Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim da China (7222059). A ZD.X. foi apoiada pelo Fundo de Inovação CAMS para as Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).

A aprovação ética para o presente estudo foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). Os voluntários foram recrutados no Hospital Infantil de Pequim, na Universidade Médica da Capital. Amostras de sangue venoso periférico foram obtidas de crianças aparentemente saudáveis (2 anos de idade) que já haviam recebido uma vacinação primária e reforçada com a vacina JE SA14-14-2 viva atenuada por menos de meio ano (crianças vacinad...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Este protocolo representa um método viável de detecção baseado em citometria de fluxo para perfis de TPF nos PBMCs de crianças vacinadas com a vacina JEV SA14-14-2. Este estudo utilizou como material de pesquisa os PBMCs de sangue venoso de crianças vacinadas e não vacinadas. Com a estimulação de PBMCs com o antígeno JEV,esses PFsT específicos de antígeno amplificados podem ser caracterizados pela coloração de anticorpos de citometria de fluxo multicolorida. Em comparação com o méto...

O vírus da encefalite japonesa (JEV) é um importante vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae1. Muitos países da Ásia-Pacífico há muito enfrentam enormes desafios de saúde pública devido à enorme carga de doenças causadas pela encefalite japonesa (JE), mas isso melhorou drasticamente com a crescente disponibilidade de vários tipos de vacinas2. As respostas imunes protetoras adaptativas evocadas pela infecção natural ou vacinação contribuem para a prevenção e regulação antiviral. A imunidade humoral e a imunidade mediada por células são classificadas como imunidade adaptativa, e a indução da primeira sempre foi considerada uma estratégia-chave no desenho da vacina, embora com compreensão relativamente limitada no passado3. No entanto, o papel da imunidade mediada por células T na limitação da disseminação e depuração do flavivírus tem sido cada vez mais focado e extensivamente estudado4. Além disso, a imunidade das células T não é apenas indispensável nas respostas antivirais específicas do JEV, mas também desempenha um papel proeminente na proteção cruzada contra infecção secundária por flavivírus heterólogos, o que foi demonstrado em estudos anteriores5. Especula-se que esse efeito possa ignorar potenciais efeitos de realce mediados por anticorpos na infecção5. É importante ressaltar que essa imunidade de células T reativas cruzadas é importante, especialmente na ausência de vacinas e medicamentos antivirais contra flavivírus. Embora muitos estudos tenham sido realizados para determinar a contribuição das células T na infecção por JEV em relação às células T CD4+ e CD8+ 6,7, as respectivas linhagens secretoras de citocinas e sua diversificação funcional permanecem indeterminadas, o que significa que a elucidação das funções exatas das células T auxiliares e assassinas é dificultada.
A escala de suas defesas antivirais determina a qualidade das respostas das células T. As células T CD4+ ou CD8+ que podem conferir de forma compatível duas ou mais funções, incluindo secreção e degranulação de citocinas, são caracterizadas como células T polifuncionais (TPFs) após estimulação específica no nível de célula única8. As células T CD4+ que produzem citocinas únicas ou múltiplas podem ter vários efeitos e memórias imunológicas. Por exemplo, as células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ são mais propensas a formar uma resposta protetora eficaz a longo prazo do que as células T IL-2+ CD4+ 9, que podem ser usadas como um parâmetro importante na avaliação do efeito da vacinação. A frequência de IL-2+ IFN-γ+ células T CD4+ está aumentada em pacientes com não progressão a longo prazo da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), enquanto as células T CD4+ em pacientes com progressão da AIDS estão mais inclinadas a produzir IFN-γ isoladamente devido ao efeito promotor da IL-2 na proliferação de células T10. Além disso, um subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ demonstrou sobreviver a longo prazo in vivo e promover sinergicamente a função de morte11. Embora as células T CD8+ sejam mais propensas a exibir atividade citotóxica, algumas células T CD4+ também estão equipadas com atividade citotóxica como uma expressão indiretamente detectada de moléculas CD107a de superfície12. Além disso, certos subconjuntos de células T expressam a quimiocina MIP-1α, que é frequentemente secretada pelos monócitos para participar do recrutamento de neutrófilos mediados por células T13. Da mesma forma, o CD8+ TPFs também pode ser usado para caracterizar a versatilidade dos marcadores acima. Estudos têm demonstrado que a estratégia prime-boost pode efetivamente induzir um período prolongado de efeitos protetores da TPF 13, o que pode aumentar a proteção provocada pela vacinação. Uma característica central no exame do sistema imunológico é a capacidade das células T de memória de facilitar respostas mais fortes, rápidas e eficazes a desafios virais secundários do que as células T ingênuas. As células T de memória efetora (T EM) e as células T de memória central (TCM) são subconjuntos importantes de células T que são frequentemente diferenciados pela expressão composta de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. O TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) tende a se localizar nos tecidos linfoides secundários, enquanto o TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) localiza-se nos tecidos linfoides e periféricos 15,16. O TEM fornece defesa imediata, mas não sustentada, enquanto o TCM sustenta a resposta proliferando nos órgãos linfoides secundários e gerando novos efetores17. Assim, dado que as células de memória podem mediar respostas de recordação específicas e eficientes aos vírus, surgem questões sobre a contribuição desse subconjunto de polifunções.
Com o desenvolvimento da tecnologia de citometria de fluxo, tornou-se comum detectar simultaneamente marcadores de mais de 10 clusters, fenótipos e antígenos de diferenciação, o que é benéfico para anotar mais abundantemente as características imunológicas funcionais em células T individuais para reduzir a má interpretação e as dificuldades na compreensão dos fenótipos de células T. Este estudo utilizou estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis de TPF em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com JEV. Aplicando essa abordagem, a compreensão da imunidade de células T específica de JEV de curto e longo prazo e até mesmo cruzada reativa induzida pela vacinação será expandida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

