Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W.は、中国国家自然科学基金会(82002130)、中国北京自然科学基金会(7222059)の支援を受けました。ZD.X.は、CAMSイノベーション・ファンド・フォー・メディカルサイエンス(2019-I2M-5-026)の支援を受けました。

本研究の倫理的承認は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって取得されました(承認番号:2020-k-85)。ボランティアは首都医科大学北京小児病院から募集されました。末梢静脈血サンプルは、以前に半年未満の弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を受けたことがある明らかに健康な子供(2歳)から取得されました(JEワクチン接種の子供、n = 5)およびワク?...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

このプロトコルは、JEVワクチンSA14-14-2を接種した小児のPBMCにおけるTFP プロファイルの実行可能なフローサイトメトリーベースの検出方法を表しています。この研究では、ワクチン接種を受けた子供と予防接種を受けていない子供の両方の静脈血PBMCを研究資料として使用しました。JEV抗原によるPBMCの刺激により、増幅された抗原特異的TFPsは、多色フローサイトメトリー抗体?...

日本脳炎ウイルス(JEV)は、フラビウイルス科1に属するフラビウイルス属に属する重要な蚊媒介性ウイルスです。多くのアジア太平洋諸国は、日本脳炎(JE)によって引き起こされる莫大な病気の負担のために長い間大きな公衆衛生上の課題に直面してきましたが、これはさまざまな種類の予防接種の利用可能性の増加とともに劇的に改善されました2。自然感染またはワクチン接種によって引き起こされる適応防御免疫応答は、予防および抗ウイルス調節に寄与する。体液性免疫と細胞性免疫は獲得免疫に分類され、前者の誘導は、過去3では比較的限られた理解しかありませんでしたが、ワクチン設計における重要な戦略として常に見なされてきました。しかし、フラビウイルスの蔓延とウイルスクリアランスを制限する上でのT細胞媒介免疫の役割はますます注目され、広く研究されています4。さらに、T細胞免疫は、JEV特異的抗ウイルス反応に不可欠であるだけでなく、以前の研究で実証されている異種フラビウイルスによる二次感染からの交差防御においても重要な役割を果たしています5。この効果は、感染症における潜在的な抗体媒介増強効果を回避する可能性があると推測されています5。注目すべきことに、このような交差反応性T細胞免疫は、特にフラビウイルスに対するワクチンおよび抗ウイルス薬が存在しない場合に重要である。CD4+およびCD8+ T細胞に関してJEV感染におけるT細胞の寄与を決定するために多くの研究が行われてきたが6,7、サイトカインを分泌するそれぞれの系統とその機能多様化は未定のままであり、これはヘルパーおよびキラーT細胞の正確な機能の解明が妨げられていることを意味する。
それらの抗ウイルス防御の規模は、T細胞応答の質を決定する。サイトカイン分泌および脱顆粒を含む2つ以上の機能を相溶的に付与することができるCD4+またはCD8+ T細胞は、単一細胞レベルでの特異的刺激に対して多機能性T細胞(TFs)として特徴付けられる8。単一または複数のサイトカインを産生するCD4+ T細胞は、さまざまな効果と免疫記憶を持っている可能性があります。例えば、IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞は、IL-2+ CD4+ T細胞よりも長期的に有効な防御応答を形成する可能性が高く、ワクチン接種効果を評価する際の重要なパラメータとして使用できます。IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞の頻度は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の長期非進行の患者で増加しますが、エイズ進行患者のCD4+ T細胞は、T細胞増殖に対するIL-2の促進効果により、IFN-γ単独で産生する傾向があります10。