Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82002130), la Fondation des sciences naturelles de Beijing de Chine (7222059). ZD.X. a été soutenu par le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (2019-I2M-5-026).

L’approbation éthique de la présente étude a été obtenue par le Comité d’éthique de l’Hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (numéro d’approbation : 2020-k-85). Des volontaires ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Beijing et à l’Université médicale de la capitale. Des échantillons de sang veineux périphérique ont été prélevés chez des enfants apparemment en bonne santé (2 ans) qui avaient déjà reçu une vaccination prime et une vaccination renforcée ave...

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	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Ce protocole représente une méthode de détection réalisable basée sur la cytométrie en flux pour les profils TPF dans les PBMC des enfants vaccinés avec le vaccin JEV SA14-14-2. Cette étude a utilisé les PBMC sanguins veineux d’enfants vaccinés et non vaccinés comme matériel de recherche. Avec la stimulation des PBMC avec l’antigène JEV, ces TPFamplifiés spécifiques de l’antigène peuvent être caractérisés par une coloration multicolore des anticorps de cytométrie en flux. P...

Le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) est un important virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus de la familledes Flaviviridae 1. De nombreux pays d’Asie-Pacifique sont depuis longtemps confrontés à d’énormes défis de santé publique en raison de l’énorme charge de morbidité causée par l’encéphalite japonaise (EJ), mais cela s’est considérablement amélioré avec la disponibilité croissante de divers types de vaccins2. Les réponses immunitaires protectrices adaptatives évoquées par l’infection naturelle ou la vaccination contribuent à la prévention et à la régulation antivirale. L’immunité humorale et l’immunité à médiation cellulaire sont classées comme immunité adaptative, et l’induction de la première a toujours été considérée comme une stratégie clé dans la conception de vaccins, bien qu’avec une compréhension relativement limitée au cours des3 dernières années. Cependant, le rôle de l’immunité médiée par les lymphocytes T dans la limitation de la dissémination des flavivirus et de l’élimination du virus a été de plus en plus ciblé et étudié de manière approfondie4. De plus, l’immunité des lymphocytes T est non seulement indispensable dans les réponses antivirales spécifiques du JEV, mais joue également un rôle de premier plan dans la protection croisée contre l’infection secondaire par des flavivirus hétérologues, ce qui a été démontré dans des études antérieures5. On suppose que cet effet peut contourner les effets potentiels d’amélioration médiés par les anticorps dans l’infection5. Il convient de noter qu’une telle immunité croisée des lymphocytes T est importante, en particulier en l’absence de vaccins et de médicaments antiviraux contre les flavivirus. Bien que de nombreuses études aient été réalisées pour déterminer la contribution des lymphocytes T dans l’infection par le JEV par rapport aux lymphocytes T CD4+ et CD8+ 6,7, les lignées respectives sécrétant des cytokines et leur diversification fonctionnelle restent indéterminées, ce qui signifie que l’élucidation des fonctions exactes des lymphocytes T auxiliaires et tueurs est entravée.
L’échelle de leurs défenses antivirales détermine la qualité des réponses des lymphocytes T. Les lymphocytes T CD4+ ou CD8+ qui peuvent conférer de façon compatible deux fonctions ou plus, y compris la sécrétion et la dégranulation de cytokines, sont caractérisés comme des lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) lors d’une stimulation spécifique au niveau unicellulaire8. Les lymphocytes T CD4+ qui produisent une ou plusieurs cytokines peuvent avoir divers effets et mémoires immunitaires. Par exemple, les lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ sont plus susceptibles de former une réponse protectrice efficace à long terme que les lymphocytes T CD4+ IL-2+ 9, qui peuvent être utilisés comme paramètre important dans l’évaluation de l’effet vaccinal. La fréquence des lymphocytes T CD4+ IL-2+ IFN-γ+ est augmentée chez les patients présentant une non-progression à long terme du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), tandis que les lymphocytes T CD4+ chez les patients atteints de progression du sida sont plus enclins à produire de l’IFN-γ seul en raison de l’effet favorisant l’IL-2 sur la prolifération des lymphocytes T10. En outre, il a été démontré qu’un sous-ensemble d’IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ survivait à long terme in vivo et favorisait de manière synergique la fonction de destruction11. Bien que les lymphocytes T CD8+ soient plus susceptibles de présenter une activité cytotoxique, certains lymphocytes T CD4+ sont également équipés d’une activité cytotoxique en tant qu’expression indirectement détectée de molécules CD107ade surface 12. De plus, certains sous-ensembles de lymphocytes T expriment la chimiokine MIP-1α, qui est souvent sécrétée par les monocytes pour participer au recrutement des neutrophiles médiés par les lymphocytes T13. De même, les CD8+ TPFs peuvent également être utilisés pour caractériser la polyvalence des marqueurs ci-dessus. Des études ont montré que la stratégie prime-boost peut induire efficacement une période prolongée d’effets protecteurs du TPF 13, ce qui peut renforcer la protection obtenue par la vaccination. Une caractéristique centrale de l’examen du système immunitaire est la capacité des lymphocytes T mémoire à faciliter des réponses plus fortes, plus rapides et plus efficaces aux défis viraux secondaires que les lymphocytes T naïfs. Les lymphocytes T à mémoire effectrice (TEM) et les lymphocytes T à mémoire centrale (TCM) sont des sous-ensembles importants de lymphocytes T qui sont souvent différenciés par l’expression composite de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) a tendance à se localiser dans les tissus lymphoïdes secondaires, tandis que TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) se localise dans les tissus lymphoïdes et périphériques15,16. La TEM assure une défense immédiate mais non soutenue, tandis que la TCM soutient la réponse en proliférant dans les organes lymphoïdes secondaires et en générant de nouveaux effecteurs17. Ainsi, étant donné que les cellules mémoire peuvent intervenir des réponses de rappel spécifiques et efficaces aux virus, des questions se posent quant à la contribution de ce sous-ensemble de polyfonctions.
Avec le développement de la technologie de cytométrie en flux, il est devenu courant de détecter simultanément les marqueurs de plus de 10 grappes, phénotypes et antigènes de différenciation, ce qui est bénéfique pour annoter plus abondamment les caractéristiques immunologiques fonctionnelles sur les cellules T individuelles afin de réduire les erreurs d’interprétation et les difficultés de compréhension des phénotypes des cellules T. Cette étude a utilisé la stimulation ex vivo et la cytométrie de flux pour analyser les profils de TPF dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés par le JEV. En appliquant cette approche, la compréhension de l’immunité à court et à long terme des lymphocytes T spécifiques au JEV et même à réactivité croisée induite par la vaccination sera élargie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

