Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), beijing natural science foundation of China (7222059). ZD.X. werd ondersteund door het CAMS Innovatiefonds voor Medische Wetenschappen (2019-I2M-5-026).

Ethische goedkeuring voor de huidige studie werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: 2020-k-85). Vrijwilligers werden gerekruteerd van Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere veneuze bloedmonsters werden verkregen van ogenschijnlijk gezonde kinderen (2 jaar oud) die eerder een prime en verhoogde vaccinatie hadden gekregen met levend verzwakt JE SA14-14-2-vaccin gedurende minder dan een half jaar (JE-gevaccineer...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Dit protocol vertegenwoordigt een haalbare op flowcytometrie gebaseerde detectiemethode voor TPF-profielen in de PBMC's van kinderen die zijn gevaccineerd met het JEV-vaccin SA14-14-2. Deze studie gebruikte de veneuze bloed PBMC's van zowel gevaccineerde als niet-gevaccineerde kinderen als onderzoeksmateriaal. Met de stimulatie van PBMC's met het JEV-antigeen kunnen die versterkte antigeenspecifieke TPF'sworden gekenmerkt door multicolor flowcytometrie-antilichaamkleuring. In vergelijking met de con...

Japans encefalitisvirus (JEV) is een belangrijk door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus binnen de Flaviviridae-familie1. Veel landen in Azië en de Stille Oceaan worden al lang geconfronteerd met enorme uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid als gevolg van de enorme ziektelast veroorzaakt door Japanse encefalitis (JE), maar dit is dramatisch verbeterd met de toenemende beschikbaarheid van verschillende soorten vaccinaties2. Adaptieve beschermende immuunresponsen die worden opgeroepen door natuurlijke infectie of vaccinatie dragen bij aan de preventie en antivirale regulatie. Humorale immuniteit en celgemedieerde immuniteit worden geclassificeerd als adaptieve immuniteit, en de inductie van de eerste is altijd beschouwd als een belangrijke strategie bij het ontwerpen van vaccins, zij het met relatief beperkt begrip in het verleden3. De rol van T-cel-gemedieerde immuniteit bij het beperken van flavivirusverspreiding en virusklaring is echter steeds meer gericht op en uitgebreid bestudeerd4. Bovendien is T-celimmuniteit niet alleen onmisbaar bij JEV-specifieke antivirale reacties, maar speelt het ook een prominente rol bij kruisbescherming tegen secundaire infectie met heterologe flavivirussen, wat in eerdere studies is aangetoond5. Er wordt gespeculeerd dat dit effect potentiële antilichaam-gemedieerde versterkingseffecten bij infectie5 kan omzeilen. Van belang is dat een dergelijke kruisreactieve T-celimmuniteit belangrijk is, vooral bij afwezigheid van vaccins en antivirale geneesmiddelen tegen flavivirussen. Hoewel er veel studies zijn uitgevoerd om de bijdrage van T-cellen aan JEV-infectie te bepalen met betrekking tot CD4+ en CD8+ T-cellen 6,7, blijven de respectieve afstammingslijnen die cytokines afscheiden en hun functionele diversificatie onbepaald, wat betekent dat de opheldering van de exacte functies van helper- en killer T-cellen wordt belemmerd.
