Name: modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

We danken de Shared Resources (Flow Cytometry, Molecular Pathology, and Confocal &Specialized Microscopy) van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University voor technische ondersteuning. We danken Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass en Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) en leden van de Rustgi en Nakagawa laboratoria voor nuttige discussies. Deze studie werd ondersteund door de volgende NIH-beurzen: P01CA098101 (H.N. en A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. en H.N.), en P30CA013696 (A.K.R.). H.N. en C.L. zijn ontvangers van de Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. is een ontvanger van de Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. is de ontvanger van de Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) en een American Association for Cancer Research Award. J.G. is de ontvanger van de American Gastroenterological Association (AGA) award.

De muizenexperimenten werden gepland en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften en onder dierprotocol #AABB1502, beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University. De muizen werden gehuisvest in een goede dierenverzorgingsfaciliteit die de humane behandeling van muizen garandeert en passende veterinaire zorg voor de muizen en laboratoriumveiligheidstraining voor het laboratoriumpersoneel biedt.
1. Behandeling van muizen met ...

<ol>
	<li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+carcinoma.">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li><li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+cancers:+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics.">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li><li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+keratin+15++esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration.">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li><li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population.">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li><li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression.">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li><li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance.">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li><li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma.">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).</li><li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine.">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li><li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids.">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue,+esophagus+and+forestomach.">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer.">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li><li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene.">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li><li>Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice.">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li><li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis.">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia.">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440 (2021).</li><li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system:+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells.">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224 (2013).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis.">TGF-&#946;1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li><li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing.">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li><li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity.">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li><li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium.">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy.">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).</li><li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoids:+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers.">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells.">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li></ol>

Er zijn verschillende kritieke stappen en overwegingen voor het genereren en analyseren van MEO's in de hier beschreven protocollen. Om reproduceerbaarheid en striktheid in MEO-experimenten te garanderen, zijn biologische en technische replicaties beide belangrijk. Voor biologische replicaties zijn twee tot drie onafhankelijke muizen met ESCC over het algemeen voldoende per experimentele conditie. Het juiste aantal biologische replicaties kan echter variëren, afhankelijk van de parameters die in individuele onderzoeken ...

Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) is het dodelijkste van de menselijke plaveiselcelcarcinomen, vanwege de late diagnose, therapieresistentie en metastase 1,2. ESCC ontstaat uit het gelaagde plaveiselepitheel, dat het luminale oppervlak van de slokdarm bekleedt. Het plaveiselepitheel bestaat uit proliferatieve basale cellen en gedifferentieerde cellen binnen de suprabasale cellaag. Onder fysiologische omstandigheden drukken basale cellen markers uit zoals p63, Sox2 en cytokeratine K5 en K14, terwijl gedifferentieerde cellen K4, K13 en IVL tot expressie brengen. Basale cellen zelf zijn heterogeen en omvatten vermeende stamcellen gedefinieerd door markers zoals K153 en CD734. Bij homeostase ondergaan basale cellen post-mitotische terminale differentiatie binnen de suprabasale cellaag, terwijl gedifferentieerde cellen migreren en desquamateren in het lumen om epitheelvernieuwing te voltooien. ESCC doet denken aan hun cellen van oorsprong en vertoont plaveiselceldifferentiatie in verschillende mate. ESCC gaat vaak gepaard met multifocale histologische voorloperlaesies, bekend als intra-epitheliale neoplasie (IEN) of dysplasie, bestaande uit atypische basaloïde cellen. Naast epitheliale veranderingen vertoont ESCC weefselremodellering binnen het subepitheliale compartiment, waar de activering van kankergeassocieerde fibroblasten (CAF's) en de rekrutering van immuun- / ontstekingscellen plaatsvinden om de tumorbevorderende micro-omgeving te bevorderen.
