Name: detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

R.W., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Çin Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) tarafından desteklenmiştir. ZD.X., CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmanın etik onayı, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: 2020-k-85). Gönüllüler, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi'nden işe alındı. Periferik venöz kan örnekleri, daha önce yarım yıldan az bir süredir canlı zayıflatılmış JE SA14-14-2 aşısı ile asal ve güçlendirilmiş aşılama almış (JE aşılı çocuklar, n = 5) ve aşılanmamış çocuklardan (6 aylık, n = 5) görünüşte sağlıklı çocuklardan ...

<ol>
	<li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes:+A+review+of+vector+competence,+vector+capacity+and+mosquito+immunity.">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China:+A+national+cross-sectional+study.">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children.">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting.">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine.">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li><li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response,+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression,+and+a+decreased+frequency+of+CD4(+)CD8(+)+double-positive+T+cells.">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).</li><li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function.">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).</li><li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines.">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).</li><li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+IFNgamma(-)IL-2(+)+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza.">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275 (2013).</li><li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma+IL-2++and+CD28+IL-2++CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection.">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li><li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2,+IL-4,+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1/2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells.">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li><li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine-induced+CD107a++CD4++T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection.">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li><li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer.">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).</li><li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models.">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li><li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4++T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study.">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8(+)+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion.">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).</li><li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+memory+T+cells.">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li><li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents.">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li><li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system.">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM/E+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain.">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China.">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4(+)+T+cells+in+COVID-19.">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li><li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+(EBV)-specific+CD4(+)+and+CD8(+)+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins.">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li></ol>

Bu protokol, JEV aşısı SA14-14-2 ile aşılanan çocukların PBMC'lerinde TPF profilleri için uygulanabilir bir akış sitometrisi tabanlı tespit yöntemini temsil eder. Bu çalışmada hem aşılanmış hem de aşılanmamış çocukların venöz kan PBMC'leri araştırma materyali olarak kullanılmıştır. PBMC'lerin JEV antijeni ile uyarılmasıyla, bu güçlendirilmiş antijene özgü TPFs, çok renkli akış sitometrisi antikor boyaması ile karakterize edilebilir. Geleneksel enzime bağl?...