L’immunité à médiation par les lymphocytes T joue un rôle important dans le contrôle de l’infection à flavivirus, soit après la vaccination, soit après une infection naturelle. La « qualité » d’un lymphocyte T doit être évaluée par fonction, et une fonction supérieure est associée à une protection immunitaire plus puissante. Les lymphocytes T qui peuvent produire simultanément deux cytokines ou chimiokines ou plus au niveau unicellulaire sont appelés lymphocytes T polyfonctionnels (TPFs), qui médient les réponses immunitaires par divers mécanismes moléculaires pour exprimer les marqueurs de dégranulation (CD107a) et sécréter de l’interféron (IFN)-γ, du facteur de nécrose tumorale (TNF)-α, de l’interleukine (IL)-2 ou de la protéine inflammatoire des macrophages (MIP)-1α. Il existe de plus en plus de preuves que les TPFsont étroitement liés au maintien de la mémoire immunitaire et de la protection à long terme et que leur proportion accrue est un marqueur important de l’immunité protectrice et est important dans le contrôle efficace de l’infection virale et de la réactivation. Cette évaluation s’applique non seulement à des réponses immunitaires spécifiques, mais aussi à l’évaluation des réponses immunitaires réactives croisées. Ici, en prenant le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) comme exemple, la méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPFspécifiques du JEV produites par les cellules mononucléaires du sang périphérique d’enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.

La figure 1 montre la stratégie de déclenchement utilisée pour diviser le TCM ou le TEM des lymphocytes T CD8+ ou CD4+ d’un groupe représentatif de stimulation du JEV d’enfants vaccinés contre l’EJ. Le diagramme à points FSC-A/SSC-A est utilisé pour identifier les lymphocytes, et le diagramme à points FSC-A/FSC-W est utilisé pour identifier les cellules individuelles. Les cellules viables sont sélectionnées sur le diagramme à poin...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Le présent protocole combine la stimulation ex vivo et la cytométrie en flux pour analyser les profils de lymphocytes T polyfonctionnels (TPF) dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez les enfants vaccinés contre le virus de l’encéphalite japonaise (JEV). La méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux des TPF spécifiques au JEV ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires.

Détection de lymphocytes T polyfonctionnels chez les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise par la technique de cytométrie en flux

