Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (7222059). ZD.X. fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).

La aprobación ética para el presente estudio fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital (Número de aprobación: 2020-k-85). Los voluntarios fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Se obtuvieron muestras de sangre venosa periférica de niños aparentemente sanos (2 años de edad) que habían recibido previamente una vacuna principal y potenciada con la vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada durante menos de medio año (niños...

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	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Este protocolo representa un método de detección factible basado en citometría de flujo para perfiles deT PF en las PBMC de niños vacunados con la vacuna JEV SA14-14-2. Este estudio utilizó las PBMC de sangre venosa de niños vacunados y no vacunados como materiales de investigación. Con la estimulación de PBMC con el antígeno JEV, esos antígenosT PFespecíficos amplificados pueden caracterizarse por tinción de anticuerpos de citometría de flujo multicolor. En comparación con el método ...

El virus de la encefalitis japonesa (JEV) es un importante virus transmitido por mosquitos perteneciente al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae1. Muchos países de Asia y el Pacífico han enfrentado durante mucho tiempo enormes desafíos de salud pública debido a la enorme carga de enfermedad causada por la encefalitis japonesa (EJ), pero esto ha mejorado dramáticamente con la creciente disponibilidad de varios tipos de vacunas2. Las respuestas inmunes protectoras adaptativas evocadas por la infección natural o la vacunación contribuyen a la prevención y la regulación antiviral. La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células se clasifican como inmunidad adaptativa, y la inducción de la primera siempre se ha considerado como una estrategia clave en el diseño de vacunas, aunque con una comprensión relativamente limitada en los últimos3. Sin embargo, el papel de la inmunidad mediada por células T en la limitación de la diseminación del flavivirus y la eliminación del virus se ha centrado cada vez más y se ha estudiado ampliamente4. Además, la inmunidad de las células T no solo es indispensable en las respuestas antivirales específicas del JEV, sino que también desempeña un papel destacado en la protección cruzada contra la infección secundaria con flavivirus heterólogos, lo que se ha demostrado en estudios previos5. Se especula que este efecto puede pasar por alto los posibles efectos de mejora mediados por anticuerpos en la infección5. Cabe destacar que tal inmunidad de células T de reacción cruzada es importante, especialmente en ausencia de vacunas y medicamentos antivirales contra los flavivirus. Aunque se han realizado muchos estudios para determinar la contribución de las células T en la infección por JEV con respecto a las células T CD4+ y CD8+ 6,7, los respectivos linajes secretores de citoquinas y su diversificación funcional permanecen indeterminados, lo que significa que la elucidación de las funciones exactas de las células T auxiliares y asesinas se ve obstaculizada.
La escala de sus defensas antivirales determina la calidad de las respuestas de las células T. Las células T CD4+ o CD8+ que pueden conferir de manera compatible dos o más funciones, incluida la secreción de citoquinas y la desgranulación, se caracterizan como células Tpolifuncionales (T PF) tras la estimulación específica a nivel de una sola célula8. Las células T CD4+ que producen citoquinas únicas o múltiples pueden tener varios efectos y memorias inmunitarias. Por ejemplo, las células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ tienen más probabilidades de formar una respuesta protectora efectiva a largo plazoque las células T IL-2+ CD4+ 9, que pueden usarse como un parámetro importante para evaluar el efecto de la vacunación. La frecuencia de IL-2+ IFN-γ+ linfocitos T CD4+ aumenta en pacientes con no progresión a largo plazo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), mientras que los linfocitos T CD4+ en pacientes con progresión del SIDA son más propensos a producir IFN-γ solo debido al efecto promotor de IL-2 sobre la proliferación de linfocitos T10. Además, se demostró que un subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ sobrevive a largo plazo in vivo y promueve sinérgicamente la función de matar11. Aunque las células T CD8+ tienen más probabilidades de exhibir actividad citotóxica, algunas células T CD4+ también están equipadas con actividad citotóxica como expresión detectada indirectamente de moléculas CD107a de superficie12. Además, ciertos subconjuntos de células T expresan la quimiocina MIP-1α, que a menudo es secretada por monocitos para participar en el reclutamiento de neutrófilos mediado por células T13. Del mismo modo, CD8 + TPFs también se puede utilizar para caracterizar la versatilidad de los marcadores anteriores. Los estudios han demostrado que la estrategia prime-boost puede inducir eficazmente un período prolongado de efectos protectores de TPF 13, lo que puede mejorar la protección provocada por la vacunación. Una característica central en el examen del sistema inmune es la capacidad de las células T de memoria para facilitar respuestas más fuertes, más rápidas y más efectivas a los desafíos virales secundarios que las células T ingenuas. Las células T de memoria efectora (TEM) y las células T de memoria central (TCM) son subconjuntos importantes de células T que a menudo se diferencian por la expresión compuesta de CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. LaCM T (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tiende a localizarse en tejidos linfoides secundarios, mientras que laEM T (CD27- CD45RO+ o CCR7- CD45RA-) se localiza en tejidos linfoides y periféricos 15,16. LaEM T proporciona una defensa inmediata pero no sostenida, mientras quela CM T sostiene la respuesta proliferando en los órganos linfoides secundarios y generando nuevos efectores17. Por lo tanto, dado que las células de memoria pueden mediar respuestas de recuerdo específicas y eficientes a los virus, surgen preguntas sobre la contribución de este subconjunto de polifunciones.
Con el desarrollo de la tecnología de citometría de flujo, se ha vuelto común detectar simultáneamente marcadores de más de 10 grupos, fenotipos y antígenos de diferenciación, lo que es beneficioso para anotar más abundantemente las características inmunológicas funcionales en las células T individuales para reducir la mala interpretación y las dificultades en la comprensión de los fenotipos de células T. Este estudio utilizó estimulación ex vivo y citometría de flujo para analizar los perfiles de TPF en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados con JEV. Aplicando este enfoque, se ampliará la comprensión de la inmunidad de células T específica de JEV e incluso de reacción cruzada a corto y largo plazo inducida por la vacunación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

