Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82002130), dalla Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. è stato supportato dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

L'approvazione etica per il presente studio è stata ottenuta dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). I volontari sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. I campioni di sangue venoso periferico sono stati ottenuti da bambini apparentemente sani (2 anni) che avevano precedentemente ricevuto una vaccinazione primaria e potenziata con vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato per meno di sei mesi (bambini v...

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	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Questo protocollo rappresenta un metodo di rilevazione fattibile basato sulla citometria a flusso per i profili TPF nelle PBMC di bambini vaccinati con il vaccino JEV SA14-14-2. Questo studio ha utilizzato le PBMC del sangue venoso di bambini vaccinati e non vaccinati come materiali di ricerca. Con la stimolazione delle PBMC con l'antigene JEV, quellePF Tamplificate antigene-specifiche possono essere caratterizzate dalla colorazione anticorpale con citometria a flusso multicolore. Rispetto al metodo...

Il virus dell'encefalite giapponese (JEV) è un importante virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus all'interno della famiglia Flaviviridae1. Molti paesi dell'Asia-Pacifico hanno affrontato a lungo enormi sfide per la salute pubblica a causa dell'enorme carico di malattia causato dall'encefalite giapponese (JE), ma questo è migliorato notevolmente con la crescente disponibilità di vari tipi di vaccinazioni2. Le risposte immunitarie protettive adattative evocate dall'infezione naturale o dalla vaccinazione contribuiscono alla prevenzione e alla regolazione antivirale. L'immunità umorale e l'immunità cellulo-mediata sono classificate come immunità adattativa e l'induzione della prima è sempre stata considerata una strategia chiave nella progettazione di vaccini, sebbene con una comprensione relativamente limitata negli ultimi3. Tuttavia, il ruolo dell'immunità mediata dalle cellule T nel limitare la diffusione del flavivirus e la clearance del virus è stato sempre più focalizzato e ampiamente studiato4. Inoltre, l'immunità delle cellule T non è solo indispensabile nelle risposte antivirali specifiche per JEV, ma svolge anche un ruolo di primo piano nella protezione incrociata dall'infezione secondaria con flavivirus eterologhi, che è stato dimostrato in studi precedenti5. Si ipotizza che questo effetto possa bypassare potenziali effetti di potenziamento mediati da anticorpi nell'infezione5. Da notare, tale immunità delle cellule T cross-reattive è importante, specialmente in assenza di vaccini e farmaci antivirali contro i flavivirus. Sebbene siano stati condotti molti studi per determinare il contributo delle cellule T nell'infezione da JEV rispetto alle cellule T CD4+ e CD8+ 6,7, le rispettive linee che secernono citochine e la loro diversificazione funzionale rimangono indeterminate, il che significa che la delucidazione delle esatte funzioni delle cellule T helper e killer è ostacolata.
La scala delle loro difese antivirali determina la qualità delle risposte delle cellule T. Le cellule T CD4+ o CD8+ che possono conferire compatibilmente due o più funzioni, tra cui la secrezione e la degranulazione delle citochine, sono caratterizzate come cellule T polifunzionali (TPFs) dopo stimolazione specificaa livello 8 di singola cellula. Le cellule T CD4 + che producono citochine singole o multiple possono avere vari effetti e memorie immunitarie. Ad esempio, le cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ hanno maggiori probabilità di formare una risposta protettiva efficace a lungo termine rispetto alle cellule T IL-2+ CD4+ 9, che possono essere utilizzate come parametro importante nella valutazione dell'effetto della vaccinazione. La frequenza delle cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ è aumentata nei pazienti con non-progressione a lungo termine della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), mentre le cellule T CD4+ nei pazienti con progressione dell'AIDS sono più inclini a produrre IFN-γ da solo a causa dell'effetto promotore di IL-2 sulla proliferazione delle cellule T10. Inoltre, un sottogruppo di IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ ha dimostrato di sopravvivere a lungo termine in vivo e promuovere sinergicamente la funzione di uccisione11. Sebbene le cellule T CD8+ abbiano maggiori probabilità di mostrare attività citotossica, alcune cellule T CD4+ sono anche dotate di attività citotossica come espressione rilevata indirettamente delle molecole di superficie CD107a12. Inoltre, alcuni sottogruppi di cellule T esprimono la chemochina MIP-1α, che è spesso secreta dai monociti per partecipare al reclutamento dei neutrofili mediato dalle cellule T13. Allo stesso modo, CD8+ TPFs può anche essere utilizzato per caratterizzare la versatilità dei marcatori di cui sopra. Gli studi hanno dimostrato che la strategia prime-boost può effettivamente indurre un periodo prolungato di effetti protettivi TPF 13, che possono migliorare la protezione suscitata dalla vaccinazione. Una caratteristica centrale nell'esame del sistema immunitario è la capacità delle cellule T di memoria di facilitare risposte più forti, più veloci e più efficaci alle sfide virali secondarie rispetto alle cellule T naïve. Le cellule T della memoria effettrice (TEM) e le cellule T della memoria centrale (TCM) sono importanti sottoinsiemi di cellule T che sono spesso differenziate dall'espressione composita di CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. La TCM (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tende a localizzarsi nei tessuti linfoidi secondari, mentre la TEM (CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA-) si localizza nei tessuti linfoidi e periferici15,16. TEM fornisce una difesa immediata ma non sostenuta, mentre TCM sostiene la risposta proliferando negli organi linfoidi secondari e generando nuovi effettori17. Pertanto, dato che le cellule di memoria possono mediare risposte di richiamo specifiche ed efficienti ai virus, sorgono domande sul contributo di questo sottoinsieme di polifunzioni.
Con lo sviluppo della tecnologia di citometria a flusso, è diventato comune rilevare simultaneamente marcatori di oltre 10 cluster, fenotipi e antigeni di differenziazione, il che è utile per annotare più abbondantemente le caratteristiche immunologiche funzionali sulle singole cellule T per ridurre l'interpretazione errata e le difficoltà nella comprensione dei fenotipi delle cellule T. Questo studio ha utilizzato la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili TPF nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con JEV. Applicando questo approccio, verrà ampliata la comprensione dell'immunità delle cellule T JEV-specifica e persino cross-reattiva a breve e lungo termine indotta dalla vaccinazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