De schaal van hun antivirale afweer bepaalt de kwaliteit van T-celresponsen. CD4+ of CD8+ T-cellen die compatibel twee of meer functies kunnen verlenen, waaronder cytokinesecretie en degranulatie, worden gekarakteriseerd als polyfunctionele T-cellen (TPFs) bij specifieke stimulatie op eencellig niveau8. CD4 + T-cellen die enkele of meerdere cytokines produceren, kunnen verschillende effecten en immuungeheugens hebben. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen hebben bijvoorbeeld meer kans om een effectieve beschermende respons op lange termijn te vormen dan IL-2+ CD4+ T-cellen9, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke parameter bij het evalueren van het vaccinatie-effect. De frequentie van IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen is verhoogd bij patiënten met langdurige niet-progressie van verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS), terwijl CD4+ T-cellen bij patiënten met AIDS-progressie meer geneigd zijn om alleen IFN-γ te produceren vanwege het bevorderende effect van IL-2 op T-celproliferatie10. Bovendien bleek een subset van IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langdurig in vivo te overleven en synergetisch de dodingsfunctiete bevorderen 11. Hoewel CD8+ T-cellen meer kans hebben om cytotoxische activiteit te vertonen, zijn sommige CD4+ T-cellen ook uitgerust met cytotoxische activiteit als een indirect gedetecteerde expressie van oppervlakte-CD107a-moleculen12. Bovendien drukken bepaalde T-celsubsets de chemokine MIP-1α uit, die vaak wordt uitgescheiden door monocyten om deel te nemen aan T-cel-gemedieerde neutrofiele rekrutering13. Op dezelfde manier kunnen CD8 + TPF'sook worden gebruikt om de veelzijdigheid van de bovenstaande markers te karakteriseren. Studies hebben aangetoond dat de prime-boost-strategie effectief een langdurige periode van TPF-beschermende effecten kan induceren13, wat de bescherming die door vaccinatie wordt opgewekt, kan verbeteren. Een centraal kenmerk bij het onderzoeken van het immuunsysteem is het vermogen van geheugen-T-cellen om sterkere, snellere en effectievere reacties op secundaire virale uitdagingen mogelijk te maken dan naïeve T-cellen. Effectorgeheugen T-cellen (TEM) en T-cellen met centraal geheugen (TCM) zijn belangrijke T-celsubsets die vaak worden gedifferentieerd door de samengestelde expressie van CD27/CD45RO of CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ of CCR7+ CD45RA-) heeft de neiging om te lokaliseren in secundaire lymfoïde weefsels, terwijl TEM (CD27- CD45RO+ of CCR7- CD45RA-) lokaliseert in lymfoïde en perifere weefsels15,16. TEM biedt onmiddellijke maar niet aanhoudende verdediging, terwijl TCM de respons ondersteunt door zich te vermenigvuldigen in de secundaire lymfoïde organen en nieuwe effectoren te genereren17. Aangezien geheugencellen specifieke en efficiënte terugroepreacties op virussen kunnen bemiddelen, rijzen er dus vragen over de bijdrage van deze subset van polyfuncties.
Met de ontwikkeling van flowcytometrietechnologie is het gebruikelijk geworden om tegelijkertijd markers van meer dan 10 clusters, fenotypen en differentiatieantigenen te detecteren, wat gunstig is om de functionele immunologische kenmerken op individuele T-cellen overvloediger te annoteren om misinterpretatie en moeilijkheden bij het begrijpen van T-celfenotypen te verminderen. Deze studie gebruikte ex vivo stimulatie en flowcytometrie om TPF-profielen in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) bij JEV-gevaccineerde kinderen te analyseren. Door deze aanpak toe te passen, zal het begrip van korte- en langetermijn JEV-specifieke en zelfs cross-reactieve T-celimmuniteit geïnduceerd door vaccinatie worden uitgebreid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een belangrijke rol bij het beheersen van flavivirusinfectie, hetzij na vaccinatie of na natuurlijke infectie. De "kwaliteit" van een T-cel moet worden beoordeeld op functie en een hogere functie wordt geassocieerd met een krachtigere immuunbescherming. T-cellen die tegelijkertijd twee of meer cytokines of chemokines op eencellig niveau kunnen produceren, worden polyfunctionele T-cellen (TPFs) genoemd, die immuunresponsen bemiddelen via een verscheidenheid aan moleculaire mechanismen om degranulatiemarkers (CD107a) tot expressie te brengen en interferon (IFN) -γ, tumornecrosefactor (TNF) -α, interleukine (IL) -2 of macrofaag ontstekingseiwit (MIP) -1α uit te scheiden. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat TPF'snauw samenhangen met het behoud van het langetermijnimmuungeheugen en de bescherming en dat hun verhoogde aandeel een belangrijke marker is van beschermende immuniteit en belangrijk is voor de effectieve bestrijding van virale infecties en reactivering. Deze evaluatie is niet alleen van toepassing op specifieke immuunresponsen, maar ook op de beoordeling van kruisreactieve immuunresponsen. Hier, met het Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, werden de detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF'sgeproduceerd door perifere mononucleaire bloedcellen van kinderen die waren gevaccineerd tegen Japanse encefalitis getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.