A imunidade mediada por células T desempenha um papel importante no controle da infecção por flavivírus, seja após a vacinação ou após a infecção natural. A "qualidade" de uma célula T precisa ser avaliada por função, e uma função mais alta está associada a uma proteção imunológica mais poderosa. As células T que podem produzir simultaneamente duas ou mais citocinas ou quimiocinas no nível de célula única são chamadas de células T polifuncionais (TPFs), que medeiam respostas imunes através de uma variedade de mecanismos moleculares para expressar marcadores de degranulação (CD107a) e secretar interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 ou proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1α. Há evidências crescentes de que asT PFestão intimamente relacionadas à manutenção da memória e proteção imunológica a longo prazo e que sua proporção aumentada é um importante marcador de imunidade protetora e é importante no controle efetivo da infecção viral e reativação. Esta avaliação aplica-se não só a respostas imunitárias específicas, mas também à avaliação de respostas imunitárias reativas cruzadas. Aqui, tomando o vírus da encefalite japonesa (JEV) como exemplo, o método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFespecíficos do JEV produzidos por células mononucleares do sangue periférico de crianças vacinadas contra a encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.

A Figura 1 mostra a estratégia de gating utilizada para dividir o TCM ou TEM de células T CD8+ ou CD4+ de um grupo representativo de estimulação JEV de crianças vacinadas com JE. O gráfico de pontos FSC-A/SSC-A é usado para identificar linfócitos, e o gráfico de pontos FSC-A/FSC-W é usado para identificar células individuais. As células viáveis são selecionadas no gráfico de pontos vivo/morto/SSC-A. O gráfico de pontos CD3/SSC-A é ...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.

Detecção de Células T Polifuncionais em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa através da Técnica de Citometria de Fluxo

