Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

تم دعم RW من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ، مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية في الصين (7222059). تم دعم ZD.X. من قبل صندوق الابتكار CAMS للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية للدراسة الحالية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية (رقم الموافقة: 2020-k-85). تم تجنيد متطوعين من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية. تم الحصول على عينات الدم الوريدي المحيطي من الأطفال الأصحاء ظاهريا (2 سنة) الذين تلقوا...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

يمثل هذا البروتوكول طريقة كشف مجدية قائمة على قياس التدفق الخلوي لملفات تعريف TPF في PBMCs للأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح JEV SA14-14-2. استخدمت هذه الدراسة PBMCs الدم الوريدي لكل من الأطفال الملقحين وغير الملقحين كمواد بحثية. مع تحفيز PBMCs مع مستضد JEV ، يمكن تمييز تلك TPF sالمضخمة الخاصة بالم?...

فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) هو فيروس مهم ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus ضمن عائلة Flaviviridae1. لطالما واجهت العديد من دول آسيا والمحيط الهادئ تحديات هائلة في مجال الصحة العامة بسبب عبء المرض الهائل الناجم عن التهاب الدماغ الياباني (JE) ، ولكن هذا تحسن بشكل كبير مع زيادة توافر أنواع مختلفة من اللقاحات2. تساهم الاستجابات المناعية الوقائية التكيفية التي تثيرها العدوى الطبيعية أو التطعيم في الوقاية والتنظيم المضاد للفيروسات. تصنف المناعة الخلطية والمناعة الخلوية على أنها مناعة تكيفية ، وكان تحريض الأول يعتبر دائما استراتيجية رئيسية في تصميم اللقاح ، وإن كان ذلك بفهم محدود نسبيا في الماضي3. ومع ذلك ، فإن دور المناعة التائية بوساطة الخلايا التائية في الحد من انتشار الفيروس المصفر وإزالة الفيروسات قد تم التركيز عليه بشكل متزايد ودراسته على نطاق واسع4. علاوة على ذلك ، لا لا غنى عن مناعة الخلايا التائية في الاستجابات المضادة للفيروسات الخاصة ب JEV فحسب ، بل تلعب أيضا دورا بارزا في الحماية المتصالبة من العدوى الثانوية بالفيروسات المصفرة غير المتجانسة ، والتي تم إثباتها في الدراسات السابقة5. من المتوقع أن هذا التأثير قد يتجاوز تأثيرات التعزيز المحتملة بوساطة الأجسام المضادة في العدوى5. تجدر الإشارة إلى أن مناعة الخلايا التائية المتصالبة هذه مهمة ، خاصة في حالة عدم وجود لقاحات وأدوية مضادة للفيروسات ضد الفيروسات المصفرة. على الرغم من إجراء العديد من الدراسات لتحديد مساهمة الخلايا التائية في عدوى JEV فيما يتعلق بالخلايا التائيةCD4 + و CD8 + 6,7 ، إلا أن السلالات المعنية التي تفرز السيتوكينات وتنوعها الوظيفي لا تزال غير محددة ، مما يعني أن توضيح الوظائف الدقيقة للخلايا التائية المساعدة والقاتلة يعوق.
