Name: mechano-node-pore sensing: a rapid, label-free platform for multi-parameter single-cell viscoelastic measurements
Uploaded: 2022-12-02T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por bolsas do NIBIB 1R01EB024989-01 e NCI 1R01CA190843-01. A. L. e R. R. foram apoiados por uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da H2H8 Association. K. L. C. foi apoiado por uma National Science Foundation Graduate Research Fellowship e uma Siebel Scholar Fellowship.

1. Projete a geometria do dispositivo
<ol><li>Escolha a largura dos segmentos de dimensionamento e recuperação para que seja maior do que o diâmetro das maiores células a serem medidas, mas também mantenha uma relação sinal-ruído (SNR) suficiente. Consulte a Tabela Suplementar 2 para obter exemplos de diferentes larguras de segmento de dimensionamento e recuperação para várias linhas celulares.</li>
	<li>Escolha a largura do segmento de contração para aplicar uma tensão d...

<ol>
	<li>Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+the+cytoskeleton+and+cells.">Mechanical properties of the cytoskeleton and cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+cellular+mechanical+phenotypes+with+mechano-node-pore+sensing.">Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4, 17091 (2018).</li><li>Mierke, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+antibody-antigen+binding+using+an+on-chip+artificial+pore.">Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).</li><li>Saleh, O. A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+nanopore+for+molecular+sensing.">An artificial nanopore for molecular sensing.</a> Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).</li><li>Saleh, O. A., Sohn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+sensing+of+nanoscale+colloids+using+a+microchip+Coulter+counter.">Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).</li><li>DeBlois, R. W., Bean, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Node-pore+sensing+enables+label-free+surface-marker+profiling+of+single+cells.">Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).</li></ol>

A medição das propriedades mecânicas de células individuais usando essa técnica de mecanofenotipagem consiste em três etapas: fabricação de dispositivos, aquisição de dados e análise de dados. Dentro de cada etapa, há aspectos notáveis que podem impactar significativamente os resultados experimentais. Durante a fabricação do dispositivo, geometrias de canal consistentes e uniformidade dispositivo-a-dispositivo são essenciais para resultados precisos e repetíveis. Especificamente, as paredes laterais de c...

