Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. blev støttet af CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Etisk godkendelse af denne undersøgelse blev opnået af den etiske komité for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: 2020-k-85). Frivillige blev rekrutteret fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver blev taget fra tilsyneladende raske børn (2 år), der tidligere havde modtaget en prime og boostet vaccination med levende svækket JE SA14-14-2-vaccine i mindre end et halvt år (JE-vaccinerede børn, n = 5) og uvaccinerede børn (6 mån...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Denne protokol repræsenterer en gennemførlig flowcytometribaseret detektionsmetode for TPF-profiler i PBMC'erne hos børn, der er vaccineret med JEV-vaccinen SA14-14-2. Denne undersøgelse brugte venøst blod PBMC'er fra både vaccinerede og uvaccinerede børn som forskningsmaterialer. Med stimulering af PBMC'er med JEV-antigenet kan de forstærkede antigenspecifikke TPF'erkarakteriseres ved flerfarvet flowcytometriantistoffarvning. Sammenlignet med den konventionelle enzymbundne immunospot-assaym...

Japansk encephalitisvirus (JEV) er en vigtig myggebåren virus, der tilhører slægten Flavivirus inden for Flaviviridae-familien 1. Mange lande i Asien og Stillehavsområdet har længe stået over for enorme folkesundhedsudfordringer på grund af den enorme sygdomsbyrde forårsaget af japansk encephalitis (JE), men dette er forbedret dramatisk med den stigende tilgængelighed af forskellige typer vaccinationer2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkaldt af naturlig infektion eller vaccination bidrager til forebyggelse og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemedieret immunitet klassificeres som adaptiv immunitet, og induktion af førstnævnte har altid været betragtet som en nøglestrategi inden for vaccinedesign, omend med relativt begrænset forståelse i de sidste3. T-cellemedieret immunitets rolle med hensyn til at begrænse flavivirusspredning og virusclearance er imidlertid i stigende grad blevet fokuseret på og grundigt undersøgt4. Desuden er T-celleimmunitet ikke kun uundværlig i JEV-specifikke antivirale reaktioner, men spiller også en fremtrædende rolle i krydsbeskyttelse mod sekundær infektion med heterologe flavivirus, hvilket er blevet påvist i tidligere undersøgelser5. Det spekuleres i, at denne effekt kan omgå potentielle antistofmedierede forbedringseffekter i infektion5. Bemærk, at en sådan krydsreaktiv T-celleimmunitet er vigtig, især i mangel af vacciner og antivirale lægemidler mod flavivirus. Selvom mange undersøgelser er blevet udført for at bestemme T-cellernes bidrag i JEV-infektion med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forbliver de respektive afstamninger, der udskiller cytokiner og deres funktionelle diversificering, ubestemte, hvilket betyder, at belysningen af de nøjagtige funktioner af hjælper- og dræber-T-celler hindres.
Omfanget af deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten af T-celleresponser. CD4 + eller CD8 + T-celler, der kompatibelt kan give to eller flere funktioner, herunder cytokinsekretion og degranulering, karakteriseres som polyfunktionelle T-celler (TPF'er) ved specifik stimulering på enkeltcelleniveau8. CD4 + T-celler, der producerer enkelte eller flere cytokiner, kan have forskellige virkninger og immunhukommelser. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mere tilbøjelige til at danne et langsigtet effektivt beskyttelsesrespons end IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan bruges som en vigtig parameter til evaluering af vaccinationseffekten. Hyppigheden af IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler øges hos patienter med langvarig ikke-progression af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos patienter med AIDS-progression er mere tilbøjelige til at producere IFN-γ alene på grund af den fremmende virkning af IL-2 på T-celleproliferation10. Desuden viste det sig, at en delmængde af IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ overlevede langsigtet in vivo og synergistisk fremmede drabsfunktionen11. Selvom CD8 + T-celler er mere tilbøjelige til at udvise cytotoksisk aktivitet, er nogle CD4 + T-celler også udstyret med cytotoksisk aktivitet som et indirekte detekteret udtryk for overflade CD107a molekyler12. Derudover udtrykker visse T-celleundergrupper kemokin-MIP-1α, som ofte udskilles af monocytter for at deltage i T-cellemedieret neutrofil rekruttering13. På samme måde kan CD8+ TPFs også bruges til at karakterisere alsidigheden af ovenstående markører. Undersøgelser har vist, at prime-boost-strategien effektivt kan fremkalde en længere periode med TPF-beskyttende virkninger13, hvilket kan forbedre beskyttelsen fremkaldt af vaccination. Et centralt træk ved at undersøge immunsystemet er hukommelses-T-cellernes evne til at lette stærkere, hurtigere og mere effektive reaktioner på sekundære virale udfordringer end naive T-celler. Effektorhukommelses-T-celler (TEM) og centrale hukommelses-T-celler (TCM) er vigtige T-celleundergrupper, der ofte differentieres ved den sammensatte ekspression af CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har tendens til at lokalisere i sekundært lymfoidt væv, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA-) lokaliserer i lymfoid og perifert væv 15,16. TEM giver øjeblikkeligt, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opretholder responsen ved at proliferere i de sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. I betragtning af at hukommelsesceller kan formidle specifikke og effektive tilbagekaldelsesresponser på vira, opstår der spørgsmål om bidraget fra denne delmængde af polyfunktioner.
Med udviklingen af flowcytometriteknologi er det blevet almindeligt samtidig at detektere markører for mere end 10 klynger, fænotyper og differentieringsantigener, hvilket er gavnligt for mere rigeligt at kommentere de funktionelle immunologiske træk på individuelle T-celler for at reducere fejlfortolkning og vanskeligheder med at forstå T-cellefænotyper. Denne undersøgelse brugte ex vivo-stimulering og flowcytometri til at analysere TPF-profiler i mononukleære celler (PBMC'er i perifert blod) hos JEV-vaccinerede børn. Ved anvendelse af denne tilgang vil forståelsen af kort- og langsigtet JEV-specifik og endda krydsreaktiv T-celleimmunitet induceret af vaccination blive udvidet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T-cellemedieret immunitet spiller en vigtig rolle i bekæmpelsen af flavivirusinfektion, enten efter vaccination eller efter naturlig infektion. "Kvaliteten" af en T-celle skal vurderes efter funktion, og højere funktion er forbundet med mere kraftfuld immunbeskyttelse. T-celler, der samtidig kan producere to eller flere cytokiner eller kemokiner på enkeltcelleniveau, kaldes polyfunktionelle T-celler (TPF'er), som medierer immunresponser gennem en række molekylære mekanismer til at udtrykke degranulationsmarkører (CD107a) og udskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2 eller makrofaginflammatorisk protein (MIP)-1α. Der er stigende tegn på, at TPFer tæt forbundet med opretholdelsen af langvarig immunhukommelse og beskyttelse, og at deres øgede andel er en vigtig markør for beskyttende immunitet og er vigtig for effektiv kontrol af virusinfektion og reaktivering. Denne evaluering gælder ikke kun for specifikke immunresponser, men også for vurderingen af krydsreaktive immunresponser. Her, idet man tog den japanske encephalitisvirus (JEV) som et eksempel, blev detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF'erproduceret af mononukleære celler i perifert blod af børn vaccineret mod japansk encephalitis testet for at give en reference til lignende undersøgelser.