De pathogenese van ESCC omvat genetische veranderingen en blootstelling aan omgevingsrisicofactoren. Belangrijke genetische laesies omvatten de inactivatie van de tumorsuppressorgenen TP53 en CDKN2A (p16INK4A) en de activering van de CCND1 (cycline D1) en EGFR-oncogenen, die culmineren in een verminderde celcycluscontrolepuntfunctie, afwijkende proliferatie en overleving onder genotoxische stress gerelateerd aan blootstelling aan kankerverwekkende stoffen in het milieu. Inderdaad, genetische veranderingen werken nauw samen met gedrags- en omgevingsrisicofactoren, meestal tabaks- en alcoholgebruik. Tabaksrook bevat kankerverwekkende stoffen voor de mens, zoals aceetaldehyde, dat ook de belangrijkste metaboliet van alcohol is. Aceetaldehyde induceert DNA-adducten en interstreng DNA-crosslinks, wat leidt tot DNA-schade en de accumulatie van DNA-mutaties en chromosomale instabiliteit. Gezien overmatige mitogene stimuli en afwijkende proliferatie door oncogenactivering, wordt de kwaadaardige transformatie van slokdarmepitheelcellen vergemakkelijkt door mechanismen om genotoxische stress het hoofd te bieden, waaronder de activering van antioxidanten, autofagie en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Interessant is dat deze cytoprotectieve functies vaak worden geactiveerd in ESCC-kankerstamcellen (CSC's) die worden gekenmerkt door hoge CD44 (CD44H) expressie en de mogelijkheden hebben van tumorinitiatie, invasie, metastase en therapieresistentie 5,6,7.
ESCC is gemodelleerd in celkweek en in knaagdiermodellen 8,9. In de afgelopen drie decennia zijn robuuste genetisch gemanipuleerde muismodellen van ESCC ontwikkeld. Deze omvatten CCND1 en EGFR transgene muizen 10,11 en p53 en p120Ctn knock-out muizen 12,13. Enkelvoudige genetische veranderingen resulteren echter meestal niet in een snel optredende ESCC. Deze uitdaging is overwonnen met het gebruik van slokdarmcarcinogenen die de menselijke genetische laesies in ESCC14 goed samenvatten. Bijvoorbeeld, 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) versnelt ESCC ontwikkeling in CCND1 transgene muizen15. In de afgelopen jaren zijn vermeende slokdarmepitheelstamcellen, voorlopercellen en hun respectieve lotgevallen onderzocht in cellijn-traceerbare muismodellen 3,4. Bovendien zijn deze cellijn-traceerbare muizen gebruikt om de cellen van oorsprong van ESCC te onderzoeken en hoe dergelijke cellen aanleiding geven tot CD44H CSC's via conventionele histologie en op omics gebaseerde moleculaire karakterisering7.
Een opkomend gebied gerelateerd aan deze muismodellen is de nieuwe toepassing van celkweektechnieken om levende ESCC- en voorlopercellen te analyseren in een driedimensionaal (3D) organoïde systeem waarin de architectuur van de oorspronkelijke weefsels ex vivo 7,8,9 wordt samengevat. Deze 3D-organoïden worden snel gekweekt uit een eencellige suspensie geïsoleerd uit muizenweefsels, waaronder primaire en gemetastaseerde tumoren (bijv. Lymfeklier-, long- en leverlaesies). De cellen zijn ingebed in keldermembraanextract (BME) en gevoed met een goed gedefinieerd serumvrij celkweekmedium. De 3D-organoïden groeien binnen 7-10 dagen en de resulterende bolvormige structuren zijn vatbaar voor subcultuur, cryopreservatie en testen voor het analyseren van een verscheidenheid aan cellulaire eigenschappen en functies, waaronder CSC-markers, EMT, autofagie, proliferatie, differentiatie en apoptotische celdood.
Deze methoden kunnen breed worden toegepast op 3D-organoïde culturen die zijn vastgesteld uit elk gestratificeerd plaveiselepitheelweefsel, zoals het hoofd- en nekslijmvlies (mondholte, tong, keelholte en strottenhoofd) en zelfs de voormaag. Het hoofd- en nekslijmvlies zijn aaneengesloten met de slokdarm en de twee weefsels delen een vergelijkbare weefselorganisatie, functie en vatbaarheid voor ziekten. Zowel hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) als ESCC delen genetische laesies en leefstijlgerelateerde omgevingsrisicofactoren zoals blootstelling aan tabak en alcohol. Om deze gelijkenis te onderstrepen, ontwikkelen muizen die zijn behandeld met de tabaksrook mimetische 4NQO gemakkelijk zowel HNSCC als ESCC. Gezien het gemak waarmee de hieronder beschreven protocollen kunnen worden toegepast op het modelleren van HNSCC, nemen we specifieke instructies op voor het vaststellen van 3D-organoïde culturen uit deze laesies.