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

La méthode de détection et la palette de couleurs de cytométrie en flux du TPFS spécifique au virus de l’encéphalite japonaise ont été testées pour fournir une référence pour des études similaires. La démonstration de la procédure sera effectuée par Linlin Zhang et Meng Zhang, deux étudiants de notre laboratoire. Pour commencer, stimulez les PBMC du groupe de stimulation JEV avec des particules JEV inactivées concentrées pendant 16 heures à 37 degrés Celsius en présence d’anticorps monoclonaux, CD28 et CD49d, CD107a, GolgiPlug et monensin.Ensuite, stimuler les PBMC du groupe témoin sans particules virales concentrées pendant 16 heures à 37 degrés Celsius en présence d’anticorps monoclonaux, CD28 et CD49d, CD 107a, GolgiPlug et monensin. Recueillir la suspension cellulaire de chaque groupe dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.Remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de PBS. Ajouter un colorant de viabilité réparable à la suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger à 500 g à température ambiante pendant cinq minutes et retirer le surnageant.Après avoir remis les cellules en suspension dans 1 millilitre de PBS, à nouveau, centrifuger à 500 g à température ambiante pendant cinq minutes et jeter le surnageant comme démontré précédemment. Pour effectuer la coloration des marqueurs de surface cellulaire, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS et ajoutez deux microlitres de chaque anticorps marqueur de surface à la suspension cellulaire dans chaque tube. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante tout en les protégeant de la lumière.Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant comme démontré précédemment. Encore une fois, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et jeter soigneusement le surnageant.Pour effectuer la fixation et la rupture de la membrane, remettez les cellules en suspension avec 500 microlitres de solution fixatrice de rupture de membrane et fixez les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Puis centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant. Après avoir remis les cellules en suspension dans un millilitre de PBS, centrifuger pendant cinq minutes à 500 g à température ambiante et retirer le surnageant avec précaution, comme démontré précédemment.Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS et ajoutez deux microlitres de chaque anticorps cytokine à la suspension cellulaire dans chaque tube pour la coloration intracellulaire des cytokines. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Encore une fois, centrifuger à 500 g pendant cinq minutes et retirer le surnageant comme démontré précédemment.Encore une fois, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Centrifuger à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant avec précaution comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS pour remettre les cellules en suspension.Après avoir isolé l’échantillon PBMC seul, comme démontré précédemment, diviser la suspension cellulaire en 12 parties égales dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre décrits dans le manuscrit. De même, après avoir ajouté les marqueurs de surface cellulaire et l’anticorps de cytokine intracellulaire, comme démontré précédemment, ajoutez 500 microlitres de PBS pour remettre en suspension les cellules et le vortex à faible vitesse. À l’aide d’un échantillon non coloré, ajuster la diffusion directe, la diffusion latérale et différentes tensions de colorant fluorescent, tout en ajustant la compensation de cytométrie en flux pour éliminer les signaux de contamination entre les différents fluorophores, en utilisant les échantillons de coloration uniques.Tracez une porte polygonale à travers la zone de diffusion avant, un diagramme de points de zone de dispersion latérale pour sélectionner la population de lymphocytes intacte, tout en excluant les débris, et une porte rectangulaire à travers la zone de diffusion avant, un diagramme de points de largeur de diffusion avant pour sélectionner les cellules individuelles. Ensuite, tracez une porte rectangulaire à travers le diagramme de points de la zone de dispersion du côté mort pour sélectionner les cellules vivantes, et une porte rectangulaire à travers le diagramme de points de la zone de dispersion latérale CD3 pour identifier les trois cellules T positives du CD. Ensuite, tracez une porte quadruple à travers le diagramme de points CD4, CD8 pour identifier les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs et à travers le diagramme à points CD45RO, CD27 pour subdiviser les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs en MTC et MET.Après avoir dessiné les portes de CD107a, de l’interféron gamma, du facteur de nécrose tumorale alpha, de l’interleukine 2 et de la protéine inflammatoire microphage un alpha à partir de la MTC ou de la TEM des lymphocytes T CD8 positifs ou CD4 positifs pour déterminer la fréquence des différents modèles de réponse respectivement. Chargez les échantillons sur la cytométrie séquentiellement. La stratégie de contrôle a été utilisée pour identifier la MTC ou la MET des lymphocytes T CD8 positifs ou CD4 positifs et leurs sous-ensembles à l’aide de la largeur de la zone de diffusion avant, puis du diagramme de points de la zone de diffusion latérale.La caractérisation polyfonctionnelle des réponses des lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs au JEV a indiqué que des niveaux accrus de CD107a, d’interféron gamma, de facteur de nécrose tumorale alpha et d’interleukine 2 ont été détectés dans les cellules TCM CD8 positives des enfants vaccinés après la stimulation par le JEV par rapport à ceux des enfants non vaccinés. Cependant, le niveau de protéine inflammatoire macrophage un alpha ne différait pas entre les deux groupes. Des taux plus élevés de CD107a et d’interféron gamma ont été détectés dans les cellules TEM CD8 positives du groupe vacciné sous stimulation par le JEV par rapport au groupe non vacciné.Alors que le facteur de nécrose tumorale alpha, l’interleukine 2 et la protéine inflammatoire macrophage un alpha n’étaient pas significativement élevés dans ces cellules positives. L’antigène JEV a induit avec succès des niveaux plus élevés de CD107a, d’interféron gamma, de facteur de nécrose tumorale alpha et de protéine inflammatoire alpha des macrophages dans les cellules TCM CD4 positives du groupe vacciné par rapport au groupe non vacciné. Cependant, la proportion de cellules positives à l’interleukine 2 ne différait pas entre les deux groupes sous stimulation par JEV.La proportion de sous-ensembles CD107a positifs, positifs à l’interféron gamma et positifs au facteur de nécrose tumorale alpha, de cellules TEM sous-CD4 positives dans le groupe vacciné était plus élevée en présence de JEV que dans le groupe non vacciné. L’immunogénicité des stimuli par les lymphocytes T et les stratégies de correspondance des couleurs compatibles sont des étapes critiques de ce protocole.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Recherche

Immunologie et infection

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