يحدد حجم دفاعاتهم المضادة للفيروسات جودة استجابات الخلايا التائية. تتميز الخلايا التائية CD4 + أو CD8 + التي يمكن أن تمنح وظيفتين أو أكثر ، بما في ذلك إفراز السيتوكين وإزالة التحلل ، بأنها خلايا تائية متعددة الوظائف (TPFs) عند تحفيز محدد على مستوى الخلية الواحدة8. قد يكون للخلايا التائية CD4 + التي تنتج سيتوكينات مفردة أو متعددة تأثيرات مختلفة وذكريات مناعية. على سبيل المثال ، من المرجح أن تشكل الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + استجابة وقائية فعالة طويلة الأجل من الخلايا التائيةIL-2 + CD4 + 9 ، والتي يمكن استخدامها كمعلمة مهمة في تقييم تأثير التطعيم. يزداد تواتر الخلايا التائية IL-2 + IFN-γ + CD4 + في المرضى الذين يعانون من عدم تطور متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) على المدى الطويل ، في حين أن الخلايا التائية CD4 + في المرضى الذين يعانون من تطور الإيدز أكثر ميلا لإنتاج IFN-γ وحدها بسبب التأثير المعزز ل IL-2 على تكاثر الخلايا التائية10. علاوة على ذلك ، تبين أن مجموعة فرعية من IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ تعيش على المدى الطويل في الجسم الحي وتعزز بشكل تآزري وظيفة القتل11. على الرغم من أن الخلايا التائية CD8 + من المرجح أن تظهر نشاطا ساما للخلايا ، إلا أن بعض الخلايا التائية CD4 + مجهزة أيضا بنشاط سام للخلايا كتعبير مكتشف بشكل غير مباشر عن جزيئات CD107a السطحية12. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر مجموعات فرعية معينة من الخلايا التائية عن chemokine MIP-1α ، والذي غالبا ما تفرزه الخلايا الوحيدة للمشاركة في تجنيد العدلات بوساطة الخلايا التائية13. وبالمثل ، يمكن أيضا استخدام CD8 + TPFs لتوصيف تعدد استخدامات العلامات المذكورة أعلاه. أظهرت الدراسات أن استراتيجية التعزيز الأولي يمكن أن تحفز بشكل فعال فترة طويلة من التأثيرات الوقائية TPF 13 ، والتي يمكن أن تعزز الحماية التي يسببها التطعيم. تتمثل إحدى السمات المركزية في فحص الجهاز المناعي في قدرة خلايا الذاكرة التائية على تسهيل استجابات أقوى وأسرع وأكثر فعالية للتحديات الفيروسية الثانوية من الخلايا التائية الساذجة. تعد الخلايا التائية للذاكرة المستجيبة (TEM) وخلايا الذاكرة التائية المركزية (TCM) مجموعات فرعية مهمة من الخلايا التائية التي غالبا ما يتم تمييزها عن طريق التعبير المركب CD27 / CD45RO أو CCR7 / CD45RA14. يميل TCM (CD27 + CD45RO + أو CCR7 + CD45RA-) إلى التوطين في الأنسجة اللمفاوية الثانوية ، بينما TEM (CD27- CD45RO + أو CCR7- CD45RA-) يتمركز في الأنسجة اللمفاوية والمحيطية15,16. يوفر TEM دفاعا فوريا ولكن غير مستدام ، بينما يحافظ TCM على الاستجابة عن طريق التكاثر في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتوليد مستجيبات جديدة17. وبالتالي ، بالنظر إلى أن خلايا الذاكرة يمكن أن تتوسط في استجابات استدعاء محددة وفعالة للفيروسات ، تثار أسئلة حول مساهمة هذه المجموعة الفرعية من الوظائف المتعددة.
مع تطور تقنية قياس التدفق الخلوي ، أصبح من الشائع اكتشاف علامات أكثر من 10 مجموعات وأنماط ظاهرية ومستضدات تمايز في وقت واحد ، وهو أمر مفيد لشرح السمات المناعية الوظيفية على الخلايا التائية الفردية بشكل أكثر وفرة لتقليل سوء التفسير والصعوبات في فهم الأنماط الظاهرية للخلايا التائية. استخدمت هذه الدراسة التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح TPF في خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) داخل الأطفال الذين تم تطعيمهم ب JEV. بتطبيق هذا النهج ، سيتم توسيع فهم مناعة الخلايا التائية قصيرة وطويلة الأجل الخاصة ب JEV وحتى المتصالبة التفاعلية التي يسببها التطعيم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