さらに、IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+のサブセットは、in vivoで長期間生存し、殺傷機能を相乗的に促進することが示されました11。CD8+ T細胞は細胞傷害活性を示す可能性が高いが、一部のCD4+ T細胞は、表面CD107a分子の発現を間接的に検出する12として細胞傷害活性も備えている。さらに、特定のT細胞サブセットはケモカインMIP-1αを発現し、これはT細胞媒介好中球動員に関与するために単球によって分泌されることが多い13。同様に、CD8+ TPFsは、上記のマーカーの汎用性を特徴付けるためにも使用できます。研究によると、プライムブースト戦略は、ワクチン接種によって誘発される保護を強化することができるTf保護効果13の長期間を効果的に誘発することができます。免疫系を調べる際の中心的な特徴は、記憶T細胞がナイーブT細胞よりも二次的なウイルスの課題に対してより強く、より速く、より効果的な応答を促進する能力です。エフェクターメモリーT細胞(TEM)および中枢メモリーT細胞(TCM)は、CD27/CD45ROまたはCCR7/CD45RAの複合発現によってしばしば分化される重要なT細胞サブセットである14。TCM(CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-)は二次リンパ組織に局在する傾向があり、TEM(CD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA-)はリンパ系および末梢組織に局在する15,16。TEMは即時の、しかし持続的ではない防御を提供するのに対し、TCMは、二次リンパ器官で増殖し、新しいエフェクターを生成することによって応答を維持する17。したがって、メモリセルがウイルスに対する特異的で効率的な想起応答を媒介できることを考えると、この多関数のサブセットの寄与について疑問が生じます。
フローサイトメトリー技術の発展に伴い、10を超えるクラスター、表現型、分化抗原のマーカーを同時に検出することが一般的になり、個々のT細胞の機能的免疫学的特徴をより豊富にアノテーションして、T細胞の表現型の誤解や理解の難しさを減らすのに役立ちます。この研究では、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを使用して、JEVワクチン接種を受けた子供の末梢血単核細胞(PBMC)のTFP プロファイルを分析しました。このアプローチを適用することで、ワクチン接種によって誘導される短期および長期のJEV特異的、さらには交差反応性T細胞免疫の理解が拡大されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T細胞媒介免疫は、ワクチン接種後または自然感染後のフラビウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。T細胞の「品質」は機能によって評価する必要があり、より高い機能はより強力な免疫防御と関連しています。単一細胞レベルで2つ以上のサイトカインまたはケモカインを同時に産生できるT細胞は、多機能性T細胞(TFPs)と呼ばれ、さまざまな分子メカニズムを介して免疫応答を仲介し、脱顆粒マーカー(CD107a)を発現し、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-2、またはマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌します。TFPは長期的な免疫記憶と保護の維持に密接に関連しており、その割合の増加は防御免疫の重要なマーカーであり、ウイルス感染と再活性化の効果的な制御に重要であるという証拠が増えています。この評価は、特異的免疫応答だけでなく、交差反応性免疫応答の評価にも適用されます。ここでは、日本脳炎ウイルス(JEV)を例にとり、日本脳炎の予防接種を受けた小児の末梢血単核球によって産生されるJEV特異的TFPsの検出方法およびフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考とした。