L'immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo importante nel controllo dell'infezione da flavivirus, sia dopo la vaccinazione che dopo l'infezione naturale. La "qualità" di una cellula T deve essere valutata per funzione e una funzione più elevata è associata a una protezione immunitaria più potente. Le cellule T che possono produrre simultaneamente due o più citochine o chemochine a livello di singola cellula sono chiamate cellule T polifunzionali (TPFs), che mediano le risposte immunitarie attraverso una varietà di meccanismi molecolari per esprimere marcatori di degranulazione (CD107a) e secernere interferone (IFN)-γ, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-2 o proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α. Vi è una crescente evidenza che le TPFsono strettamente correlate al mantenimento della memoria immunitaria a lungo termine e alla protezione e che la loro maggiore proporzione è un importante marker di immunità protettiva ed è importante nel controllo efficace dell'infezione virale e della riattivazione. Questa valutazione si applica non solo a specifiche risposte immunitarie, ma anche alla valutazione delle risposte immunitarie cross-reattive. Qui, prendendo come esempio il virus dell'encefalite giapponese (JEV), il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flussodei PF Tspecifici di JEV prodotti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzata per dividere la TCM o TEM delle cellule T CD8+ o CD4+ da un gruppo rappresentativo di stimolazione JEV di bambini vaccinati con JE. Il dot plot FSC-A/SSC-A viene utilizzato per identificare i linfociti e il dot plot FSC-A/FSC-W viene utilizzato per identificare singole cellule. Le celle vitali vengono selezionate sul dot plot vivo/morto/SSC-A. Il dot plot CD3/SSC-A viene utilizzato per identifica...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all'interno di bambini vaccinati con virus dell'encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

Rilevamento di cellule T polifunzionali in bambini vaccinati con vaccino contro l'encefalite giapponese tramite la tecnica della citometria a flusso