Figuur 1 toont de gatingstrategie die wordt gebruikt om de TCM of TEM van CD8+ of CD4+ T-cellen te verdelen uit een representatieve JEV-stimulatiegroep van JE-gevaccineerde kinderen. De FSC-A/SSC-A dot plot wordt gebruikt om lymfocyten te identificeren, en de FSC-A/FSC-W dot plot wordt gebruikt om afzonderlijke cellen te identificeren. Levensvatbare cellen worden geselecteerd op de live/dead/SSC-A dot plot. De CD3/SSC-A dot plot wordt gebruikt om d...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Het huidige protocol combineert ex vivo stimulatie en flowcytometrie om polyfunctionele T-cel (TPF) profielen te analyseren in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) binnen Japanse encefalitisvirus (JEV) -gevaccineerde kinderen. De detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF's werden getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.

Detectie van polyfunctionele T-cellen bij kinderen die zijn gevaccineerd met japans encefalitisvaccin via de flowcytometrietechniek

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

De detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van japanse encefalitis virusspecifieke TPFS werden getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies. Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Linlin Zhang en Meng Zhang, twee studenten van ons laboratorium. Stimuleer om te beginnen de PBMC's van de JEV-stimulatiegroep met geconcentreerde geïnactiveerde JEV-deeltjes gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van monoklonale antilichamen, CD28 en CD49d, CD107a, GolgiPlug en monensin.Stimuleer vervolgens de PBMC's van de controlegroep zonder geconcentreerde virusdeeltjes gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van monoklonale antilichamen, CD28 en CD49d, CD 107a, GolgiPlug en monensin. Verzamel de celsuspensie van elke groep in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer bij 500 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met een pipet.Resuspendeer de cellen in 1 milliliter PBS. Voeg fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 g bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.Na het resuspenderen van de cellen in 1 milliliter PBS, centrifugeer opnieuw bij 500 g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en gooi het supernatant weg zoals eerder aangetoond. Om kleuring van het celoppervlak te voeren, resuspendeert u de cellen in 100 microliter PBS en voegt u twee microliter van elk oppervlaktemarkerantilichaam toe aan de celsuspensie in elke buis. Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl u ze beschermt tegen licht.Centrifugeer gedurende vijf minuten op 500 g en verwijder het supernatant zoals eerder gedemonstreerd. Nogmaals, resuspendeer de cellen in één milliliter PBS. Centrifugeer op 500 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg.Om fixatie en membraanbreuk uit te voeren, resuspenseert u de cellen met 500 microliter membraanbrekende fixatieve oplossing en fixeert u de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten op 500 g en verwijder het supernatant. Na resuspendatie van de cellen in één milliliter PBS, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 g bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant voorzichtig, zoals eerder aangetoond.Resuspendeer vervolgens de cellen in 100 microliter PBS en voeg twee microliter van elk cytokine-antilichaam toe aan de celsuspensie in elke buis voor intracellulaire cytokinekleuring. Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Nogmaals, centrifugeer op 500 g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant zoals eerder gedemonstreerd.Nogmaals, resuspensie de cellen in één milliliter PBS. Centrifugeer bij 500 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant voorzichtig zoals eerder gedemonstreerd. Voeg vervolgens 500 microliter PBS toe om de cellen te resuspenderen.Na het isoleren van het PBMC-monster alleen, zoals eerder aangetoond, verdeelt u de celsuspensie in 12 gelijke delen in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter die in het manuscript worden beschreven. Evenzo, na het toevoegen van de celoppervlakmarkers en intracellulair cytokine-antilichaam, zoals eerder aangetoond, voegt u 500 microliter PBS toe om de cellen en vortex met lage snelheid te resuspenderen. Pas met behulp van een niet-gekleurd monster de voorwaartse verstrooiing, zijverstrooiing en verschillende fluorescerende kleurstofspanningen aan, terwijl u de flowcytometriecompensatie aanpast om de verontreinigingssignalen tussen de verschillende fluoroforen te elimineren, met behulp van de afzonderlijke kleuringsmonsters.Teken een polygoonpoort door het voorwaartse spreidingsgebied, zijverstrooiingsgebied dot plot om de intacte lymfocytenpopulatie te selecteren, terwijl het puin wordt uitgesloten, en een rechthoekige poort door het voorwaartse spreidingsgebied, voorwaartse spreidingsbreedte stippen om de afzonderlijke cellen te selecteren. Teken vervolgens een rechthoekige poort door de dot plot van het live, dode zijverstrooiingsgebied om de levende cellen te selecteren, en een rechthoekige poort door de CD3-zijverstrooiingsgebied dot plot om de CD drie positieve T-cellen te identificeren. Teken vervolgens een quad gate door de CD4, CD8 dot plot om de CD4 positieve of CD8 positieve T-cellen te identificeren en door de CD45RO, CD27 dot plot om de CD4 positieve of CD8 positieve T-cellen onder te verdelen in TCM en TEM.Na het tekenen van de poorten van CD107a, interferon gamma, tumornecrosefactor alfa, interleukine 2 en microfaag ontstekingseiwit één alfa uit de TCM of TEM van de CD8 positieve of CD4 positieve T-cellen om respectievelijk de frequentie van verschillende responspatronen te bepalen. Laad de monsters sequentieel op de cytometrie. De gatingstrategie werd gebruikt om de TCM of TEM van CD8-positieve of CD4-positieve T-cellen en hun subsets te identificeren met behulp van de breedte van het voorwaartse spreidingsgebied en vervolgens de dot plot van het zijverstrooiingsgebied.De polyfunctionele karakterisering van CD4-positieve en CD8-positieve T-celresponsen op JEV gaf aan dat verhoogde niveaus van CD107a, interferon gamma, tumornecrosefactor alfa en interleukine 2 werden gedetecteerd in de CD8-positieve TCM-cellen van de gevaccineerde kinderen na JEV-stimulatie in vergelijking met die bij niet-gevaccineerde kinderen. Het niveau van macrofaag ontstekingseiwit één alfa verschilde echter niet tussen de twee groepen. Hogere niveaus van CD107a en interferon gamma werden gedetecteerd in de CD8-positieve TEM-cellen van de gevaccineerde groep onder JEV-stimulatie in vergelijking met de niet-gevaccineerde groep.Terwijl tumornecrosefactor alfa, interleukine 2 en macrofaag ontstekingseiwit één alfa, niet significant verhoogd waren in die positieve cellen. Het JEV-antigeen induceerde met succes hogere niveaus van CD107a, interferon gamma, tumornecrosefactor alfa en macrofaag ontstekingseiwit één alfa in de CD4-positieve TCM-cellen van de gevaccineerde groep in vergelijking met de niet-gevaccineerde groep. Het aandeel interleukine 2 positieve cellen verschilde echter niet tussen de twee groepen onder JEV-stimulatie.Het aandeel cd107a-positieve, interferon gammapositieve en tumornecrosefactor alfapositieve subgroepen, sub-CD4-positieve TEM-cellen in de gevaccineerde groep was hoger in aanwezigheid van JEV dan in de niet-gevaccineerde groep. De T-cel immunogeniciteit van de stimuli en de compatibele kleurmatchingstrategieën zijn cruciale stappen in dit protocol.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...