As células individuais são materiais dinâmicos e viscoelásticos1. Uma infinidade de processos internos e externos (por exemplo, início da mitose ou remodelamento da matriz extracelular [MEC]) influenciam sua estrutura e composição 2,3,4, resultando muitas vezes em propriedades biofísicas distintas que complementam seu estado atual. Em particular, as propriedades mecânicas têm se mostrado importantes biomarcadores do desenvolvimento celular, fisiologia e patologia, produzindo informações quantitativas valiosas que podem complementar as abordagens moleculares e genéticas canônicas 5,6,7. Por exemplo, Li et al. descreveram recentemente as diferenças mecânicas entre células de leucemia promielocítica aguda resistentes e responsivas a medicamentos, ao mesmo tempo em que usaram RNA-seq para descobrir genes associados ao citoesqueleto diferencialmente expressos8. Ao compreender a complexa interação entre a mecânica unicelular e a função celular, a mecanofenotipagem tem aplicações mais amplas na transformação da ciência básica e do diagnóstico clínico9.
A ferramenta mais amplamente adotada para medir a mecânica unicelular é a microscopia de força atômica (AFM). Embora o AFM permita uma medição localizada de alta resolução das propriedades mecânicas celulares, ele permanece limitado a uma taxa de transferência de <0,01 células/s10. Alternativamente, as macas ópticas, que usam dois feixes de laser divergentes para prender e deformar células únicas suspensas11, são limitadas a rendimentos marginalmente mais altos de <1 célula/s12. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas permitiram uma nova geração de dispositivos para avaliação mecânica rápida, unicelular12,13. Essas técnicas empregam canais de constrição estreitos14,15, fluxo de cisalhamento 16 ou alongamento hidrodinâmico17 para deformar células rapidamente em rendimentos de 10-1.000 células/s 18. Embora a taxa de medição dessas abordagens seja consideravelmente mais rápida do que as técnicas convencionais, elas geralmente trocam recursos de alto rendimento por leituras mecânicas limitadas (Tabela Suplementar 1). Todos os métodos microfluídicos rápidos acima mencionados se concentram em métricas básicas de parâmetro único, como tempo de trânsito ou taxas de deformabilidade, que refletem apenas as propriedades elásticas de uma célula. No entanto, dada a natureza viscoelástica intrínseca de células individuais, uma caracterização mecânica robusta e completa das células requer a consideração não apenas de componentes elásticos, mas também de respostas viscosas.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (Figura 1A) é uma plataforma microfluídica que aborda as limitações existentes com a mechanofenotipagem de célula única. Este método permite a medição de múltiplos parâmetros biofísicos simultaneamente, incluindo diâmetro celular, deformabilidade relativa e tempo de recuperação da deformação, com um rendimento moderado de 1-10 células/s. Essa técnica é baseada no node-pore sensing (NPS)19,20,21,22,23,24, que envolve o uso de uma medição de sonda de quatro pontos para medir o pulso de corrente modulada produzido por uma célula transitando por um canal microfluídico que foi segmentado por regiões mais amplas, referidas como "nós". O pulso de corrente modulada é resultado de a célula bloquear parcialmente o fluxo de corrente nos segmentos (ou seja, "poros") e nós, com mais corrente bloqueada no primeiro do que no segundo. No mecano-NPS, um segmento, o "canal de contração", é mais estreito do que o diâmetro de uma célula; consequentemente, uma célula deve se deformar para transitar por todo o canal (Figura 1B). O diâmetro da célula pode ser determinado pela magnitude do subpulso produzido quando a célula transita pelos poros do nó antes do canal de contração (Figuras 1B,C). Aqui, |ΔInp|, a queda de corrente quando a célula está no poro, é proporcional à razão de volume da célula para o poro, célula V/poro V 2,8,19. A rigidez celular pode ser determinada por ΔTc, a duração do subpulso dramaticamente maior produzido quando a célula transita pelo canal de contração (Figuras 1B,C). Uma célula mais rígida levará mais tempo para transitar pelo canal do que uma mais macia 2,8. Finalmente, a "recuperação" celular, a capacidade da célula de retornar ao seu tamanho original e forma pós-deformação, pode ser determinada pela série de subpulsos produzidos à medida que a célula transita pelos poros dos nós após o canal de contração (Figuras 1B,C). O tempo de recuperação, ΔTr, é o tempo que leva para que os subpulsos atuais retornem à magnitude dos subpulsos anteriores, antes da célula ser espremida. De modo geral, os pulsos de corrente modulada produzidos à medida que uma célula transita pelo canal microfluídico são registrados e analisados para extrair os parâmetros mecânicos de célula única relevantes (Figura 1D)2,8.
A reprodutibilidade e a facilidade de uso dessa plataforma microfluídica baseada em eletrônica foram previamente demonstradas25. Além disso, a plataforma apresenta uma baixa barreira de entrada para a mecanofenotipagem unicelular. A litografia suave padrão é empregada para fabricar dispositivos microfluídicos. O hardware de medição consiste em componentes baratos, incluindo uma placa de circuito impresso simples (PCB), fonte de alimentação, pré-amplificador, placa de aquisição de dados (DAQ) e computador. Finalmente, o código amigável está disponível para aquisição e análise de dados, permitindo uma implementação direta. Essa técnica de mecanofenotipagem pode distinguir populações de linhagens celulares epiteliais mamárias e pulmonares não malignas e malignas, discriminar sublinhagens em células epiteliais mamárias humanas primárias e caracterizar os efeitos de perturbações citoesqueléticas e outros agentes farmacológicos 2,8. No geral, esta plataforma é uma abordagem eficaz para a mecanofenotipagem de células individuais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5356-05</td>
			<td>Purity (GC)&#160; &#8805; 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Low-Pass Filter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>EF504</td>
			<td>&#8804;240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough&#160;(https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td>1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC Cable</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>2249-C-12</td>
			<td>https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&#38;utm_source=google&#38;utm_ 
			medium=cpc&#38;utm_campaign= 
			Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&#38;utm_term= 
			&#38;utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&#38;gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ 
			pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx 
			mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs 
			w-EALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom Polyester Swab</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18383</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current Preamplifier</td>
			<td>DL Instruments</td>
			<td>1211</td>
			<td>https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&#38;products_ 
			id=1419</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom PCB (w/ components)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>see Supplemental files 4 and 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ Terminal Block</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>BNC-2120</td>
			<td>https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAQ to BNC-2110 cable&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>SHC68-68-EPM</td>
			<td>https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition Board (DAQ)</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6251</td>
			<td>https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female BNC To Banana Plug Adapter</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>72909</td>
			<td>https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cutter</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-1179-21</td>
			<td>https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Etchant TFA</td>
			<td>Transene</td>
			<td>NC0977944</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SP131825&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Spectrum Chemical</td>
			<td>I1056-4LTPL</td>
			<td>Purity (GC)&#160; &#8805;99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Hardware Enclosure</td>
			<td>Hammond Manufacturing</td>
			<td>EJ12126</td>
			<td>https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td>Purity (GC)&#160; &#8805;99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-321 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://kayakuam.com/products/mf-321/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist</td>
			<td>DuPont</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain Glass Microscope Slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-5B</td>
			<td>Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90&#8211;1.10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller Software</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MAESFLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programming &#38; Computation Software</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>R2021b</td>
			<td>for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-31</td>
			<td>0.032&#34; ID x 0.056&#34;&#160;(https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter</td>
			<td>Millapore Sigma</td>
			<td>PHCC20060</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>Wafer World</td>
			<td>2885</td>
			<td>76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025 Negative Photoresist</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://kayakuam.com/products/su-8-2000/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 Developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>n/a</td>
			<td>https://kayakuam.com/products/su-8-developer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sygard 184 Polydimethlysiloxane</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>4019862</td>
			<td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>810-341296</td>
			<td>https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&#38;gclid= 
			Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 
			2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm 
			vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH 
			VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium, Platinum, Gold</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Output Power Supply</td>
			<td>Keysight</td>
			<td>E36311A</td>
			<td>https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Mask Aligner</td>
			<td>Karl Suss America</td>
			<td>MJB3 Mask Aligner&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechano-node-pore sensing: a rapid, label-free platform for multi-parameter single-cell viscoelastic measurements

