Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W.는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 중국 베이징 자연 과학 재단 (7222059)의 지원을 받았습니다. ZD.X.는 CAMS 의료 과학 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.

본 연구에 대한 윤리적 승인은 수도의과대학 베이징아동병원 윤리위원회(승인번호: 2020-k-85)에서 획득했다. 자원 봉사자는 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 모집되었습니다. 말초 정맥 혈액 샘플은 이전에 약독 화 된 JE SA14-14-2 백신으로 반년 미만 동안 프라임 및 부스트 예방 접종을받은 건강한 어린이 (2 세)로부터 얻었습니다 (JE 예방 접종을받은 어린이, n = 5) 및 예방 접종을받지 않은 어...

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	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

이 프로토콜은 JEV 백신 SA14-14-2로 백신을 접종한 어린이의 PBMC에서 TPF 프로파일에 대한 실현 가능한 유세포분석 기반 검출 방법을 나타냅니다. 이 연구는 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이의 정맥혈 PBMC를 연구 자료로 사용했습니다. JEV 항원을 갖는 PBMCs의 자극과 함께, 이들 증폭된 항원-특이적 TPFs는 다색 유동 세포분석 항체 염색에 의해 특성화될 수 있다. ?...

일본 뇌염 바이러스 (JEV)는 Flaviviridae 가족1 내의 Flavivirus 속에 속하는 중요한 모기 매개 바이러스입니다. 많은 아시아 태평양 국가들은 일본뇌염(JE)으로 인한 막대한 질병 부담으로 인해 오랫동안 엄청난 공중 보건 문제에 직면해 왔지만 다양한 유형의 예방 접종의 가용성이 증가함에 따라 극적으로 개선되었습니다2. 자연 감염 또는 백신 접종에 의해 유발되는 적응 형 보호 면역 반응은 예방 및 항 바이러스 조절에 기여합니다. 체액 성 면역과 세포 매개 면역은 적응 면역으로 분류되며, 전자의 유도는 과거3에서 상대적으로 제한된 이해에도 불구하고 항상 백신 설계의 핵심 전략으로 간주되어 왔습니다. 그러나, 플라비바이러스 전파 및 바이러스 제거를 제한하는 T 세포 매개 면역의 역할은 점점 더 집중되고광범위하게 연구되고 있다4. 또한, T 세포 면역은 JEV 특이적 항바이러스 반응에 필수적일 뿐만 아니라이전 연구에서 입증된 이종 플라비바이러스의 2차 감염으로부터 교차 보호에 중요한 역할을 합니다5. 이 효과는 감염5에서 잠재적인 항체 매개 향상 효과를 우회할 수 있다고 추측됩니다. 참고로, 이러한 교차 반응성 T 세포 면역은 특히 플라비바이러스에 대한 백신 및 항바이러스 약물의 부재 하에서 중요하다. CD4+ 및 CD8+ T 세포6,7에 대한 JEV 감염에서 T 세포의 기여도를 결정하기 위해 많은 연구가 수행되었지만, 사이토카인을 분비하는 각각의 계통과 그 기능적 다양화는 아직 결정되지 않아 도우미 및 킬러 T 세포의 정확한 기능에 대한 해명이 방해를 받습니다.
항 바이러스 방어의 규모는 T 세포 반응의 질을 결정합니다. 사이토카인 분비 및 탈과립을 포함하는, 둘 이상의 기능을 양립가능하게 부여할 수 있는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 단일-세포 수준8에서 특이적 자극시 다기능성 T 세포(TPFs)로서 특성화된다. 단일 또는 다중 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포는 다양한 효과와 면역 기억을 가질 수 있습니다. 예를 들어, IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포는 백신접종 효과를 평가하는데 중요한 파라미터로서 사용될 수 있는 IL-2+ CD4+ T 세포9보다 장기간 효과적인 보호 반응을 형성할 가능성이 더 높다. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포의 빈도는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 장기간 비진행 환자에서 증가하는 반면, AIDS 진행 환자의 CD4+ T 세포는 T 세포 증식에 대한 IL-2의 촉진 효과로 인해 IFN-γ 단독으로 생성하는 경향이 더 큽니다10. 또한, IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+의 서브세트는 생체내에서 장기간 생존하고 상승적으로 살상 기능을 촉진하는 것으로 나타났다11. CD8+ T 세포가 세포독성 활성을 나타낼 가능성이 더 높지만, 일부 CD4+ T 세포는 또한 표면 CD107a 분자(12)의 간접적으로 검출된 발현으로서 세포독성 활성을 갖는다. 또한, 특정 T 세포 하위세트는 케모카인 MIP-1α를 발현하며, 이는 종종 T 세포-매개 호중구 모집에 참여하기 위해 단핵구에 의해 분비된다13. 