Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

RW ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Etisk godkjenning for denne studien ble innhentet av etikkutvalget for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (Godkjenningsnummer: 2020-k-85). Frivillige ble rekruttert fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver ble tatt fra tilsynelatende friske barn (2 år) som tidligere hadde fått primtall og økt vaksinasjon med levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine i mindre enn et halvt år (JE-vaksinerte barn, n = 5) og uvaksinerte barn (6 måneder, n = 5). Informert s...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Denne protokollen representerer en gjennomførbar flowcytometribasert deteksjonsmetode for TPF-profiler i PBMC-ene til barn vaksinert med JEV-vaksinen SA14-14-2. Denne studien brukte pbmc i venøst blod hos både vaksinerte og uvaksinerte barn som forskningsmateriale. Ved stimulering av PBMC med JEV-antigenet kan de forsterkede antigenspesifikke TPF-enekarakteriseres ved flerfarget flowcytometriantistofffarging. Sammenlignet med den konvensjonelle enzymbundne immunospotanalysemetoden, er flowcytomet...

Japansk encefalittvirus (JEV) er et viktig myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus i Flaviviridae-familien 1. Mange land i Asia og Stillehavsområdet har lenge stått overfor enorme folkehelseutfordringer på grunn av den enorme sykdomsbyrden forårsaket av japansk encefalitt (JE), men dette har forbedret seg dramatisk med den økende tilgjengeligheten av ulike typer vaksinasjoner2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkalt av naturlig infeksjon eller vaksinasjon bidrar til forebygging og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemediert immunitet klassifiseres som adaptiv immunitet, og induksjon av førstnevnte har alltid vært ansett som en sentral strategi i vaksinedesign, om enn med relativt begrenset forståelse i de siste3. Imidlertid har rollen som T-cellemediert immunitet for å begrense flavivirusspredning og virusklarering blitt stadig mer fokusert på og grundig studert4. Videre er T-celleimmunitet ikke bare uunnværlig i JEV-spesifikke antivirale responser, men spiller også en fremtredende rolle i kryssbeskyttelse mot sekundær infeksjon med heterologe flavivirus, noe som er vist i tidligere studier5. Det spekuleres i at denne effekten kan omgå potensielle antistoffmedierte forbedringseffekter ved infeksjon5. Merk at slik kryssreaktiv T-celleimmunitet er viktig, spesielt i fravær av vaksiner og antivirale legemidler mot flavivirus. Selv om mange studier har blitt utført for å bestemme bidraget fra T-celler i JEV-infeksjon med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forblir de respektive linjene som utskiller cytokiner og deres funksjonelle diversifisering ubestemt, noe som betyr at belysningen av de nøyaktige funksjonene til hjelper- og morder-T-celler hindres.
Omfanget av deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten på T-celleresponser. CD4+ eller CD8+ T-celler som kan gi to eller flere funksjoner, inkludert cytokinsekresjon og degranulering, karakteriseres som polyfunksjonelle T-celler (TPFs) ved spesifikk stimulering på enkeltcellenivå8. CD4+ T-celler som produserer enkle eller multiple cytokiner kan ha ulike effekter og immunminner. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mer sannsynlig å danne en langsiktig effektiv beskyttelsesrespons enn IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan brukes som en viktig parameter for å evaluere vaksinasjonseffekten. Frekvensen av IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler er økt hos pasienter med langvarig ikke-progresjon av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos pasienter med AIDS-progresjon er mer tilbøyelige til å produsere IFN-γ alene på grunn av den fremmende effekten av IL-2 på T-celleproliferasjon10. Videre ble en undergruppe av IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ vist å overleve langsiktig in vivo og synergistisk fremme drapsfunksjonen11. Selv om CD8+ T-celler er mer sannsynlig å utvise cytotoksisk aktivitet, er noen CD4+ T-celler også utstyrt med cytotoksisk aktivitet som et indirekte påvist uttrykk for overflate CD107a-molekyler12. I tillegg uttrykker visse T-celleundergrupper kjemokinen MIP-1α, som ofte utskilles av monocytter for å delta i T-cellemediert nøytrofilrekruttering13. På samme måte kan CD8+ TPF-erogså brukes til å karakterisere allsidigheten til markørene ovenfor. Studier har vist at prime-boost-strategien effektivt kan indusere en lengre periode med TPF-beskyttende effekter13, noe som kan forbedre beskyttelsen fremkalt av vaksinasjon. Et sentralt trekk ved undersøkelse av immunsystemet er hukommelses-T-cellers evne til å legge til rette for sterkere, raskere og mer effektive responser på sekundære virale utfordringer enn naive T-celler. Effektorminne T-celler (TEM) og sentrale minne T-celler (TCM) er viktige T-celleundergrupper som ofte differensieres av det sammensatte uttrykket av CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har en tendens til å lokalisere seg i sekundært lymfoid vev, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA-) lokaliserer i lymfoid og perifert vev15,16. TEM gir umiddelbart, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opprettholder responsen ved å spre seg i sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. Således, gitt at minneceller kan formidle spesifikke og effektive tilbakekallingsresponser på virus, oppstår det spørsmål om bidraget fra denne delmengden av polyfunksjoner.
Med utviklingen av flowcytometriteknologi har det blitt vanlig å samtidig oppdage markører på mer enn 10 klynger, fenotyper og differensieringsantigener, noe som er gunstig for mer rikelig å kommentere de funksjonelle immunologiske egenskapene på individuelle T-celler for å redusere feiltolkning og vanskeligheter med å forstå T-cellefenotyper. Denne studien brukte ex vivo-stimulering og flowcytometri for å analysere TPF-profiler i mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) hos JEV-vaksinerte barn. Ved å bruke denne tilnærmingen vil forståelsen av kort- og langsiktig JEV-spesifikk og til og med kryssreaktiv T-celleimmunitet indusert av vaksinasjon bli utvidet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T-cellemediert immunitet spiller en viktig rolle i å kontrollere flavivirusinfeksjon, enten etter vaksinasjon eller etter naturlig infeksjon. "Kvaliteten" til en T-celle må vurderes etter funksjon, og høyere funksjon er forbundet med kraftigere immunforsvar. T-celler som samtidig kan produsere to eller flere cytokiner eller kjemokiner på enkeltcellenivå kalles polyfunksjonelle T-celler (TPFs), som formidler immunresponser gjennom en rekke molekylære mekanismer for å uttrykke degranulasjonsmarkører (CD107a) og utskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2, eller makrofag inflammatorisk protein (MIP)-1α. Det er økende bevis på at TPFs er nært knyttet til vedlikehold av langsiktig immunminne og beskyttelse, og at deres økte andel er en viktig markør for beskyttende immunitet og er viktig i effektiv kontroll av virusinfeksjon og reaktivering. Denne evalueringen gjelder ikke bare for spesifikke immunresponser, men også for vurdering av kryssreaktive immunresponser. Her, med det japanske encefalittviruset (JEV) som et eksempel, ble deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPF-erprodusert av perifere mononukleære celler av barn vaksinert mot japansk encefalitt testet for å gi en referanse for lignende studier.