Japon ensefalit virüsü (JEV), Flaviviridae familyası1 içindeki Flavivirus cinsine ait önemli bir sivrisinek kaynaklı virüstür. Birçok Asya-Pasifik ülkesi, Japon ensefalitinin (JE) neden olduğu büyük hastalık yükü nedeniyle uzun zamandır muazzam halk sağlığı zorluklarıyla karşı karşıya kalmıştır, ancak bu, çeşitli aşı türlerinin artan kullanılabilirliği ile çarpıcı bir şekilde iyileşmiştir2. Doğal enfeksiyon veya aşılama ile uyarlanan adaptif koruyucu immün yanıtlar, önleme ve antiviral düzenlemeye katkıda bulunur. Humoral immünite ve hücre aracılı immünite, adaptif immünite olarak sınıflandırılır ve birincisinin indüksiyonu, son3'te nispeten sınırlı bir anlayışla da olsa, aşı tasarımında her zaman kilit bir strateji olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, flavivirüs yayılımını ve virüs klerensini sınırlamada T hücresi aracılı bağışıklığın rolü giderek daha fazla odaklanmış ve kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır4. Ayrıca, T hücresi bağışıklığı sadece JEV'e özgü antiviral yanıtlarda vazgeçilmez olmakla kalmaz, aynı zamanda önceki çalışmalarda gösterildiği gibi heterolog flavivirüslerle sekonder enfeksiyondan çapraz korunmada da önemli bir rol oynar5. Bu etkinin enfeksiyon5'teki potansiyel antikor aracılı geliştirme etkilerini atlayabileceği düşünülmektedir. Not olarak, bu tür çapraz reaktif T hücresi bağışıklığı, özellikle flavivirüslere karşı aşıların ve antiviral ilaçların yokluğunda önemlidir. JEV enfeksiyonunda T hücrelerinin CD4+ ve CD8+ T hücreleri 6,7'ye göre katkısını belirlemek için birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen, sitokinleri salgılayan ilgili soylar ve fonksiyonel çeşitliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da yardımcı ve öldürücü T hücrelerinin kesin fonksiyonlarının aydınlatılmasının engellendiği anlamına gelmektedir.
Antiviral savunmalarının ölçeği, T hücresi yanıtlarının kalitesini belirler. Sitokin sekresyonu ve degranülasyon dahil olmak üzere iki veya daha fazla fonksiyonu uyumlu bir şekilde verebilen CD4 + veya CD8 + T hücreleri, tek hücreli seviye8'de spesifik stimülasyon üzerine çok fonksiyonlu T hücreleri (TPFs) olarak karakterize edilir. Tek veya çoklu sitokinler üreten CD4 + T hücrelerinin çeşitli etkileri ve bağışıklık hafızaları olabilir. Örneğin, IL-2 + IFN-γ + CD4 + T hücrelerinin, aşılama etkisinin değerlendirilmesinde önemli bir parametre olarak kullanılabilecek IL-2 + CD4 + T hücreleri9'dan uzun süreli etkili bir koruyucu yanıt oluşturma olasılığı daha yüksektir. Edinilmiş immün yetmezlik sendromunun (AIDS) uzun süreli ilerlememesi olan hastalarda IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T hücrelerinin sıklığı artarken, AIDS progresyonu olan hastalarda CD4+ T hücreleri, IL-2'nin T hücre proliferasyonu üzerindeki destekleyici etkisi nedeniyle tek başına IFN-γ üretmeye daha yatkındır10. Ayrıca, IL-2 + IFN-γ + TNF-α + 'nın bir alt kümesinin in vivo olarak uzun süre hayatta kaldığı ve öldürme fonksiyonunu sinerjik olarak teşvik ettiği gösterilmiştir11. CD8 + T hücrelerinin sitotoksik aktivite gösterme olasılığı daha yüksek olmasına rağmen, bazı CD4 + T hücreleri, yüzey CD107a moleküllerinin12 dolaylı olarak tespit edilen bir ekspresyonu olarak sitotoksik aktivite ile donatılmıştır. Ek olarak, bazı T hücresi alt kümeleri, T hücresi aracılı nötrofil işe alımına katılmak için genellikle monositler tarafından salgılanan kemokin MIP-1α'yı eksprese eder13. Benzer şekilde, CD8 + TPFs, yukarıdaki belirteçlerin çok yönlülüğünü karakterize etmek için de kullanılabilir. Çalışmalar, prime-boost stratejisinin, aşılama ile ortaya çıkan korumayı artırabilecek uzun bir TPF koruyucu etkisüresi 13'ü etkili bir şekilde indükleyebileceğini göstermiştir. Bağışıklık sistemini incelemede merkezi bir özellik, hafıza T hücrelerinin naif T hücrelerinden daha ikincil viral zorluklara daha güçlü, daha hızlı ve daha etkili tepkiler verme yeteneğidir. Efektör bellek T hücreleri (TEM) ve merkezi bellek T hücreleri (TCM), genellikle CD27 / CD45RO veya CCR7 / CD45RA14'ün bileşik ekspresyonu ile farklılaşan önemli T hücresi alt kümeleridir. TCM (CD27+ CD45RO+ veya CCR7+ CD45RA-) sekonder lenfoid dokularda lokalize olma eğilimindeyken, TEM (CD27- CD45RO+ veya CCR7- CD45RA-) lenfoid ve periferik dokularda lokalize olur15,16. TEM acil fakat sürekli olmayan bir savunma sağlarken, TCM sekonder lenfoid organlarda çoğalarak ve yeni efektörler üreterek yanıtı sürdürür17. Bu nedenle, hafıza hücrelerinin virüslere karşı spesifik ve verimli hatırlama yanıtlarına aracılık edebileceği göz önüne alındığında, bu polifonksiyon alt kümesinin katkısı hakkında sorular ortaya çıkmaktadır.
Akış sitometrisi teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, 10'dan fazla kümenin, fenotipin ve farklılaşma antijeninin belirteçlerini aynı anda tespit etmek yaygın hale gelmiştir; bu, yanlış yorumlamayı ve T hücresi fenotiplerinin anlaşılmasındaki zorlukları azaltmak için bireysel T hücreleri üzerindeki fonksiyonel immünolojik özellikleri daha bol bir şekilde açıklamak için faydalıdır. Bu çalışmada, JEV aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) TPF profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisi kullanılmıştır. Bu yaklaşım uygulanarak, aşılama ile indüklenen kısa ve uzun vadeli JEV'e özgü ve hatta çapraz reaktif T hücre bağışıklığının anlaşılması genişletilecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-human CD28</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302934</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD49d</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304339</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human MIP-1&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>551533</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td>BD</td>
			<td>A5</td>
			<td>flow Cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 anti-human CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>563550</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CCR7</td>
			<td>BD</td>
			<td>741786</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV737 anti-human CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>612829</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344748</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RA</td>
			<td>BD</td>
			<td>566114</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV480 anti-human CD45RO</td>
			<td>BD</td>
			<td>566143</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605 anti-human CD107a</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328634</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV650 anti-human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>563999</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV785 anti-human IL-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>500348</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>BD-35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>Cell fixation and permeabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502506</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22400089</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human TNF-&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>502909</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554724</td>
			<td>blocks intracellular protein transport processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom test tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL test tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423106</td>
			<td>Dead cell stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of polyfunctional t cells in children vaccinated with japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique

T hücresi aracılı bağışıklık, aşılamadan sonra veya doğal enfeksiyondan sonra flavivirüs enfeksiyonunun kontrolünde önemli bir rol oynar. Bir T hücresinin "kalitesinin" fonksiyona göre değerlendirilmesi gerekir ve daha yüksek fonksiyon daha güçlü bağışıklık koruması ile ilişkilidir. Tek hücre düzeyinde aynı anda iki veya daha fazla sitokin veya kemokin üretebilen T hücrelerine, degranülasyon belirteçlerini (CD107a) eksprese etmek ve interferon (IFN)-γ, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interlökin (IL)-2 veya makrofaj inflamatuar protein (MIP)-1α salgılamak için çeşitli moleküler mekanizmalar yoluyla bağışıklık tepkilerine aracılık eden polifonksiyonel T hücreleri (TPFs) denir. TPF'lerinuzun süreli immün hafızanın korunması ve korunması ile yakından ilişkili olduğuna ve artan oranlarının koruyucu bağışıklığın önemli bir belirteci olduğuna ve viral enfeksiyon ve reaktivasyonun etkin kontrolünde önemli olduğuna dair kanıtlar artmaktadır. Bu değerlendirme sadece spesifik immün yanıtlar için değil, aynı zamanda çapraz reaktif immün yanıtların değerlendirilmesi için de geçerlidir. Burada, Japon ensefalit virüsü (JEV) örnek alınarak, Japon ensefalitine karşı aşılanmış çocukların periferik kan mononükleer hücreleri tarafından üretilen JEV'e özgü TPF'lerintespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.

Şekil 1, CD8 + veya CD4 + T hücrelerinin TCM veya TEM'sini, JE aşılı çocukların temsili bir JEV stimülasyon grubundan ayırmak için kullanılan geçit stratejisini göstermektedir. FSC-A/SSC-A nokta grafiği lenfositleri tanımlamak için kullanılır ve FSC-A/FSC-W nokta grafiği tek hücreleri tanımlamak için kullanılır. Canlı hücreler canlı/ölü/SSC-A nokta grafiğinde seçilir. CD3/SSC-A nokta grafiği, CD3+ T hücre...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique at JoVE.com

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Mevcut protokol, Japon ensefalit virüsü (JEV) aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) polifonksiyonel T hücresi (TPF) profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisini birleştirmektedir. JEV'e özgü TPF'lerin tespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.

Japon Ensefalit Aşısı ile Aşılanan Çocuklarda Çok Fonksiyonlu T Hücrelerinin Akım Sitometri Tekniği ile Saptanması