La inmunidad mediada por células T juega un papel importante en el control de la infección por flavivirus, ya sea después de la vacunación o después de una infección natural. La "calidad" de una célula T debe evaluarse por función, y una mayor función se asocia con una protección inmune más potente. Las células T que pueden producir simultáneamente dos o más citoquinas o quimiocinas a nivel de una sola célula se denominan células T polifuncionales (TPFs), que median las respuestas inmunes a través de una variedad de mecanismos moleculares para expresar marcadores de desgranulación (CD107a) y secretar interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 o proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α. Cada vez hay más pruebas de que losPFT están estrechamente relacionados con el mantenimiento de la memoria y la protección inmunitaria a largo plazo y que su mayor proporción es un marcador importante de inmunidad protectora y es importante en el control efectivo de la infección viral y la reactivación. Esta evaluación se aplica no solo a respuestas inmunes específicas, sino también a la evaluación de respuestas inmunes de reacción cruzada. Aquí, tomando el virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de TPFespecíficos de JEV producidos por células mononucleares de sangre periférica de niños vacunados contra la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.

La Figura 1 muestra la estrategia de activación utilizada para dividirla CM T ola EM T de las células T CD8+ o CD4+ de un grupo representativo de estimulación JEV de niños vacunados con JE. El diagrama de puntos FSC-A/SSC-A se utiliza para identificar linfocitos, y el diagrama de puntos FSC-A/FSC-W se utiliza para identificar células individuales. Las células viables se seleccionan en el diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A. El diagrama de pu...

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Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

El presente protocolo combina la estimulación ex vivo y la citometría de flujo para analizar los perfiles de células T polifuncionales (T PF) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados contra el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de los TPF específicos de JEV se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.

Detección de células T polifuncionales en niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa mediante la técnica de citometría de flujo