유사하게, CD8+ TPFs는 또한 상기 마커의 다기능성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 연구에 따르면 프라임 부스트 전략은 장기간 TPF 보호 효과13를 효과적으로 유도 할 수 있으며, 이는 백신 접종에 의해 유도 된 보호를 향상시킬 수 있습니다. 면역 체계를 검사하는 핵심 기능은 순진한 T 세포보다 2차 바이러스 문제에 대해 더 강력하고 빠르며 효과적인 반응을 촉진하는 기억 T 세포의 능력입니다. 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 및 중앙 기억 T 세포 (TCM)는 CD27/CD45RO 또는 CCR7/CD45RA14의 복합 발현에 의해 종종 분화되는 중요한 T 세포 하위세트이다. TCM (CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-)은 2차 림프성 조직에 국한되는 경향이 있는 반면, TM (CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA-)은 림프성 및 말초 조직에 국한된다15,16. TEM은 즉각적이지만 지속적이지 않은 방어를 제공하는 반면,TCM은 2차 림프성 기관에서 증식하고 새로운 이펙터(17)를 생성함으로써 반응을 지속한다. 따라서, 기억 세포가 바이러스에 대한 구체적이고 효율적인 회상 반응을 매개할 수 있다는 것을 감안할 때, 이러한 다기능의 서브세트의 기여에 대한 질문이 제기된다.
유세포 분석 기술의 발달로 10 개 이상의 클러스터, 표현형 및 분화 항원의 마커를 동시에 검출하는 것이 보편화되었으며, 이는 개별 T 세포의 기능적 면역 학적 특징을보다 풍부하게 주석으로 달아 T 세포 표현형에 대한 오해와 이해의 어려움을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 연구는 생체 외 자극 및 유세포 분석을 사용하여 JEV 백신 접종 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 TPF 프로파일을 분석했습니다. 이 접근법을 적용하면 백신 접종에 의해 유도 된 단기 및 장기 JEV 특이 적 및 심지어 교차 반응성 T 세포 면역에 대한 이해가 확대 될 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
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detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T 세포 매개 면역은 백신 접종 후 또는 자연 감염 후 플라 비 바이러스 감염을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. T 세포의 "품질"은 기능에 의해 평가되어야 하며, 더 높은 기능은 더 강력한 면역 보호와 관련이 있습니다. 단일 세포 수준에서 2개 이상의 사이토카인 또는 케모카인을 동시에 생산할 수 있는 T 세포를 다기능성 T 세포(TPFs)라고 하며, 이는 탈과립 마커(CD107a)를 발현하고 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-2 또는 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α를 분비하는 다양한 분자 메커니즘을 통해 면역 반응을 매개합니다. TPF가 장기 면역 기억 및 보호의 유지와 밀접한 관련이 있으며, 이들의 증가 된 비율이 보호 면역의 중요한 마커이며 바이러스 감염 및 재 활성화의 효과적인 제어에 중요하다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 평가는 특정 면역 반응뿐만 아니라 교차 반응 면역 반응의 평가에도 적용됩니다. 여기서, 일본뇌염 바이러스(JEV)를 예로 들면, 일본뇌염 백신접종을 받은 소아의 말초혈액단핵세포에서 생성되는 JEV 특이적TFs의 검출방법 및 유세포분석 색도를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고자료를 제공하였다.

그림 1은 JE 백신 접종 아동의 대표적인 JEV 자극 그룹에서 CD8+ 또는 CD4+ T세포의 T CM 또는 TEM을 분할하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. FSC-A/SSC-A 점도표는 림프구를 식별하는 데 사용되며 FSC-A/FSC-W 점도표는 단일 세포를 식별하는 데 사용됩니다. 생존 가능한 세포는 살아있는/죽은 / SSC-A 점도표에서 선택됩니다. CD3/SSC-A 점도표는 CD3<sup...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

본 프로토콜은 생체 외 자극과 유세포 분석을 결합하여 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 예방 접종을받은 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 다기능성 T 세포 (TPF) 프로파일을 분석합니다. JEV 특이적 TPF의 검출 방법 및 유세포분석 색 구성표를 테스트하여 유사한 연구에 대한 참조를 제공했습니다.