Figur 1 viser den gating-strategi, der bruges til at opdele TCM- eller TEM for CD8+ eller CD4+ T-celler fra en repræsentativ JEV-stimuleringsgruppe af JE-vaccinerede børn. FSC-A/SSC-A dot-plottet bruges til at identificere lymfocytter, og FSC-A/FSC-W dot plottet bruges til at identificere enkeltceller. Levedygtige celler vælges på levende / død / SSC-A prikplot. CD3/SSC-A-punktplottet bruges til at identificere CD3+ T-cellerne. Plot...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Den nuværende protokol kombinerer ex vivo-stimulering og flowcytometri til analyse af polyfunktionelle T-celleprofiler (TPF) i mononukleære celler (PBMC'er) i perifert blod mononukleære celler (PBMC'er) hos japanske encephalitisvirus (JEV)-vaccinerede børn. Detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF'er blev testet for at give en reference til lignende undersøgelser.

Påvisning af polyfunktionelle T-celler hos børn vaccineret med japansk encephalitisvaccine via flowcytometriteknikken

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

Detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for japansk encephalitisvirusspecifik TPFS blev testet for at give en reference til lignende undersøgelser. Demonstration af proceduren vil blive udført af Linlin Zhang og Meng Zhang, to studerende fra vores laboratorium. Til at begynde med stimuleres PBMC'erne i JEV-stimuleringsgruppen med koncentrerede inaktiverede JEV-partikler i 16 timer ved 37 grader Celsius i nærværelse af monoklonale antistoffer, CD28 og CD49d, CD107a, GolgiPlug og monensin.Derefter stimuleres PBMC'erne i kontrolgruppen uden koncentrerede viruspartikler i 16 timer ved 37 grader Celsius i nærværelse af monoklonale antistoffer, CD28 og CD49d, CD 107a, GolgiPlug og monensin. Cellesuspensionen opsamles fra hver gruppe i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 500 g i fem minutter ved stuetemperatur, og fjern supernatanten med en pipette.Resuspend cellerne i 1 milliliter PBS. Tilsæt fikserbart levedygtighedsfarvestof til cellesuspensionen og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Centrifuge ved 500 g ved stuetemperatur i fem minutter, og fjern supernatanten.Efter at have resueret cellerne i 1 milliliter PBS, centrifuge igen ved 500 g ved stuetemperatur i fem minutter og kassér supernatanten som vist tidligere. For at udføre celleoverflademarkørfarvning skal du resuspendere cellerne i 100 mikroliter PBS og tilføje to mikroliter af hvert overflademarkørantistof til cellesuspensionen i hvert rør. Inkuber rørene i 30 minutter ved stuetemperatur, mens de beskyttes mod lys.Centrifuge ved 500 g i fem minutter og fjern supernatanten som vist tidligere. Igen resuspend cellerne i en milliliter PBS. Centrifuge ved 500 g i fem minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten forsigtigt.For at udføre fiksering og membranbrydning skal cellerne resuspenderes med 500 mikroliter membranbrydende fikseringsopløsning og fastgøres cellerne i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur. Centrifuger derefter ved 500 g i fem minutter og fjern supernatanten. Efter at have genbrugt cellerne i en milliliter PBS, centrifuge i fem minutter ved 500 g ved stuetemperatur og fjern supernatanten omhyggeligt, som vist tidligere.Derefter resuspenderes cellerne i 100 mikroliter PBS og tilsættes to mikroliter af hvert cytokinantistof til cellesuspensionen i hvert rør til intracellulær cytokinfarvning. Inkuber rørene i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Igen centrifugeres ved 500 g i fem minutter, og supernatanten fjernes som tidligere vist.Endnu en gang skal cellerne suspenderes i en milliliter PBS. Centrifuge ved 500 g i fem minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten forsigtigt som tidligere