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo do TPFS específico do vírus da encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes. A demonstração do procedimento será realizada por Linlin Zhang e Meng Zhang, dois alunos do nosso laboratório. Para começar, estimule os PBMCs do grupo de estimulação JEV com partículas concentradas inativadas de JEV por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD107a, GolgiPlug e monensina.Em seguida, estimular os PBMCs do grupo controle sem partículas virais concentradas por 16 horas a 37 graus Celsius na presença de anticorpos monoclonais, CD28 e CD49d, CD 107a, GolgiPlug e monensina. Recolher a suspensão celular de cada grupo num tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com uma pipeta.Ressuspenda as células em 1 mililitro de PBS. Adicione corante de viabilidade fixável à suspensão celular e incube por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar a 500 g à temperatura ambiente durante cinco minutos e remover o sobrenadante.Depois de ressuspender as células em 1 mililitro de PBS, novamente, centrifugar a 500 g à temperatura ambiente por cinco minutos e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Para realizar a coloração do marcador de superfície celular, ressuscite as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo marcador de superfície à suspensão celular em cada tubo. Incubar os tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente, protegendo-os da luz.Centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Novamente, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.Para realizar a fixação e quebra da membrana, ressuspeite as células com 500 microlitros de solução fixadora que quebra a membrana e fixe as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a 500 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Depois de ressuspender as células em um mililitro de PBS, centrifugar por cinco minutos a 500 g à temperatura ambiente e remover o sobrenadante com cuidado, como demonstrado anteriormente.Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS e adicione dois microlitros de cada anticorpo de citocina à suspensão celular em cada tubo para coloração de citocinas intracelulares. Incubar os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Novamente, centrifugar a 500 g por cinco minutos e remover o sobrenadante como demonstrado anteriormente.Mais uma vez, ressuspenda as células em um mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover cuidadosamente o sobrenadante, tal como demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células.Após o isolamento da amostra PBMC isoladamente, como demonstrado anteriormente, divida a suspensão celular em 12 partes iguais em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro descritos no manuscrito. Da mesma forma, após a adição dos marcadores de superfície celular e anticorpo de citocinas intracelulares, como demonstrado anteriormente, adicione 500 microlitros de PBS para ressuspender as células e o vórtice com baixa velocidade. Usando uma amostra não corada, ajuste o espalhamento para a frente, o espalhamento lateral e diferentes tensões de corante fluorescente, enquanto ajusta a compensação da citometria de fluxo para eliminar os sinais de contaminação entre os diferentes fluoróforos, usando as amostras de coloração única.Desenhe um portão de polígono através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos da área de dispersão lateral para selecionar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos, e uma porta retangular através da área de dispersão para a frente, gráfico de pontos de largura de dispersão para a frente para selecionar as células únicas. Em seguida, desenhe um portão retangular através do gráfico de pontos de área de dispersão do lado morto e morto para selecionar as células vivas e um portão retangular através do gráfico de pontos da área de dispersão lateral CD3 para identificar o CD três células T positivas. Em seguida, desenhe uma porta quádrupla através do gráfico de pontos CD4, CD8 para identificar as células T CD4 positivas ou CD8 positivas e através do gráfico de pontos CD45RO, CD27 para subdividir as células T CD4 positivas ou CD8 positivas em MTC e TEM.Depois de desenhar as portas de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa, interleucina 2 e micrófago proteína inflamatória um alfa do TCM ou MET das células T CD8 positivas ou CD4 positivas para determinar a frequência de diferentes padrões de resposta, respectivamente. Carregue as amostras na citometria sequencialmente. A estratégia de gating foi empregada para identificar o TCM ou MET de células T CD8 positivas ou CD4 positivas e seus subconjuntos usando a largura da área de dispersão para frente e, em seguida, o gráfico de pontos da área de dispersão lateral.A caracterização polifuncional das respostas de células T CD4 positivas e CD8 positivas ao JEV indicou que níveis aumentados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e interleucina 2 foram detectados nas células TCM CD8 positivas das crianças vacinadas após estimulação JEV em comparação com aquelas em crianças não vacinadas. No entanto, o nível de macrófago inflamatório proteína um alfa não diferiu entre os dois grupos. Níveis mais elevados de CD107a e interferão gama foram detectados nas células TEM CD8 positivas do grupo vacinado sob estimulação JEV em comparação com o grupo não vacinado.Considerando que o fator de necrose tumoral alfa, a interleucina 2 e a proteína inflamatória de macrófagos um alfa não foram significativamente elevados nessas células positivas. O antígeno JEV induziu com sucesso níveis mais elevados de CD107a, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa e proteína inflamatória de macrófagos um alfa nas células TCM CD4 positivas do grupo vacinado em comparação com o grupo não vacinado. No entanto, a proporção de células positivas para interleucina 2 não diferiu entre os dois grupos sob estimulação JEV.A proporção de células TEM CD107a positivas, interferon gama positivas e fator de necrose tumoral alfa positivas, sub-CD4 positivas no grupo vacinado foi maior na presença de JEV, do que no grupo não vacinado. A imunogenicidade das células T dos estímulos e as estratégias de correspondência de cores compatíveis são etapas críticas neste protocolo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...