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

일본뇌염 바이러스 특이적 TPFS의 검출 방법 및 유세포분석 색 체계를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고 자료를 제공하였다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 두 학생 인 Linlin Zhang과 Meng Zhang이 수행합니다. 시작하려면 단일 클론 항체, CD28 및 CD49d, CD107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 농축된 비활성화된 JEV 입자로 JEV 자극 그룹의 PBMC를 자극합니다.이어서, 바이러스 입자가 농축되지 않은 대조군의 PBMCs를 모노클로날 항체, CD28 및 CD49d, CD 107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 자극하였다. 각 그룹으로부터 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 수집한다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 피펫으로 상층액을 제거한다.세포를 PBS 1밀리리터에 재현탁시킨다. 고정 가능한 생존 염료를 세포 현탁액에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 배양합니다. 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 다시 실온에서 5분 동안 500 g으로 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 세포 표면 마커 염색을 수행하려면 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁하고, 각 표면 마커 항체의 2 마이크로리터를 각 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가한다. 튜브를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.500g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다. 다시, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 버린다.고정 및 막 파괴를 수행하려면 500 마이크로 리터의 막 파괴 고정 용액으로 세포를 재현탁하고 실온의 어두운 곳에서 20 분 동안 세포를 고정하십시오. 그 후 500g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거하였다.이어서, 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 세포내 사이토카인 염색을 위해 각각의 튜브 내의 세포 현탁액에 2 마이크로리터의 각 사이토카인 항체를 첨가한다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 다시, 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다.다시 한번, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현 탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 500 마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.PBMC 샘플을 단독으로, 이전에 입증된 바와 같이 단리한 후, 세포 현탁액을 원고에 기재된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 12등분으로 나눕니다. 유사하게, 세포 표면 마커 및 세포내 사이토카인 항체를 첨가한 후, 이전에 입증된 바와 같이, 500 마이크로리터의 PBS를 첨가하여 세포를 재부유시키고 저속으로 와동시킨다. 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 다른 형광 염료 전압을 조정하고 단일 염색 샘플을 사용하여 서로 다른 형광단 사이의 오염 신호를 제거하기 위해 유세포 분석 보상을 조정합니다.전방 산란 영역을 통해 다각형 게이트를 그리고, 측면 산란 영역을 통해 파편을 제외하고 온전한 림프구 집단을 선택하는 도트 플롯, 및 전방 산란 영역을 통해 직사각형 게이트를 그리며, 전방 산란 폭 도트 플롯을 통해 단일 세포를 선택하는 도트 플롯. 다음으로, 살아있는 사각 게이트를 통해 사각 게이트를 그리고, 살아있는 세포를 선택하는 데드 사이드 산점도 영역 도트 플롯을 통해 CD3 측면 산포 영역 도트 플롯을 통해 CD 3개의 양성 T 세포를 식별합니다. 그런 다음 CD4, CD8 도트 플롯을 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 식별하고 CD45RO, CD27 도트 플롯을 통해 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 TCM 및 TEM으로 세분화합니다.CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포의 TCM 또는 TEM으로부터 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 마이크로파지 염증 단백질 중 하나의 알파를 그린 후 각각 다른 반응 패턴의 빈도를 확인하였다. 샘플을 세포분석에 순차적으로 로드합니다. 게이팅 전략은 전방 산란 영역 너비를 사용하여 CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포 및 그 하위 집합의 TCM 또는 TEM을 식별한 다음 측면 산란 영역 점도를 사용하여 사용되었습니다.JEV에 대한 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 반응의 다기능적 특성화는 예방 접종을받지 않은 어린이의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨 2의 증가 된 수준이 JEV 자극 후 예방 접종을받은 어린이의 CD8 양성 TCM 세포에서 검출되었음을 나타냅니다. 그러나, 대식세포 염증성 단백질의 알파 수준은 두 군 간에 차이가 없었다. 백신을 접종하지 않은 그룹과 비교하여 JEV 자극하에 백신 접종 그룹의 CD8 양성 TEM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a 및 인터페론 감마가 검출되었습니다.반면 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 대식세포 염증성 단백질 알파 1은 이들 양성 세포에서 유의하게 상승하지 않았다. JEV 항원은 백신을 접종하지 않은 그룹에 비해 백신을 접종한 그룹의 CD4 양성 TCM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 대식세포 염증 단백질 원 알파를 성공적으로 유도했습니다. 그러나, 인터루킨 2 양성 세포의 비율은 JEV 자극 하에서 두 그룹 간에 차이가 없었다.백신접종군에서 CD107a 양성, 인터페론 감마 양성 및 종양 괴사 인자 알파 양성 서브세트, 서브 CD4 양성 TEM 세포의 비율은 백신접종되지 않은 군에서보다 JEV의 존재 하에서 더 높았다. 자극의 T 세포 면역원성과 호환 가능한 색상 일치 전략은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...