demonstreret. Tilsæt derefter 500 mikroliter PBS for at suspendere cellerne igen.Efter isolering af PBMC-prøven alene, som tidligere demonstreret, opdeles cellesuspensionen i 12 lige store dele i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør beskrevet i manuskriptet. På samme måde tilsættes 500 mikroliter PBS efter tilsætning af celleoverflademarkører og intracellulært cytokinantistof, som tidligere demonstreret, for at resuspendere cellerne og hvirvelstrømmen med lav hastighed. Ved hjælp af en ufarvet prøve justeres den fremadgående spredning, sidespredning og forskellige fluorescerende farvespændinger, mens flowcytometrikompensationen justeres for at eliminere forureningssignalerne mellem de forskellige fluorophorer ved hjælp af enkeltfarvningsprøverne.Tegn en polygonport gennem det forreste spredningsområde, sidespredningsområdets prikplot for at vælge den intakte lymfocytpopulation, mens snavs udelukkes, og en rektangulær port gennem det forreste spredningsområde, fremad spredningsbredde prikplot for at vælge de enkelte celler. Tegn derefter en rektangulær port gennem det levende, døde sidespredningsområdepunktplot for at vælge de levende celler og en rektangulær port gennem CD3-sidespredningsområdets prikplot for at identificere CD'ens tre positive T-celler. Tegn derefter en quad-gate gennem CD4, CD8-prikplottet for at identificere CD4-positive eller CD8-positive T-celler og gennem CD45RO, CD27-prikplot for at opdele CD4-positive eller CD8-positive T-celler i TCM og TEM.Efter tegning af portene til CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa, interleukin 2 og mikrofag inflammatorisk protein en alfa fra TCM eller TEM af CD8-positive eller CD4-positive T-celler for at bestemme hyppigheden af forskellige responsmønstre henholdsvis. Læg prøverne på cytometrien sekventielt. Gating-strategien blev anvendt til at identificere TCM eller TEM af CD8-positive eller CD4-positive T-celler og deres delmængder ved hjælp af den fremadrettede spredningsområdebredde og derefter sidespredningsområdets prikplot.Den polyfunktionelle karakterisering af CD4-positive og CD8-positive T-celleresponser på JEV indikerede, at øgede niveauer af CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa og interleukin 2 blev påvist i de CD8-positive TCM-celler hos de vaccinerede børn efter JEV-stimulering sammenlignet med dem hos uvaccinerede børn. Niveauet af makrofag inflammatorisk protein en alfa var imidlertid ikke forskelligt mellem de to grupper. Højere niveauer af CD107a og interferon gamma blev påvist i de CD8-positive TEM-celler i den vaccinerede gruppe under JEV-stimulering sammenlignet med den uvaccinerede gruppe.Mens tumornekrosefaktor alfa, interleukin 2 og makrofaginflammatorisk protein en alfa, ikke var signifikant forhøjet i disse positive celler. JEV-antigenet inducerede med succes højere niveauer af CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa og makrofag inflammatorisk protein en alfa i de CD4-positive TCM-celler i den vaccinerede gruppe sammenlignet med den uvaccinerede gruppe. Andelen af interleukin 2 positive celler var imidlertid ikke forskellig mellem de to grupper under JEV-stimulering.Andelen af CD107a-positive, interferon gamma-positive og tumornekrosefaktor alfa-positive delmængder, sub-CD4-positive TEM-celler i den vaccinerede gruppe var højere i nærværelse af JEV end i den uvaccinerede gruppe. T-celleimmunogeniciteten af stimuli og de kompatible farvematchningsstrategier er kritiske trin i denne protokol.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserede Flowcytometri Assay til måling cytotoksisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering af musenyrnyre resident CD8+ T-celler til flowcytometrianalyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...