تلعب المناعة الخلوية التائية دورا مهما في السيطرة على عدوى الفيروس المصفر ، إما بعد التطعيم أو بعد العدوى الطبيعية. يجب تقييم "جودة" الخلية التائية حسب الوظيفة ، وترتبط الوظيفة الأعلى بحماية مناعية أكثر قوة. تسمى الخلايا التائية التي يمكنها إنتاج اثنين أو أكثر من السيتوكينات أو الكيموكينات في وقت واحد على مستوى الخلية الواحدة بالخلايا التائية متعددة الوظائف (T PF s) ، والتي تتوسط الاستجابات المناعية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية للتعبير عن علامات التحلل (CD107a) وإفراز الإنترفيرون (IFN) -γ ، أو عامل نخر الورم (TNF) -α ، أو الإنترلوكين (IL) -2 ، أو بروتين التهاب البلاعم (MIP) -1α. هناك أدلة متزايدة على أن TPFs ترتبط ارتباطا وثيقا بالحفاظ على الذاكرة المناعية طويلة المدى والحماية وأن نسبتها المتزايدة هي علامة مهمة على المناعة الوقائية وهي مهمة في السيطرة الفعالة على العدوى الفيروسية وإعادة التنشيط. لا ينطبق هذا التقييم على استجابات مناعية محددة فحسب ، بل ينطبق أيضا على تقييم الاستجابات المناعية التفاعلية المتقاطعة. هنا ، مع أخذ فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال ، تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFالخاص ب JEV الذي تنتجه خلايا الدم الطرفية أحادية النواة للأطفال الذين تم تطعيمهم ضد التهاب الدماغ الياباني لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.

يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابة المستخدمة لتقسيم TCM أو TEM لخلايا CD8 + أو CD4 + T من مجموعة تحفيز JEV تمثيلية للأطفال الذين تم تطعيمهم ب JE. يستخدم مخطط النقاط FSC-A / SSC-A لتحديد الخلايا الليمفاوية ، ويتم استخدام مخطط النقاط FSC-A / FSC-W لتحديد الخلايا المفردة. يتم اخ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

يجمع البروتوكول الحالي بين التحفيز خارج الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي لتحليل ملامح الخلايا التائية متعددة الوظائف (TPF) في خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) داخل الأطفال الملقحين بفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV). تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFs الخاصة ب JEV لتوفير مرجع لدراسات مماثلة.

الكشف عن الخلايا التائية متعددة الوظائف لدى الأطفال الذين تم تطعيمهم بلقاح التهاب الدماغ الياباني عبر تقنية قياس التدفق الخلوي

