследователям, не имеющим доступа к микроскопам сверхвысокого разрешения, получать изображения сверхвысокого разрешения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследователям обойти дифракционный предел обычной конфокальной микроскопии, не требуя микроскопа сверхвысокого разрешения, за счет расширения самого образца. Этот протокол будет полезен для тех, кто изучает, как локализация белка влияет на морфологию или функцию клеток в интактных эмбрионах, особенно когда эти белки организованы в сложные субклеточные структуры или сети.Наиболее распространенной проблемой, с которой сталкиваются люди, является потеря эмбрионов на протяжении всего протокола. Рекомендуется нанести несколько слоев поли-L-лизина, чтобы эмбрионы прочно прилипли. После эмбрионов возьмите шестисантиметровую пластиковую основу чашки Петри, наполовину заполненную 3%-ным агаром.Нарежьте прямоугольник размером пять на три сантиметра в агаре лезвием бритвы или скальпелем. Удалите агаровую плиту с помощью небольшого лабораторного шпателя. Затем переверните основание чашки Петри, установите его на скамью и положите пластину агара поверх перевернутой чашки.Снимите крышку с чашки Петри и убедитесь, что она сухая. С помощью перчаток прикрепите кусок двустороннего скотча к внутренней стороне крышки. Выньте флаконы с покрытыми оболочкой и зафиксированными эмбрионами из шейкера и поместите их вертикально на верстак.Дайте органической и водной фазам разделиться. Правильно зафиксированные эмбрионы должны оставаться на своем стыке. Полностью удалите нижнюю водную фазу с помощью пипетки Пастера и пипетки P200.Используйте стеклянную пипетку Пастера с латексной колбой для переноса фиксированных эмбрионов на агаровую пластину несколькими небольшими партиями, чтобы они не прилипали к внутренней части пипетки. После того, как эмбрионы окажутся на агаровой плите, используйте пипетку P200, чтобы удалить оставшийся гептан рядом с эмбрионами. Теперь опустите крышку из двустороннего скотча на агаровую плиту с высоты двух сантиметров, чтобы приклеить эмбрионы к ленте.Осторожно снимите крышку с агаровой плиты, положите ее вверх дном на стол и добавьте достаточное количество PBS Tween, чтобы покрыть эмбрионы в крышке. Для сбора нужных эмбрионов используют стерео препарирующий микроскоп при 100-кратном увеличении при непрямом освещении. Проколите вителлиновую оболочку возле переднего или заднего конца эмбриона тонкой стеклянной иглой, чтобы сдуть ее и ослабить давление.Используйте тонкие щипцы или металлический зонд, чтобы осторожно вытолкнуть эмбрион через отверстие, при этом вителлиновая мембрана все еще приклеена к двустороннему скотчу. Оставьте на ленте нежелательные эмбрионы. Периодически используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать все плавающие девителлинизированные эмбрионы и переместить их в 1,5-миллилитровую пробирку для микрофуги.Приготовьте раствор PDMS в конической пробирке объемом 50 миллилитров и создайте сбалансированную пробирку, добавив соответствующее количество воды во вторую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте раствор PDMS при 500G в течение трех минут при температуре 15 градусов Цельсия. Затем перелейте его в 10-сантиметровую чашку Петри на глубину одного миллиметра.Дайте раствору PDMS затвердеть в течение ночи при температуре 55 градусов по Цельсию. После того, как плита PDMS затвердеет, нарежьте скальпелем квадратные площади немного меньше, чем покровное покрытие размером 22 на 22 миллиметра. Внутри каждого квадрата надрежьте и выньте квадрат шириной восемь миллиметров.Перенесите каждый квадрат PDMS на покровное покрытие размером 22 на 22 мм и прочно приклейте его. Чтобы приклеить эмбрионы к покровным стеклам, нанесите достаточное количество 0,1% поли-L-лизина, чтобы покрыть поверхность покровного стекла внутри каждой лунки, и поместите их в инкубатор с температурой 55 градусов Цельсия для сушки. Коротко промойте эмбрионы и PBS, чтобы удалить моющее средство для подростков.Затем перенесите более 10 эмбрионов в каждую лунку, покрытую поли-L-лизином. Дайте эмбрионам осесть на дно лунок. Удалите лишнюю жидкость из прилипших эмбрионов с помощью пипетки Пастера и сразу приступайте к следующему этапу.