Figur 1 viser gating-strategien som brukes til å dele TCM eller TEM av CD8 + eller CD4 + T-celler fra en representativ JEV-stimuleringsgruppe av JE-vaksinerte barn. FSC-A / SSC-A dotplottet brukes til å identifisere lymfocytter, og FSC-A / FSC-W dotplottet brukes til å identifisere enkeltceller. Levedyktige celler velges på live / dead / SSC-A dot plot. CD3/SSC-A-punktplottet brukes til å identifisere CD3+ T-cellene. CD4/CD8-punktdi...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Denne protokollen kombinerer ex vivo stimulering og flowcytometri for å analysere polyfunksjonelle T-celle (T PF) profiler i perifere mononukleære celler i blodet (PBMCs) innen japanske encefalittvirus (JEV)-vaksinerte barn. Deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPFer ble testet for å gi en referanse for lignende studier.

Påvisning av polyfunksjonelle T-celler hos barn vaksinert med japansk encefalittvaksine via flowcytometriteknikken

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

Deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet for japansk encefalittvirusspesifikk TPFS ble testet for å gi en referanse for lignende studier. Demonstrere prosedyren vil bli utført av Linlin Zhang og Meng Zhang, to studenter fra vårt laboratorium. Til å begynne med stimulere PBMC-ene til JEV-stimuleringsgruppen med konsentrerte inaktiverte JEV-partikler i 16 timer ved 37 grader Celsius i nærvær av monoklonale antistoffer, CD28 og CD49d, CD107a, GolgiPlug og monensin.Deretter stimulerer PBMC-ene i kontrollgruppen uten konsentrerte viruspartikler i 16 timer ved 37 grader Celsius i nærvær av monoklonale antistoffer, CD28 og CD49d, CD 107a, GolgiPlug og monensin. Samle cellesuspensjonen fra hver gruppe i et 1, 5 milliliter mikrocentrifugerør. Sentrifuge ved 500 g i fem minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten med en pipette.Resuspend cellene i 1 milliliter PBS. Tilsett fikserbart levedyktighetsfargestoff til cellesuspensjonen og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Sentrifuge ved 500 g ved romtemperatur i fem minutter, og fjern supernatanten.Etter resuspending cellene i 1 milliliter PBS, igjen, sentrifuge ved 500 g ved romtemperatur i fem minutter og kast supernatanten som vist tidligere. For å utføre farging av celleoverflatemarkører, resuspendere cellene i 100 mikroliter PBS, og tilsett to mikroliter av hvert overflatemarkørantistoff til cellesuspensjonen i hvert rør. Inkuber rørene i 30 minutter ved romtemperatur mens du beskytter dem mot lys.Sentrifuge ved 500 g i fem minutter og fjern supernatanten som vist tidligere. Igjen, resuspend cellene i en milliliter PBS. Sentrifuge ved 500 g i fem minutter ved romtemperatur og kast supernatanten forsiktig.For å utføre fiksering og membranbrudd, resuspend cellene med 500 mikroliter membranbrytende fikseringsløsning og fest cellene i 20 minutter i mørket ved romtemperatur. Sentrifuger deretter ved 500 g i fem minutter og fjern supernatanten. Etter å ha resuspendert cellene i en milliliter PBS, sentrifuger i fem minutter ved 500 g ved romtemperatur og fjern supernatanten forsiktig, som vist tidligere.Deretter resuspenderer cellene i 100 mikroliter PBS og tilsett to mikroliter av hvert cytokinantistoff til cellesuspensjonen i hvert rør for intracellulær cytokinfarging. Inkuber rørene i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Igjen, sentrifuger ved 500 g i fem minutter, og fjern supernatanten som vist tidligere.Igjen, resuspend cellene i en milliliter PBS. Sentrifuge ved 500 g i fem minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten forsiktig som vist tidligere. Deretter legger du til 500 mikroliter PBS for å resuspendere cellene.Etter å ha isolert PBMC-prøven alene, som vist tidligere, del cellesuspensjonen i 12 like deler i 1,5 milliliter mikrosentrifugerør beskrevet i manuskriptet. På samme måte, etter å ha tilsatt celleoverflatemarkørene og intracellulært cytokinantistoff, som vist tidligere, tilsett 500 mikroliter PBS for å resuspendere cellene og virvelen med lav hastighet. Bruk en ufarget prøve, juster fremoverspredningen, sidespredningen og forskjellige fluorescerende fargespenninger, mens du justerer flowcytometrikompensasjonen for å eliminere forurensningssignalene mellom de forskjellige fluoroforene, ved hjelp av enkeltfargeprøvene.Tegn en polygonport gjennom det fremre spredningsområdet, sidespredningsområdet prikkplott for å velge den intakte lymfocyttpopulasjonen, mens du ekskluderer ruskene, og en rektangulær port gjennom det fremre spredningsområdet, fremover spredningsbreddepunktplott for å velge enkeltcellene. Deretter tegner du en rektangulær port gjennom punktdiagrammet for levende sider, død side for å velge de levende cellene, og en rektangulær port gjennom CD3-sidespredningsområdets punktplott for å identifisere CDens tre positive T-celler. Tegn deretter en quad-port gjennom CD4, CD8-punktplottet for å identifisere CD4-positive eller CD8-positive T-celler og gjennom CD45RO, CD27-punktplottet for å dele CD4-positive eller CD8-positive T-celler inn i TCM og TEM.Etter å ha tegnet portene til CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa, interleukin 2 og mikrofaginflammatorisk protein en alfa fra TCM eller TEM av henholdsvis CD8-positive eller CD4-positive T-celler for å bestemme frekvensen av forskjellige responsmønstre. Legg prøvene på cytometrien sekvensielt. Gating-strategien ble brukt til å identifisere TCM eller TEM for CD8-positive eller CD4-positive T-celler og deres delmengder ved hjelp av bredden av spredningsområdet, deretter sidespredningsområdets prikkplott.Den polyfunksjonelle karakteriseringen av CD4-positive og CD8-positive T-celleresponser på JEV indikerte at økte nivåer av CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa og interleukin 2 ble påvist i CD8-positive TCM-celler hos de vaksinerte barna etter JEV-stimulering sammenlignet med de hos uvaksinerte barn. Nivået av makrofag inflammatorisk protein en alfa var imidlertid ikke forskjellig mellom de to gruppene. Høyere nivåer av CD107a og interferon gamma ble påvist i CD8-positive TEM-celler i den vaksinerte gruppen under JEV-stimulering sammenlignet med den uvaksinerte gruppen.Mens tumornekrosefaktor alfa, interleukin 2 og makrofag inflammatorisk protein en alfa, ikke var signifikant forhøyet i de positive cellene. JEV-antigenet induserte vellykket høyere nivåer av CD107a, interferon gamma, tumornekrosefaktor alfa og makrofaginflammatorisk protein en alfa i CD4-positive TCM-celler i den vaksinerte gruppen sammenlignet med den uvaksinerte gruppen. Andelen interleukin 2 positive celler var imidlertid ikke forskjellig mellom de to gruppene under JEV-stimulering.Andelen CD107a-positive, interferon gamma-positive og tumornekrosefaktor alfa-positive undergrupper, sub-CD4-positive TEM-celler i den vaksinerte gruppen var høyere i nærvær av JEV, enn i den uvaksinerte gruppen. T-celleimmunogenisiteten til stimuliene og de kompatible fargetilpasningsstrategiene er kritiske trinn i denne protokollen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolering av mus nyre-resident CD8+ T celler for Flow Cytometry Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...