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo del TPFS específico del virus de la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares. La demostración del procedimiento será realizada por Linlin Zhang y Meng Zhang, dos estudiantes de nuestro laboratorio. Para comenzar, estimule las PBMC del grupo de estimulación JEV con partículas JEV inactivadas concentradas durante 16 horas a 37 grados centígrados en presencia de anticuerpos monoclonales, CD28 y CD49d, CD107a, GolgiPlug y monensina.Luego, estimular las PBMC del grupo control sin partículas virales concentradas durante 16 horas a 37 grados centígrados en presencia de anticuerpos monoclonales, CD28 y CD49d, CD 107a, GolgiPlug y monensina. Recoja la suspensión celular de cada grupo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con una pipeta.Resuspender las células en 1 mililitro de PBS. Agregue un tinte de viabilidad reparable a la suspensión celular e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar a 500 g a temperatura ambiente durante cinco minutos y retirar el sobrenadante.Después de resuspender las células en 1 mililitro de PBS, nuevamente, centrifugar a 500 g a temperatura ambiente durante cinco minutos y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Para realizar la tinción del marcador de superficie celular, resuspenda las células en 100 microlitros de PBS y agregue dos microlitros de cada anticuerpo marcador de superficie a la suspensión celular en cada tubo. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras los protege de la luz.Centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Nuevamente, resuspenda las células en un mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con cuidado.Para realizar la fijación y la rotura de la membrana, resuspenda las células con 500 microlitros de solución fijadora que rompe la membrana y fije las células durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante. Después de resuspender las células en un mililitro de PBS, centrifugar durante cinco minutos a 500 g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado, como se demostró anteriormente.Luego, resuspenda las células en 100 microlitros de PBS y agregue dos microlitros de cada anticuerpo de citoquinas a la suspensión celular en cada tubo para la tinción intracelular de citoquinas. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Nuevamente, centrifugar a 500 g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante como se demostró anteriormente.Una vez más, resuspender las células en un mililitro de PBS. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante con cuidado como se demostró anteriormente. Luego, agregue 500 microlitros de PBS para resuspender las células.Después de aislar solo la muestra de PBMC, como se demostró anteriormente, divida la suspensión celular en 12 partes iguales en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros descritos en el manuscrito. Del mismo modo, después de agregar los marcadores de superficie celular y el anticuerpo de citoquinas intracelulares, como se demostró anteriormente, agregue 500 microlitros de PBS para resuspender las células y el vórtice con baja velocidad. Usando una muestra no teñida, ajuste la dispersión directa, la dispersión lateral y diferentes voltajes de colorante fluorescente, mientras ajusta la compensación de citometría de flujo para eliminar las señales de contaminación entre los diferentes fluoróforos, utilizando las muestras de tinción únicas.Dibuje una puerta poligonal a través del área de dispersión hacia adelante, el diagrama de puntos del área de dispersión lateral para seleccionar la población de linfocitos intacta, excluyendo los desechos, y una puerta rectangular a través del área de dispersión hacia adelante, un diagrama de puntos de ancho de dispersión hacia adelante para seleccionar las celdas individuales. A continuación, dibuje una puerta rectangular a través del diagrama de puntos de área de dispersión del lado muerto vivo para seleccionar las celdas vivas, y una puerta rectangular a través del diagrama de puntos del área de dispersión lateral CD3 para identificar las tres células T positivas del CD. Luego, dibuje una puerta cuádruple a través del diagrama de puntos CD4, CD8 para identificar las células T CD4 positivas o CD8 positivas y a través del diagrama de puntos CD45RO, CD27 para subdividir las células T CD4 positivas o CD8 positivas en MTC y TEM.Después de dibujar las puertas de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 2 y proteína inflamatoria de microfagos una alfa de la MTC o TEM de las células T CD8 positivas o CD4 positivas para determinar la frecuencia de diferentes patrones de respuesta respectivamente. Cargue las muestras en la citometría secuencialmente. La estrategia de compuerta se empleó para identificar la MTC o TEM de las células T CD8 positivas o CD4 positivas y sus subconjuntos utilizando el ancho del área de dispersión hacia adelante, luego el diagrama de puntos del área de dispersión lateral.La caracterización polifuncional de las respuestas de células T CD4 positivas y CD8 positivas a JEV indicó que se detectaron niveles aumentados de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa e interleucina 2 en las células TCM CD8 positivas de los niños vacunados después de la estimulación JEV en comparación con aquellos en niños no vacunados. Sin embargo, el nivel de proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa no difirió entre los dos grupos. Se detectaron niveles más altos de CD107a e interferón gamma en las células TEM CD8 positivas del grupo vacunado bajo estimulación JEV en comparación con el grupo no vacunado.Mientras que el factor de necrosis tumoral alfa, la interleucina 2 y la proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa, no estaban significativamente elevados en esas células positivas. El antígeno JEV indujo con éxito niveles más altos de CD107a, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa y proteína inflamatoria de macrófagos uno alfa en las células CD4 positivas para la MTC del grupo vacunado en comparación con el grupo no vacunado. Sin embargo, la proporción de células positivas para interleucina 2 no difirió entre los dos grupos bajo estimulación JEV.La proporción de subconjuntos CD107a positivos, interferón gamma positivos y factor de necrosis tumoral alfa positivo, células TEM sub CD4 positivas en el grupo vacunado fue mayor en presencia de JEV que en el grupo no vacunado. La inmunogenicidad de las células T de los estímulos y las estrategias de coincidencia de color compatibles son pasos críticos en este protocolo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

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Investigación

Inmunología e Infección

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Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

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El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

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Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

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Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

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Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...