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

Japon ensefalit virüsüne özgü TPFS'nin tespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir. Prosedürün gösterilmesi, laboratuvarımızdan iki öğrenci olan Linlin Zhang ve Meng Zhang tarafından gerçekleştirilecektir. Başlamak için, JEV stimülasyon grubunun PBMC'lerini, monoklonal antikorlar, CD28 ve CD49d, CD107a, GolgiPlug ve monensin varlığında 37 santigrat derecede 16 saat boyunca konsantre inaktive edilmiş JEV parçacıkları ile uyarın.Daha sonra, kontrol grubunun PBMC'lerini, konsantre virüs parçacıkları olmadan, monoklonal antikorlar, CD28 ve CD49d, CD 107a, GolgiPlug ve monensin varlığında 37 santigrat derecede 16 saat boyunca uyarın. Her gruptan hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle çıkarın.Hücreleri 1 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna sabitlenebilir canlılık boyası ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Beş dakika boyunca oda sıcaklığında 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.Hücreleri 1 mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, yine, beş dakika boyunca oda sıcaklığında 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın. Hücre yüzey işaretleyici boyama işlemini gerçekleştirmek için, hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her yüzey işaretleyici antikorundan iki mikrolitre ekleyin. Tüpleri ışıktan korurken oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın. Yine, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın.Fiksasyon ve membran kırma işlemini gerçekleştirmek için, hücreleri 500 mikrolitre membran kırıcı fiksatif çözelti ile yeniden askıya alın ve hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika sabitleyin. Daha sonra beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya aldıktan sonra, oda sıcaklığında 500 g'da beş dakika boyunca santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı dikkatlice çıkarın.Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve hücre içi sitokin boyama için her tüpteki hücre süspansiyonuna her sitokin antikorunun iki mikrolitresini ekleyin. Tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Yine, beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın.Bir kez daha, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı daha önce gösterildiği gibi dikkatlice çıkarın. Ardından, hücreleri yeniden askıya almak için 500 mikrolitre PBS ekleyin.PBMC örneğini tek başına izole ettikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, hücre süspansiyonunu makalede açıklanan 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 12 eşit parçaya bölün. Benzer şekilde, hücre yüzey belirteçlerini ve hücre içi sitokin antikorunu ekledikten sonra, daha önce gösterildiği gibi, hücreleri ve vorteksi düşük hızda yeniden askıya almak için 500 mikrolitre PBS ekleyin. Lekesiz bir numune kullanarak, ileri saçılımı, yan saçılımı ve farklı floresan boya voltajlarını ayarlarken, tek boyama numunelerini kullanarak farklı floroforlar arasındaki kontaminasyon sinyallerini ortadan kaldırmak için akış sitometrisi kompanzasyonunu ayarlayın.Tek hücreleri seçmek için ileri dağılım alanı boyunca bir çokgen kapısı, bozulmamış lenfosit popülasyonunu seçmek için yan saçılma alanı nokta grafiği ve ileri saçılma alanı boyunca dikdörtgen bir kapı çizin, ileri saçılma genişliği nokta grafiği çizin. Ardından, canlı hücreleri seçmek için canlı, ölü taraf saçılma alanı nokta grafiği boyunca dikdörtgen bir kapı ve CD üç pozitif T hücresini tanımlamak için CD3 yan saçılma alanı nokta grafiğinden dikdörtgen bir kapı çizin. Ardından, CD4 pozitif veya CD8 pozitif T-hücrelerini tanımlamak için CD4, CD8 nokta grafiğinden ve CD4 pozitif veya CD8 pozitif T-hücrelerini TCM ve TEM'e alt bölümlere ayırmak için CD45RO, CD27 nokta grafiğinden dörtlü bir kapı çizin.CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa, interlökin 2 ve mikrofaj inflamatuar protein bir alfa kapıları çizildikten sonra sırasıyla CD8 pozitif veya CD4 pozitif T-hücrelerinin TCM veya TEM'inden farklı yanıt paternlerinin sıklığını belirlemek için. Numuneleri sitometriye sırayla yükleyin. Geçit stratejisi, CD8 pozitif veya CD4 pozitif T hücrelerinin TCM veya TEM'ini ve bunların alt kümelerini ileri dağılım alanı genişliğini, ardından yan dağılım alanı nokta grafiğini kullanarak tanımlamak için kullanılmıştır.JEV'e CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücresi yanıtlarının polifonksiyonel karakterizasyonu, JEV stimülasyonundan sonra aşılanmış çocukların CD8 pozitif TCM hücrelerinde CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa ve interlökin 2 düzeylerinin aşılanmamış çocuklardakilere kıyasla arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, makrofaj inflamatuar protein bir alfa seviyesi iki grup arasında farklılık göstermedi. JEV stimülasyonu altında aşılanmış grubun CD8 pozitif TEM hücrelerinde, aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a ve interferon gama seviyeleri tespit edildi.Oysa tümör nekroz faktör alfa, interlökin 2 ve makrofaj inflamatuar protein bir alfa, bu pozitif hücrelerde anlamlı olarak yükselmedi. JEV antijeni, aşılanmış grubun CD4 pozitif TCM hücrelerinde aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a, interferon gama, tümör nekroz faktörü alfa ve makrofaj inflamatuar protein bir alfa seviyelerini başarıyla indükledi. Bununla birlikte, interlökin 2 pozitif hücrelerin oranı, JEV stimülasyonu altındaki iki grup arasında farklılık göstermedi.Aşılanan grupta CD107a pozitif, interferon gama pozitif ve tümör nekroz faktörü alfa pozitif alt kümeleri, sub CD4 pozitif TEM hücrelerinin oranı, JEV varlığında aşılanmamış gruba göre daha yüksekti. Uyaranların T hücresi immünojenisitesi ve uyumlu renk eşleştirme stratejileri bu protokoldeki kritik adımlardır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...