As propriedades mecânicas celulares estão envolvidas em uma ampla variedade de processos biológicos e doenças, que vão desde a diferenciação de células-tronco até a metástase do câncer. Métodos convencionais para medir essas propriedades, como microscopia de força atômica (AFM) e aspiração de micropipeta (MA), capturam informações ricas, refletindo a resposta viscoelástica completa de uma célula; no entanto, esses métodos são limitados por uma taxa de transferência muito baixa. Abordagens de alto rendimento, como a citometria de deformabilidade em tempo real (RT-DC), só podem medir informações mecânicas limitadas, pois geralmente são restritas a leituras de parâmetro único que refletem apenas as propriedades elásticas de uma célula. Em contraste com esses métodos, o sensoriamento de poros de nós mecânicos (mecanano-NPS) é uma plataforma microfluídica flexível e livre de rótulos que preenche a lacuna na obtenção de medições viscoelásticas multiparâmetros de uma célula com rendimento moderado. Uma medição de corrente contínua (CC) é usada para monitorar as células à medida que elas transitam por um canal microfluídico, rastreando seu tamanho e velocidade antes, durante e depois de serem forçadas através de uma constrição estreita. Essas informações (ou seja, tamanho e velocidade) são usadas para quantificar a deformação transversal de cada célula, a resistência à deformação e a recuperação da deformação. Em geral, essa plataforma microfluídica baseada em eletrônica fornece múltiplas propriedades de células viscoelásticas e, portanto, uma imagem mais completa do estado mecânico de uma célula. Como requer preparação mínima da amostra, utiliza uma medição eletrônica direta (em contraste com uma câmera de alta velocidade) e aproveita a fabricação de litografia suave padrão, a implementação dessa plataforma é simples, acessível e adaptável à análise a jusante. A flexibilidade, a utilidade e a sensibilidade dessa plataforma forneceram informações mecânicas exclusivas em uma gama diversificada de células, com o potencial para muitas outras aplicações em ciência básica e diagnóstico clínico.

A plataforma de mecanofenotipagem aqui apresentada é uma abordagem simples e versátil para medir as propriedades biofísicas de células individuais com rendimento moderado. As células são fluídas através do canal microfluídico (Figura 1A) usando fluxo constante impulsionado por pressão. À medida que as células transitam, o comprimento do canal microfluídico e os pulsos de corrente produzidos são registrados usando o hardware de aquisição de dados. O sinal adquirido (<strong cl...