Пока эмбрионы находятся в растворе мономера, приготовьте раствор гелеобразования, чтобы покрыть лунки PDMS. Разведите каталитический окислитель свежим из порошка. Смешайте 3 920 микролитров раствора мономера с 60 микролитрами 10%-ного TEMED и 20 микролитрами 1%-ного TEMPO.Раствор гелеобразования разделить на аликвоты по 125 микролитров на несколько пробирок для ПЦР. Удалите раствор мономера из лунок PDMS с помощью вакуума или пипетки, стараясь не повредить эмбрионы. Добавьте пять микролитров APS в одну из пробирок для ПЦР, содержащую раствор гелеобразования, чтобы инициировать полимеризацию.Быстро распределите полимеризующий раствор гелеобразования между тремя лунками. Повторяйте это до тех пор, пока все лунки и эмбрионы не будут покрыты. Дайте образцам застудиться в течение 1,5-2,5 часов при температуре 37 градусов по Цельсию.Более густым гидрогелям потребуется больше времени для полной полимеризации и затвердевания. Часто перемешивайте гидрогели, чтобы контролировать полимеризацию. После затвердевания гидрогели не будут шевелиться.После гелеобразования отклейте лунки PDMS от покровного шликера, не повредив гидрогели. Переместите гидрогели по отдельности в лунки шестилуночной пластины. Гидрогели могут немного расширяться во время пищеварения.Полностью покройте гели пищеварительным буфером. 30 миллилитров пищеварительного буфера достаточно, чтобы покрыть их шестилуночной тарелкой и инкубировать в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. После разложения переместите гидрогели в шестисантиметровую чашку Петри и наполните ее деионизированной водой для расширения.В этой точке гидрогели могут отсоединиться от покровных скольжений и развернуться на четыре складки в линейном размере. С помощью пипетки Пастера удалите как можно больше лишней воды из чашки Петри, чтобы свести к минимуму движение гелей при обращении. Переместите расширенные гели с эмбрионами на нижнюю поверхность на большой покровный лист для визуализации.Наклейте каждую крышку с гелем на объектив инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа. После определения местоположения правильно расположенных и ориентированных образцов переключаются на масляный или водопогружающий объектив с большим увеличением для получения изображения с высоким разрешением. Измерение длины эмбриона вдоль оси головы до хвоста под 10-кратным объективом показало, что нерасширенные эмбрионы охватывают примерно половину поля зрения, в то время как расширенные эмбрионы охватывают примерно два полных поля зрения.Средняя длина головы до хвоста нерасширенных контрольных эмбрионов составила 398,8 мкм. Для первого, второго и третьего экспериментов средняя длина эмбриона была коэффициентом экспансии в 4,0, 4,7 и 4,9 раза соответственно. В контрольной выборке клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 4,76 мкм.В расширенных образцах клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 19,10 мкм, что представляет собой расширение в 4,0 раза. Цитоскелет актомиозина был визуализирован в нерасширенном контроле по сравнению с расширенными эмбрионами, подвергающимися конвергентному расширению. Они выглядели как единая линия, где сходились соседние клетки.Напротив, у эмбрионов седьмой стадии на расширенной стадии можно было наблюдать параллельные линии миозина 2 в клеточных соединениях, представляющие собой пулы кортикальных белков в соседних клетках. У нерасширенных эмбрионов шестой стадии митохондрии, меченные стрептавидином, выглядели как гетерогенная цитоплазматическая дымка без каких-либо четких субклеточных деталей. Тем не менее, у расширенных эмбрионов в цитоплазме можно было разрешать многочисленные пункты, которые, вероятно, представляли собой фрагментированные митохондрии или части митохондриальной сети.Одна важная вещь, которую следует помнить при попытке выполнить эту процедуру, - это защита эмбрионов от чрезмерного воздействия света после инкубации вторичных антител.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Целом гора Confocal микроскопии для уха взрослого кожи: модель системы для изучения нейро сосудистые ветвления морфогенеза и иммунных клеток распределения

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Анализ развития сердечной камеры во время эмбриогенеза мыши с помощью эпифлуоресцентного вся гора

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...