Hierin bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren van murine oesofageale 3D-organoïden (MEO's) die normale, preneoplastische en ESCC-laesies vertegenwoordigen die zich ontwikkelen bij muizen die zijn behandeld met 4NQO. Verschillende muizenstammen kunnen worden gebruikt, waaronder veel voorkomende laboratoriumstammen zoals C57BL / 6 en cellijn-traceerbare en andere genetisch gemanipuleerde derivaten. We benadrukken de belangrijkste stappen, waaronder de isolatie van normaal of ziek muizenoesofageaal epitheel, de bereiding van eencellige suspensies, de teelt en monitoring van de groeiende 3D-organoïden, subcultuur, cryopreservatie en de verwerking voor latere analyses, inclusief morfologie en andere toepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe without needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>212361A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>NO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% ethylene propylene glycol</td>
			<td>SK picglobal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL, final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026406</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td>Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5&#8211;5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Stock concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432002</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G7-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor bead bath (or water bath)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89409-222</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>71142841</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane extract (BME)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Minispin</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1mg</td>
			<td>Stock concentration 500 ng/&#181;L, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval ST 16R centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-285-562 PM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids

Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) komt wereldwijd voor, goed voor 90% van alle gevallen van slokdarmkanker per jaar, en is het dodelijkste van alle menselijke plaveiselcelcarcinomen. Ondanks recente vooruitgang bij het definiëren van de moleculaire veranderingen die gepaard gaan met ESCC-initiatie en -ontwikkeling, blijft de prognose van de patiënt slecht. De functionele annotatie van deze moleculaire veranderingen is de noodzakelijke volgende stap en vereist modellen die zowel de moleculaire kenmerken van ESCC vastleggen als gemakkelijk en goedkoop kunnen worden gemanipuleerd voor functionele annotatie. Muizen behandeld met de tabaksrook mimetisch 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) vormen voorspelbaar ESCC en slokdarmpreneoplasie. Van belang is dat 4NQO-laesies ook voorkomen in de mondholte, meestal in de tong, evenals de voormaag, die allemaal het gestratificeerde plaveiselepitheel delen. Deze muizen kunnen echter niet eenvoudig worden gemanipuleerd voor het testen van functionele hypothesen, omdat het genereren van isogene muismodellen tijd- en middelenintensief is. Hierin overwinnen we deze beperking door eencellige driedimensionale (3D) organoïden te genereren van muizen die zijn behandeld met 4NQO om murine ESCC of preneoplastische cellen ex vivo te karakteriseren. Deze organoïden vangen de opvallende kenmerken van ESCC en slokdarmpreneoplasie, kunnen goedkoop en snel worden gebruikt om isogene modellen te vormen en kunnen worden gebruikt voor syngenetische transplantatie-experimenten. We demonstreren hoe 3D-organoïden te genereren uit normaal, preneoplastisch en SCC-muizenslokdarmweefsel en deze organoïden te onderhouden en te cryopreserveren. De toepassingen van deze veelzijdige organoïden zijn breed en omvatten het gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen en verdere karakterisering door flowcytometrie of immunohistochemie, het genereren van isogene organoïde lijnen met behulp van CRISPR-technologieën en medicijnscreening of syngenetische transplantatie. Wij zijn van mening dat de wijdverbreide toepassing van de in dit protocol gedemonstreerde technieken de vooruitgang op dit gebied ter bestrijding van de zware last van het ESCC zal versnellen.