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Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Apresentamos uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica para fenotipagem mecânica de células únicas. Especificamente, medimos propriedades elásticas e viscosas de célula única a uma taxa de transferência de até 10 células por segundo. Nosso método requer uma preparação mínima da amostra, utiliza uma medição eletrônica direta, substituindo hardware óptico caro e análise de imagem complexa, e não é destrutivo, o que significa que nossa abordagem é compatível com análises a jusante.O Mechano-NPS tem sido aplicado a muitos tipos de células, incluindo amostras primárias, e mediu o efeito de componentes subcelulares na viscoelasticidade de célula única. Ele poderia ser usado para entender o comportamento celular, determinar a progressão da doença ou monitorar a resposta a medicamentos. Para começar, remova os componentes tratados com plasma da câmara de plasma.Pipetar uma solução de dois para um de metanol e água deionizada sobre o substrato de vidro com eletrodos pré-fabricados. Em seguida, coloque o molde PDMS com o recurso virado para baixo em cima do substrato de vidro. Coloque o dispositivo sob o estereoscópio para ajustar o alinhamento.Asse o dispositivo alinhado para concluir a fabricação do dispositivo. Prepare a fonte de pressão, a PCB, o hardware de bancada e o software de aquisição de dados. Em seguida, alinhe os pinos do conector do grampo com os orifícios da PCB e alinhe os pinos carregados da mola do grampo com as almofadas de contato do eletrodo no dispositivo microfluídico.Em seguida, insira os pinos do conector das braçadeiras nos orifícios da PCB, certificando-se de que os pinos carregados com a mola permaneçam alinhados com as almofadas de contato do eletrodo. Configure e conecte o hardware eletrônico. Em seguida, defina os valores para inicializar a sessão de aquisição de dados e defina a taxa de amostragem para aquisição.Cultivar e preparar as células de acordo com o protocolo de cultura celular apropriado da linhagem celular de escolha. Em seguida, suspenda as células em uma solução preparada de 2%FBS e 1X PBS a uma concentração entre 100.000 e 500.000 células por mililitro. Mantenha as células no gelo durante a duração dos experimentos.Para carregar as células no dispositivo microfluídico, corte 30 centímetros de tubo de politetrafluoroetileno com uma lâmina de barbear. Use uma seringa para soltar a amostra de célula na extremidade da tubulação e conecte a mesma extremidade à entrada do dispositivo. Finalmente, conecte a extremidade oposta da tubulação ao controlador de pressão microfluídica.Para executar o experimento, defina a pressão de acionamento constante desejada no software controlador de pressão e permita que a amostra encha o dispositivo. Se formarem bolhas nos canais microfluídicos, use o preenchimento sem saída. Ligue a tomada do dispositivo e aplique uma pressão baixa à entrada para forçar a saída de ar através do PDMS permeável ao gás.Em seguida, defina a tensão desejada girando o botão de tensão na fonte de alimentação e ative a tensão pressionando o botão ligado. Ligue o pré-amplificador de corrente e defina a sensibilidade o mais baixa possível. Alternativamente, defina o ganho o mais alto possível sem sobrecarregar o pré-amplificador ou exceder a tensão máxima de entrada analógica do DAQ.Pressione o botão verde Executar no menu da faixa de opções do MATLAB para iniciar o NPS do script de aquisição de dados. m e comece a amostrar e salvar os dados. Para encerrar o experimento, pressione o botão Parar no canto inferior esquerdo da janela de plotagem ao vivo para encerrar o script de aquisição de dados.Em seguida, desative a saída da fonte de alimentação pressionando o botão Ligado. Finalmente, defina a fonte de pressão para pressão zero no software do controlador de pressão. Para a análise de dados, o sinal bruto deve ter uma relação sinal-ruído suficiente para filtrar o ruído e extrair os componentes significativos.Criticamente, o aumento do sinal de corrente de cada nó deve ser robusto o suficiente para que os subpulsos possam ser facilmente identificados a partir do sinal de diferença. As células MCF-7 malignas têm uma distribuição wCDI maior do que as células MCF-10A não malignas, indicando que as células MCF-7 malignas são mais macias do que suas contrapartes MCF-10A não malignas. As células MCF-10A e MCF-7 tratadas com latrunculina mostram um aumento no wCDI.Uma distribuição wCDI distinta diferenciando os dois tipos de células primárias indica que as células LEP são mais macias do que as células MEP. Os MCF-10As não malignos e os MCF-10A e MCF-7 não tratados têm uma proporção maior de células que se recuperam instantaneamente, indicando menor viscosidade do que sua contraparte maligna ou tratada com latrunculina. Se a leitura da corrente ao vivo parecer anormal, pare o experimento e inspecione o canal microfluídico.Certifique-se de que não haja bolhas de ar e nem entupimentos de modo que as células estejam fluindo livremente da entrada para a saída. Como nosso método não prejudica as células, análises a jusante como RNA-seq ou imunofluorescência podem ser realizadas. Isso poderia ajudar a descobrir algumas razões subjacentes pelas quais as células têm fenótipos mecânicos distintos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

Sensor de microagulhas baseado oco para Multiplexed Transdermal Eletroquímica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

A técnica de livre-Label para a imagem espaço-temporal do Secreções única célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...