Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130) und der Beijing Natural Science Foundation of China (7222059) unterstützt. ZD.X. wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.

Die ethische Genehmigung für die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Periphere venöse Blutproben wurden von scheinbar gesunden Kindern (2 Jahre alt) entnommen, die zuvor weniger als ein halbes Jahr lang eine Prime- und Boost-Impfung mit lebend-attenuiertem JE SA14-14-2-Impfstoff erhalten hatten (JE-geimpfte Kinder,...

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	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt eine praktikable Durchflusszytometrie-basierte Nachweismethode fürT-PF-Profile in den PBMCs von Kindern dar, die mit dem JEV-Impfstoff SA14-14-2 geimpft wurden. Diese Studie verwendete die venösen Blut-PBMCs von geimpften und ungeimpften Kindern als Forschungsmaterialien. Mit der Stimulation von PBMCs mit dem JEV-Antigen können diese amplifizierten antigenspezifischenT-PFsdurch mehrfarbige Durchflusszytometrie-Antikörperfärbung charakterisiert werden. Im Vergleich zur he...

Das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) ist ein wichtiges durch Mücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae1. Viele asiatisch-pazifische Länder stehen aufgrund der enormen Krankheitslast durch die Japanische Enzephalitis (JE) seit langem vor enormen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit, aber dies hat sich mit der zunehmenden Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfungen dramatisch verbessert2. Adaptive schützende Immunantworten, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden, tragen zur Prävention und antiviralen Regulation bei. Humorale Immunität und zellvermittelte Immunität werden als adaptive Immunität klassifiziert, und die Induktion der ersteren wurde immer als Schlüsselstrategie im Impfstoffdesign angesehen, wenn auch mit relativ begrenztem Verständnis in der Vergangenheit3. Die Rolle der T-Zell-vermittelten Immunität bei der Begrenzung der Flavivirusverbreitung und Virusclearance wurde jedoch zunehmend in den Fokus gerückt und umfassend untersucht4. Darüber hinaus ist die T-Zell-Immunität nicht nur für JEV-spezifische antivirale Reaktionen unverzichtbar, sondern spielt auch eine herausragende Rolle beim Kreuzschutz vor Sekundärinfektionen mit heterologen Flaviviren, was in früheren Studien gezeigt wurde5. Es wird spekuliert, dass dieser Effekt potenzielle Antikörper-vermittelte Verstärkungseffekte bei Infektion umgehen kann5. Bemerkenswert ist, dass eine solche kreuzreaktive T-Zell-Immunität wichtig ist, insbesondere in Abwesenheit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten gegen Flaviviren. Obwohl viele Studien durchgeführt wurden, um den Beitrag von T-Zellen bei der JEV-Infektion in Bezug auf CD4+ und CD8+ T-Zellen6,7 zu bestimmen, bleiben die jeweiligen Linien der Zytokine und ihre funktionelle Diversifizierung unbestimmt, was bedeutet, dass die Aufklärung der genauen Funktionen von Helfer- und Killer-T-Zellen behindert wird.
Das Ausmaß ihrer antiviralen Abwehrkräfte bestimmt die Qualität der T-Zell-Antworten. CD4+ oder CD8+ T-Zellen, die kompatibel zwei oder mehr Funktionen übertragen können, einschließlich Zytokinsekretion und Degranulation, werden bei spezifischer Stimulation auf Einzelzellebene als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) charakterisiert8. CD4+ T-Zellen, die einzelne oder mehrere Zytokine produzieren, können verschiedene Wirkungen und Immungedächtnisse haben. Zum Beispiel bilden IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen eher eine langfristig wirksame Schutzreaktion als IL-2+ CD4+ T-Zellen9, was als wichtiger Parameter zur Bewertung des Impfeffekts verwendet werden kann. Die Häufigkeit von IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen ist bei Patienten mit langfristiger Nicht-Progression des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) erhöht, während CD4+ T-Zellen bei Patienten mit AIDS-Progression aufgrund der fördernden Wirkung von IL-2 auf die T-Zellproliferationeher dazu neigen, IFN-γ allein zu produzieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langfristig in vivo überlebt und die Tötungsfunktion synergistisch fördert11. Obwohl CD8+ T-Zellen eher zytotoxische Aktivität aufweisen, sind einige CD4+ T-Zellen auch mit zytotoxischer Aktivität als indirekt nachgewiesene Expression von Oberflächen-CD107a-Molekülenausgestattet 12. Darüber hinaus exprimieren bestimmte T-Zell-Untergruppen das Chemokin MIP-1α, das oft von Monozyten sezerniert wird, um an der T-Zell-vermittelten Neutrophilenrekrutierung teilzunehmen13. In ähnlicher Weise können CD8+ TPFs auch verwendet werden, um die Vielseitigkeit der oben genannten Marker zu charakterisieren. Studien haben gezeigt, dass die Prime-Boost-Strategie effektiv einen längeren Zeitraum von T-PF-Schutzwirkungen induzieren kann13, was den durch die Impfung hervorgerufenen Schutz verstärken kann. Ein zentrales Merkmal bei der Untersuchung des Immunsystems ist die Fähigkeit von Gedächtnis-T-Zellen, stärkere, schnellere und effektivere Reaktionen auf sekundäre virale Herausforderungen zu ermöglichen als naive T-Zellen. Effektorgedächtnis-T-Zellen (T EM) und zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T CM) sind wichtige T-Zell-Untergruppen, die oft durch die zusammengesetzte Expression von CD27/CD45RO oder CCR7/CD45RA 14 unterschieden werden. TCM (CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA-) neigt dazu, sich in sekundären lymphatischen Geweben zu lokalisieren, während TEM (CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA-) in lymphatischen und peripheren Geweben lokalisiert15,16. TEM bietet eine sofortige, aber nicht anhaltende Abwehr, während TCM die Reaktion aufrechterhält, indem es sich in den sekundären lymphatischen Organen vermehrt und neue Effektoren erzeugt17. Da Gedächtniszellen spezifische und effiziente Erinnerungsreaktionen auf Viren vermitteln können, stellen sich Fragen nach dem Beitrag dieser Untergruppe von Polyfunktionen.