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van murine oesofageale organoïden (MEO's) uit normaal slokdarmweefsel of ESCC-tumorweefsel van 4NQO-behandelde muizen volgens een specifiek behandelingsregime bestaande uit 16 weken 4NQO toegediend in drinkwater, gevolgd door een observatieperiode van 10 weken tot 12 weken (figuur 1). De muizen worden vervolgens geëuthanaseerd voor de dissectie van de tong of het slokdarmweefsel (figuur 2 en <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom, ESCC, is dodelijk en komt wereldwijd veel voor. Driedimensionale organoïden kunnen worden gebruikt om de vooruitgang in het veld te versnellen om de zware last van ESCC te bestrijden. Single cell-derived 3D-organoïden van muizen behandeld met 4NQO kunnen gemakkelijk en goedkoop worden gemanipuleerd voor functionele annotatie van de moleculaire veranderingen die gepaard gaan met ESCC-initiatie en -ontwikkeling.Dit model legt de genetische heterogeniteit van door mutagene organismen geïnduceerde tumoren vast. Daarom bieden deze organoïden een fysiologisch relevant platform om nieuwe therapeutische strategieën te testen of de opvallende genetische veranderingen te identificeren die tumorigenese veroorzaken. Yasuto Tomita, een stafmedewerker, zal helpen om de dierlijke dissectie en orgaanverzameling te demonstreren, en het demonstreren van de voorbereiding van organoïde voor paraffine-inbeddingsprocedure zal Norihiro Matsuura zijn, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium.Open om te beginnen de huid van de geëuthanaseerde muizen door de midabdominale vacht te knijpen en een chirurgische schaar te gebruiken, maak een craniocaudale, ventrale middellijnincisie van de onderbuik naar de kin. Begin bij de middellijnincisie, maak radiale sneden die zich uitstrekken tot de ledematen aan beide zijden van de muis, blaas de huidflappen open. Om de cervicale luchtpijp bloot te leggen, met behulp van een ontleedschaar, verdeelt u de speekselklieren op de middellijn.Om de thoracale luchtpijp bloot te leggen, verwijdert u het borstbeen. Knijp en til het peritoneum voorzichtig op met een tang en gebruik een schaar om het peritoneum craniocaudaal te verdelen. en zijdelings langs de ribbenkast.Trek de lever voorzichtig terug van het caudale oppervlak van het diafragma en gebruik een schaar om een kleine incisie in het diafragma te maken bij de sternale inkeping, met name aan het dorsale oppervlak van het xiphoid-proces. Zodra de ribbenkast is gescheiden van de thoracale inhoud, steekt u een schaar in de incisie in het diafragma en ontleedt u craniaal aan de cervicale gordel die nauw hecht aan het dorsale oppervlak van het borstbeen om schade aan de organen eronder te voorkomen. Knip de ribben aan weerszijden van het borstbeen met een schaar en verwijder het borstbeen.Om de buikslokdarm bloot te leggen, tilt u de maag voorzichtig anterieur op door het antrum met een tang vast te houden. Ontleed met een schaar de milt, alvleesklier en mesenterium uit de maag en slokdarm. Om de thoracale slokdarm bloot te leggen, tilt u de luchtpijp voorzichtig onmiddellijk caudaal op het schildklierkraakbeen en ontleedt u de slokdarm van de dorsale zijde van de luchtpijp met behulp van een irisschaar.Verdeel de luchtpijp bij het schildklierkraakbeen met een irisschaar. Pel de luchtpijp van de rest van de slokdarm door deze zorgvuldig in caudale richting te ontleden. Verwijder de longen, het hart en de thymus helemaal met de luchtpijp.Verdeel de maag bij de pylorus met een schaar. Scheid de slokdarm van de wervel door het antrum met een tang vast te houden en craniaal te ontleden. Verdeel de slokdarm ter hoogte van het schildklierkraakbeen en oogst de slokdarm en maag helemaal.Scheid de maag en de slokdarm door de slokdarm bij de cardia te verdelen en ontleed eventuele fascia op het buitenoppervlak van de slokdarm. Om een monster te reserveren voor histologie, splitst u longitudinaal met een schaar. Plaats de resterende intacte slokdarm en koude PBS op ijs.Open de maag langs de grotere kromming en was voldoende met PBS. Scheid de voormaag en was met koude PBS. Om de tong te oogsten, verwijdert u de vastgepinde naald uit de neus en trekt u de tong eruit met