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

تم اختبار طريقة الكشف ونظام ألوان قياس التدفق الخلوي ل TPFS الخاص بفيروس التهاب الدماغ الياباني لتوفير مرجع لدراسات مماثلة. سيتم تنفيذ عرض الإجراء من قبل Linlin Zhang و Meng Zhang ، وهما طالبان من مختبرنا. للبدء ، قم بتحفيز PBMCs لمجموعة تحفيز JEV بجزيئات JEV المعطلة المركزة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود أجسام مضادة وحيدة النسيلة ، CD28 و CD49d و CD107a و GolgiPlug و monensin.بعد ذلك ، قم بتحفيز PBMCs للمجموعة الضابطة بدون جزيئات فيروس مركزة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود أجسام مضادة وحيدة النسيلة ، CD28 و CD49d و CD 107a و GolgiPlug و monensin. اجمع تعليق الخلية من كل مجموعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 500 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة الطافي مع ماصة.إعادة تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف صبغة قابلة للتثبيت إلى تعليق الخلية واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. جهاز طرد مركزي عند 500 غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، وإزالة المادة الطافية.بعد إعادة تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من PBS ، مرة أخرى ، يتم تشغيل جهاز طرد مركزي عند 500 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا. لإجراء تلطيخ علامة سطح الخلية ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS ، وأضف ميكرولترين من كل جسم مضاد لعلامة السطح إلى تعليق الخلية في كل أنبوب. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء.جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية كما هو موضح سابقا. مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية بعناية.لإجراء التثبيت وكسر الغشاء ، أعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول تثبيت كسر الغشاء وثبت الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. ثم الطرد المركزي في 500 غرام لمدة خمس دقائق وإزالة طاف. بعد إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS ، يتم الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 غرام في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية ، كما هو موضح سابقا.بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS وأضف ميكرولترين من كل جسم مضاد للسيتوكين إلى معلق الخلية في كل أنبوب لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. مرة أخرى ، جهاز طرد مركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق ، وإزالة المادة الطافية كما هو موضح سابقا.مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية كما هو موضح سابقا. ثم أضف 500 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الخلايا.بعد عزل عينة PBMC وحدها ، كما هو موضح سابقا ، قسم معلق الخلية إلى 12 جزءا متساويا في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر موصوفة في المخطوطة. وبالمثل ، بعد إضافة علامات سطح الخلية والجسم المضاد للسيتوكين داخل الخلايا ، كما هو موضح سابقا ، أضف 500 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الخلايا والدوامة بسرعة منخفضة. باستخدام عينة غير ملوثة ، اضبط التشتت الأمامي والتشتت الجانبي وجهد صبغة الفلورسنت المختلفة ، مع ضبط تعويض قياس التدفق الخلوي للتخلص من إشارات التلوث بين الفلوروفورات المختلفة ، باستخدام عينات تلطيخ واحدة.ارسم بوابة مضلعة من خلال منطقة التشتت الأمامية ، ومخطط نقطي لمنطقة التشتت الجانبية لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة ، مع استبعاد الحطام ، وبوابة مستطيلة عبر منطقة التشتت الأمامية ، ومخطط نقطي عرض التشتت الأمامي لتحديد الخلايا المفردة. بعد ذلك ، ارسم بوابة مستطيلة من خلال مخطط نقطة منطقة التشتت الحية والميتة لتحديد الخلايا الحية ، وبوابة مستطيلة من خلال مخطط نقطة منطقة التشتت الجانبية CD3 لتحديد الخلايا التائية الإيجابية الثلاث للقرص المضغوط. بعد ذلك ، ارسم بوابة رباعية من خلال مخطط CD4 و CD8 النقطي لتحديد الخلايا التائية الموجبة CD4 أو CD8 الموجبة ومن خلال مخطط CD45RO و CD27 النقطي لتقسيم الخلايا التائية الموجبة CD4 أو CD8 الموجبة إلى TCM و TEM.بعد رسم بوابات CD107a ، إنترفيرون جاما ، عامل نخر الورم ألفا ، إنترلوكين 2 وبروتين التهاب ميكروفاج واحد ألفا من TCM أو TEM للخلايا التائية الإيجابية CD8 أو CD4 الإيجابية لتحديد تواتر أنماط الاستجابة المختلفة على التوالي. قم بتحميل العينات على القياس الخلوي بالتتابع. تم استخدام استراتيجية البوابة لتحديد TCM أو TEM للخلايا التائية الموجبة CD8 أو CD4 الإيجابية ومجموعاتها الفرعية باستخدام عرض منطقة التشتت الأمامي ، ثم مخطط نقطة منطقة التشتت الجانبية.أشار التوصيف الوظيفي المتعدد لاستجابات الخلايا التائية الإيجابية CD4 و CD8 الإيجابية ل JEV إلى أنه تم اكتشاف مستويات متزايدة من CD107a وإنترفيرون جاما وعامل نخر الورم ألفا وإنترلوكين 2 في خلايا الطب الصيني التقليدي الإيجابية CD8 للأطفال الذين تم تطعيمهم بعد تحفيز JEV مقارنة بتلك الموجودة في الأطفال غير الملقحين. ومع ذلك ، فإن مستوى البروتين الالتهابي البلاعم واحد ألفا لم يختلف بين المجموعتين. تم الكشف عن مستويات أعلى من CD107a وإنترفيرون جاما في خلايا TEM الإيجابية CD8 للمجموعة الملقحة تحت تحفيز JEV مقارنة بالمجموعة غير الملقحة.في حين أن عامل نخر الورم ألفا ، إنترلوكين 2 وبروتين التهاب البلاعم واحد ألفا ، لم تكن مرتفعة بشكل ملحوظ في تلك الخلايا الإيجابية. نجح مستضد JEV في إحداث مستويات أعلى من CD107a ، وجاما الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم ألفا ، وبروتين التهاب البلاعم واحد ألفا في خلايا الطب الصيني التقليدي الإيجابية CD4 للمجموعة الملقحة مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. ومع ذلك ، فإن نسبة الخلايا الإيجابية إنترلوكين 2 لم تختلف بين المجموعتين تحت تحفيز JEV.كانت نسبة مجموعات فرعية إيجابية CD107a وإيجابية غاما إنترفيرون وعامل نخر الورم ألفا الإيجابي وخلايا TEM الإيجابية CD4 الفرعية في المجموعة الملقحة أعلى في وجود JEV ، مقارنة بالمجموعة غير الملقحة. تعد مناعة الخلايا التائية للمنبهات واستراتيجيات مطابقة الألوان المتوافقة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...