図1は、CD8+またはCD4+ T細胞のTCMまたはTMをJEワクチン接種小児の代表的なJEV刺激群から分割するために用いられるゲーティング戦略を示す。 FSC-A/SSC-Aドットプロットはリンパ球の同定に使用され、FSC-A/FSC-Wドットプロットは単一細胞の同定に使用されます。生細胞は、生/死/SSC-Aドットプロットで選択されます。CD3/SSC-Aドットプロットは、CD...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

本プロトコルは、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを組み合わせて、日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチン接種小児内の末梢血単核球(PBMC)の多機能T細胞(TFP)プロファイルを分析します。JEV特異的TPFの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考資料を提供しました。

フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

日本脳炎ウイルス特異的TPFSの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考にした。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の2人の学生であるLinlin ZhangとMeng Zhangによって行われます。まず、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD107a、ゴルジプラグ、およびモネンシンの存在下で、濃縮不活化JEV粒子を摂氏37度で16時間刺激します。次に、モノクローナル抗体、CD28およびCD49d、CD 107a、GolgiPlugおよびモネンシンの存在下で、濃縮ウイルス粒子を含まない対照群のPBMCを摂氏37度で16時間刺激する。各グループから細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。室温で500gで5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去する。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。固定可能な生存率色素を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、再び、室温で500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を廃棄する。細胞表面マーカー染色を行うには、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各表面マーカー抗体を追加します。チューブを光から保護しながら、室温で30分間インキュベートします。500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去します。再度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。固定および膜破壊を行うには、500マイクロリットルの膜破壊固定液で細胞を再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。その後、500gで5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁した後、室温で500 gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を注意深く除去します。次に、細胞を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、細胞内サイトカイン染色のために各チューブの細胞懸濁液に2マイクロリットルの各サイトカイン抗体を追加します。暗所で室温で30分間チューブをインキュベートします。再度、500gで5分間遠心分離し、前に示したように上清を除去する。もう一度、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁します。室温で500gで5分間遠心分離し、前述のように上清を注意深く除去します。次に、500マイクロリットルのPBSを加えて細胞を再懸濁します。PBMCサンプルのみを単離した後、前に示したように、原稿に記載されている1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで細胞懸濁液を12等分します。同様に、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン抗体を添加した後、前に実証したように、500マイクロリットルのPBSを添加して、細胞およびボルテックスを低速で再懸濁する。染色されていないサンプルを使用して、前方散乱、側方散乱、および異なる蛍光色素電圧を調整し、フローサイトメトリー補正を調整して、単一の染色サンプルを使用して異なる蛍光色素間の汚染シグナルを排除します。前方散乱領域を通る多角形ゲートを描き、無傷のリンパ球集団を選択する側方散乱領域ドットプロット、破片を除外しながら、前方散乱領域を通る矩形ゲートと、前方散乱幅ドットプロットとを描き、単一細胞を選択する。次に、生細胞を選択するために生細胞を通る死側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3側散乱領域ドットプロットを通る矩形ゲートを描き、CD3つの陽性T細胞を同定した。次に、CD4、CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画してCD4陽性またはCD8陽性T細胞を特定し、CD45RO、CD27ドットプロットを通してCD4陽性またはCD8陽性T細胞をTCMとTEMに細分化します。CD107aのゲートを引いた後、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマイクロファージ炎症性タンパク質1αをCD8陽性またはCD4陽性のT細胞のTCMまたはTEMからそれぞれ異なる応答パターンの頻度を決定した。サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。ゲーティング戦略を採用して、前方散乱領域幅、次に側方散乱領域ドットプロットを使用して、CD8陽性またはCD4陽性T細胞とそのサブセットのTCMまたはTEMを識別しました。JEVに対するCD4陽性およびCD8陽性T細胞応答の多官能的特徴は、JEV刺激後のCD8陽性TCM細胞において、ワクチン未接種の小児と比較して、CD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン2のレベルの増加が検出されたことを示した。しかし、マクロファージ炎症性タンパク質1アルファのレベルは、両群間で異ならなかった。より高いレベルのCD107aおよびインターフェロンガンマは、未ワクチン接種群と比較して、JEV刺激下でワクチン接種群のCD8陽性TEM細胞で検出された。一方腫瘍壊死因子α、インターロイキン2およびマクロファージ炎症性タンパク質1αは、それらの陽性細胞において有意に上昇しなかった。JEV抗原は、ワクチン未接種群と比較して、ワクチン接種群のCD4陽性TCM細胞において、より高いレベルのCD107a、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子α、およびマクロファージ炎症性タンパク質1αを誘導することに成功した。しかし、インターロイキン2陽性細胞の割合は、JEV刺激下で2つの群間で異ならなかった。CD107a陽性、インターフェロンガンマ陽性および腫瘍壊死因子α陽性サブセットの割合は、ワクチン接種群におけるサブCD4陽性TEM細胞は、未ワクチン接種群よりもJEVの存在下で高かった。刺激のT細胞免疫原性と互換性のあるカラーマッチング戦略は、このプロトコルの重要なステップです。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

フローサイトメトリー法による日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出