Mit der Entwicklung der Durchflusszytometrie-Technologie ist es üblich geworden, Marker von mehr als 10 Clustern, Phänotypen und Differenzierungsantigenen gleichzeitig zu erkennen, was vorteilhaft ist, um die funktionellen immunologischen Merkmale einzelner T-Zellen besser zu kommentieren, um Fehlinterpretationen und Schwierigkeiten beim Verständnis von T-Zell-Phänotypen zu reduzieren. Diese Studie verwendete Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, umT-PF-Profile in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei JEV-geimpften Kindern zu analysieren. Mit diesem Ansatz wird das Verständnis der kurz- und langfristigen JEV-spezifischen und sogar kreuzreaktiven T-Zell-Immunität, die durch Impfung induziert wird, erweitert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavivirus-Infektion, entweder nach der Impfung oder nach einer natürlichen Infektion. Die "Qualität" einer T-Zelle muss nach Funktion beurteilt werden, und eine höhere Funktion ist mit einem stärkeren Immunschutz verbunden. T-Zellen, die gleichzeitig zwei oder mehr Zytokine oder Chemokine auf Einzelzellebene produzieren können, werden als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) bezeichnet, die Immunantworten durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermitteln, um Degranulationsmarker (CD107a) zu exprimieren und Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 oder Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α zu sezernieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dassT-PFeng mit der Aufrechterhaltung des langfristigen Immungedächtnisses und -schutzes zusammenhängen und dass ihr erhöhter Anteil ein wichtiger Marker für schützende Immunität und wichtig für die wirksame Kontrolle von Virusinfektionen und Reaktivierungen ist. Diese Bewertung gilt nicht nur für spezifische Immunantworten, sondern auch für die Beurteilung von kreuzreaktiven Immunantworten. Hier wurden am Beispiel des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema von JEV-spezifischenT-PFsgetestet, die von peripheren mononukleären Blutzellen von Kindern produziert werden, die gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie, mit der dieT-CM- oderT-EM von CD8+- oder CD4+-T-Zellen aus einer repräsentativen JEV-Stimulationsgruppe von JE-geimpften Kindern geteilt wird. Das FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um Lymphozyten zu identifizieren, und das FSC-A/FSC-W-Punktdiagramm wird verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren. Lebensfähige Zellen werden auf dem Lebend/Toten/SSC-A-Punktdiagramm ausgewählt. Das CD3/SSC-A-Punk...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Das vorliegende Protokoll kombiniert Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um polyfunktionelle T-Zell-Profile (T PF) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) geimpften Kindern zu analysieren. Die Detektionsmethode und das Farbschema der Durchflusszytometrie von JEV-spezifischen TPFs wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

Die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema des Japanischen Enzephalitis-Virus-spezifischen TPFS wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern. Die Demonstration des Verfahrens wird von Linlin Zhang und Meng Zhang, zwei Studenten aus unserem Labor, durchgeführt. Zu Beginn stimulieren Sie die PBMCs der JEV-Stimulationsgruppe mit konzentrierten inaktivierten JEV-Partikeln für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, CD28 und CD49d, CD107a, GolgiPlug und Monensin.Anschließend stimulieren Sie die PBMCs der Kontrollgruppe ohne konzentrierte Viruspartikel für 16 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, CD28 und CD49d, CD 107a, GolgiPlug und Monensin. Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Gruppe in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter PBS. Fügen Sie der Zellsuspension fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff hinzu und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bei 500 g bei Raumtemperatur fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen.Nach Resuspendierung der Zellen in 1 Milliliter PBS erneut bei 500 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand wie zuvor demonstriert verwerfen. Um eine Zelloberflächenmarkerfärbung durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen zwei Mikroliter jedes Oberflächenmarker-Antikörpers hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht.Bei 500 g fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand wie zuvor demonstriert entfernen. Resuspendieren Sie erneut die Zellen in einem Milliliter PBS. Bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.Um eine Fixierung und einen Membranbruch durchzuführen, resuspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern membranbrechender Fixierlösung und fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dann bei 500 g für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen. Nach Resuspendierung der Zellen in einem Milliliter PBS fünf Minuten bei 500 g bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen, wie zuvor gezeigt.Dann resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS und fügen Sie zwei Mikroliter jedes Zytokin-Antikörpers zur Zellsuspension in jedem Röhrchen zur intrazellulären Zytokinfärbung hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 500 g und entfernen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt.Resuspendieren Sie die Zellen erneut in einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie bei 500 g fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, wie zuvor demonstriert. Dann fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.Nach der Isolierung der PBMC-Probe allein, wie zuvor gezeigt, teilen Sie die Zellsuspension in 12 gleiche Teile in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, wie im Manuskript beschrieben. In ähnlicher Weise werden nach Zugabe der Zelloberflächenmarker und des intrazellulären Zytokinantikörpers, wie zuvor gezeigt, 500 Mikroliter PBS hinzugefügt, um die Zellen und den Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit zu resuspendieren. Passen Sie bei Verwendung einer ungefärbten Probe die Vorwärtsstreuung, die Seitenstreuung und die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffspannungen an, während Sie die Durchflusszytometrie-Kompensation anpassen, um die Kontaminationssignale zwischen den verschiedenen Fluorophoren zu eliminieren, wobei die einzelnen Färbeproben verwendet werden.Zeichnen Sie ein Polygongatter durch den Vorwärtsstreubereich, ein Seitenstreuflächenpunktdiagramm, um die intakte Lymphozytenpopulation auszuwählen, während Sie die Trümmer ausschließen, und ein rechteckiges Tor durch den Vorwärtsstreubereich, Vorwärtsstreubreite Punktdiagramm, um die einzelnen Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie als Nächstes ein rechteckiges Tor durch das Punktdiagramm für den toten Seitenstreubereich, um die lebenden Zellen auszuwählen, und ein rechteckiges Tor durch das CD3-Seitenstreubereichspunktdiagramm, um die drei positiven T-Zellen der CD zu identifizieren. Zeichnen Sie dann ein Quad-Gate durch das CD4-, CD8-Punktdiagramm, um die CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen zu identifizieren, und durch das CD45RO-, CD27-Punktdiagramm, um die CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen in TCM und TEM zu unterteilen.Nach dem Ziehen der Gatter von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin 2 und Mikrophagen-Entzündungsprotein ein alpha aus der TCM oder TEM der CD8-positiven bzw. CD4-positiven T-Zellen, um die Häufigkeit unterschiedlicher Antwortmuster zu bestimmen. Laden Sie die Proben nacheinander auf die Zytometrie. Die Gating-Strategie wurde verwendet, um die TCM oder TEM von CD8-positiven oder CD4-positiven T-Zellen und ihre Teilmengen unter Verwendung der Vorwärtsstreubereichsbreite und dann des Seitenstreuflächenpunktdiagramms zu identifizieren.Die polyfunktionelle Charakterisierung von CD4-positiven und CD8-positiven T-Zell-Antworten auf JEV zeigte, dass erhöhte Spiegel von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha und Interleukin 2 in den CD8-positiven TCM-Zellen der geimpften Kinder nach JEV-Stimulation im Vergleich zu denen bei ungeimpften Kindern nachgewiesen wurden. Das Niveau des Makrophagen-Entzündungsproteins One alpha unterschied sich jedoch nicht zwischen den beiden Gruppen. Höhere Konzentrationen von CD107a und Interferon gamma wurden in den CD8-positiven TEM-Zellen der geimpften Gruppe unter JEV-Stimulation im Vergleich zur ungeimpften Gruppe nachgewiesen.Während Tumornekrosefaktor alpha, Interleukin 2 und Makrophagen-Entzündungsprotein ein alpha, in diesen positiven Zellen nicht signifikant erhöht waren. Das JEV-Antigen induzierte erfolgreich höhere Spiegel von CD107a, Interferon gamma, Tumornekrosefaktor alpha und Makrophagen-Entzündungsprotein ein alpha in den CD4-positiven TCM-Zellen der geimpften Gruppe im Vergleich zur ungeimpften Gruppe. Der Anteil der Interleukin-2-positiven Zellen unterschied sich jedoch nicht zwischen den beiden Gruppen unter JEV-Stimulation.Der Anteil der CD107a-positiven, Interferon-gamma-positiven und Tumornekrosefaktor-alpha-positiven Untergruppen, sub-CD4-positiven TEM-Zellen in der geimpften Gruppe war in Gegenwart von JEV höher als in der ungeimpften Gruppe. Die T-Zell-Immunogenität der Stimuli und die kompatiblen Farbabstimmungsstrategien sind kritische Schritte in diesem Protokoll.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...