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

Il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flusso del TPFS specifico del virus dell'encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili. La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Linlin Zhang e Meng Zhang, due studenti del nostro laboratorio. Per iniziare, stimolare le PBMC del gruppo di stimolazione JEV con particelle JEV inattivate concentrate per 16 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anticorpi monoclonali, CD28 e CD49d, CD107a, GolgiPlug e monensina.Quindi, stimolare le PBMC del gruppo di controllo senza particelle virali concentrate per 16 ore a 37 gradi Celsius in presenza di anticorpi monoclonali, CD28 e CD49d, CD 107a, GolgiPlug e monensina. Raccogliere la sospensione cellulare da ciascun gruppo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante con una pipetta.Risospendere le cellule in 1 millilitro di PBS. Aggiungere il colorante di vitalità fissabile alla sospensione cellulare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare a 500 g a temperatura ambiente per cinque minuti e rimuovere il surnatante.Dopo aver risospeso le cellule in 1 millilitro di PBS, di nuovo, centrifugare a 500 g a temperatura ambiente per cinque minuti e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza. Per eseguire la colorazione dei marcatori della superficie cellulare, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS e aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo marcatore di superficie alla sospensione cellulare in ciascun tubo. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente proteggendoli dalla luce.Centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante come dimostrato in precedenza. Ancora una volta, risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare accuratamente il surnatante .Per eseguire la fissazione e la rottura della membrana, risospendere le cellule con 500 microlitri di soluzione fissativa che rompe la membrana e fissare le cellule per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Dopo aver risospeso le cellule in un millilitro di PBS, centrifugare per cinque minuti a 500 g a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante come dimostrato in precedenza.Quindi, risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS e aggiungere due microlitri di ciascun anticorpo citochina alla sospensione cellulare in ciascun tubo per la colorazione intracellulare delle citochine. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Anche in questo caso, centrifugare a 500 g per cinque minuti e rimuovere il surnatante come dimostrato in precedenza.Ancora una volta, risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Centrifugare a 500 g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere accuratamente il surnatante come dimostrato in precedenza. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS per risospendere le celle.Dopo aver isolato il solo campione PBMC, come dimostrato in precedenza, dividere la sospensione cellulare in 12 parti uguali in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri descritte nel manoscritto. Allo stesso modo, dopo aver aggiunto i marcatori di superficie cellulare e l'anticorpo citochina intracellulare, come dimostrato in precedenza, aggiungere 500 microlitri di PBS per risospendere le cellule e il vortice a bassa velocità. Utilizzando un campione non colorato, regolare la dispersione diretta, la dispersione laterale e le diverse tensioni del colorante fluorescente, regolando la compensazione della citometria a flusso per eliminare i segnali di contaminazione tra i diversi fluorofori, utilizzando i singoli campioni di colorazione.Disegnare un cancello poligonale attraverso l'area di dispersione in avanti, un dot plot dell'area di dispersione laterale per selezionare la popolazione di linfociti intatta, escludendo i detriti, e un cancello rettangolare attraverso l'area di dispersione in avanti, dot plot della larghezza di dispersione in avanti per selezionare le singole celle. Quindi, disegna un cancello rettangolare attraverso il dot plot dell'area di dispersione del lato morto vivo per selezionare le celle vive e un cancello rettangolare attraverso il grafico del punto dell'area di dispersione laterale CD3 per identificare le tre celle T positive del CD. Quindi, disegnare un quad gate attraverso il dot plot CD4, CD8 per identificare le cellule T CD4 positive o CD8 positive e attraverso il CD45RO, CD27 dot plot per suddividere le cellule T CD4 positive o CD8 positive in TCM e TEM.Dopo aver disegnato le porte di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa, interleuchina 2 e proteina infiammatoria microfagica uno alfa dal TCM o TEM delle cellule T CD8 positive o CD4 positive per determinare rispettivamente la frequenza dei diversi modelli di risposta. Caricare i campioni sulla citometria in sequenza. La strategia di gating è stata impiegata per identificare il TCM o TEM delle cellule T CD8 positive o CD4 positive e dei loro sottoinsiemi utilizzando la larghezza dell'area di dispersione diretta, quindi il dot plot dell'area di dispersione laterale.La caratterizzazione polifunzionale delle risposte delle cellule T CD4 positive e CD8 positive alla JEV ha indicato che sono stati rilevati livelli aumentati di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa e interleuchina 2 nelle cellule TCM CD8 positive dei bambini vaccinati dopo stimolazione JEV rispetto a quelli nei bambini non vaccinati. Tuttavia, il livello di proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa non differiva tra i due gruppi. Livelli più elevati di CD107a e interferone gamma sono stati rilevati nelle cellule TEM CD8 positive del gruppo vaccinato sotto stimolazione JEV rispetto al gruppo non vaccinato.Mentre il fattore di necrosi tumorale alfa, l'interleuchina 2 e la proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa, non erano significativamente elevati in quelle cellule positive. L'antigene JEV ha indotto con successo livelli più elevati di CD107a, interferone gamma, fattore di necrosi tumorale alfa e proteina infiammatoria dei macrofagi uno alfa nelle cellule TCM CD4 positive del gruppo vaccinato rispetto al gruppo non vaccinato. Tuttavia, la proporzione di cellule positive all'interleuchina 2 non differiva tra i due gruppi sottoposti a stimolazione JEV.La proporzione di sottogruppi CD107a positivi, interferone gamma positivi e fattore di necrosi tumorale alfa positivi, cellule TEM sub CD4 positive nel gruppo vaccinato era più alta in presenza di JEV, rispetto al gruppo non vaccinato. L'immunogenicità delle cellule T degli stimoli e le strategie di corrispondenza dei colori compatibili sono passaggi critici in questo protocollo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...