een pincet.Snijd de tong zo lang mogelijk en leg hem in koude PBS op ijs. Nadat u het gedissocieerde weefsel naar een kweekschaal hebt overgebracht, verwijdert u voorzichtig de spierlaag uit het epitheel met behulp van een tang. Breng het epitheel over in een microcentrifugebuis met 500 microliter van 0,25% trypsine en incubeer gedurende 10 minuten in een thermomixer bij 37 graden Celsius en 800 tpm.Na een korte centrifugatie, breng de celsuspensie over door een 100-micrometer celzeef die op een 50-milliliter conische buis met een brede boring wordt gehouden met behulp van cirkelvormige bewegingen, voeg vervolgens 3 milliliter soja-trypsineremmer of soa toe door de zeef met cirkelvormige bewegingen om te wassen, schrob vervolgens de zeef met de basis van een 1-milliliter tuberculinspuitzuiger om de cellen er doorheen te duwen. Was de zeef 3 tot 5 keer met 3 milliliter PBS en schrob de zeef met de bodem van de spuit tussen de wasbeurten door. Na het afpelleteren van de cellen door centrifugeren, verwijdert u het supernatant en laat u 1 milliliter oplossing in de buis achter voor hersuspensie.Zodra de pellet is geresuspendeerd, brengt u de celsuspensie over door een 70-micrometer celzeef in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Nadat u de buis opnieuw hebt gecentrifugeerd, resuspendeert u de pellet in 100 microliter muisorganoïde medium of MOM en voert u een geautomatiseerd celgetal uit. Plaat 5, 000 levensvatbare cellen in 75% keldermembraanextract, of BME, en MOM met 50 microliter totaal volume per put.Voeg met behulp van een punt met een brede boring van 200 microliter langzaam een druppel van 50 microliter toe aan het midden van elke put, waarbij contact tussen de punt en de bodem of zijkanten van de put wordt vermeden. Laat de BME 30 minuten stollen in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en 95% relatieve vochtigheid. Voeg na incubatie voorzichtig 500 microliter MOM per put toe.Verander de MOM op dag 3 of 4 en vervolgens elke 2 tot 3 dagen daarna totdat deze klaar is voor passage. Houd de ontdooide BME op ijs, verwarm MOM, 0,05% trypsine en soa tot 37 graden Celsius voor gebruik. Gebruik een micropipetpunt met brede boring om de organoïden samen met het supernatant in de BME-koepel te verzamelen en de BME te verstoren door op en neer te pipetteren.Na het verkrijgen van de organoïde pellet door korte centrifugatie, zodra deze is losgemaakt, resuspensie deze in 500 microliter van 0,05% trypsine. Incubeer de buis in een thermomixer bij 37 graden Celsius en 800 tpm gedurende 10 minuten. Inactiveer de trypsine met 600 microliter soa.Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant, resuspensie van de celkorrel in 100 microliter MOM. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten. Om de organoïden te fixeren, maakt u de pellet voorzichtig los en resuspendeert u deze in 300 microliter 4% paraformaldehyde gedurende een nacht bij 4 graden Celsius.Bereid vervolgens een inbeddingsoppervlak voor door een microcentrifugebuisrek om te keren en het oppervlak te bedekken met een vel plafondfolie en vervolgens te labelen met de bijbehorende organoïde id. Bedek voorzichtig de paraformaldehyde verwijderd in PBS-gewassen organoïde pellet door 50 microliter agar toe te voegen aan de zijkant van de buis. Herhaal deze stap.Zonder de pellet te storen, brengt u de pellet in de agargeldruppel over naar de plafondfilm op het inbeddingsoppervlak voor stolling bij 4 graden Celsius gedurende 45 minuten. Breng met behulp van een tang de druppel met de gestolde organoïde pellet voorzichtig over naar een gelabelde pathologiecassette. De normale muriene slokdarm en voormaag organoïden werden morfologisch geanalyseerd door brightfield imaging en histologische kleuring.Het slokdarm plaveiselcelcarcinoom van een met 4NQO behandelde muis vertoonde nucleaire atypie en abrupte keratinisatie. Het zelfvernieuwingsvermogen van organoïden beoordeeld door het bepalen van de organoïde vormingssnelheid bij subcultuur toonde aan dat de formatiesnelheid afneemt als een functie van de tijd als gevolg van verminderde proliferatieve basaloïde cellen in de gerijpte organoïden. De groeikinetiek van de organoïden wordt onthuld door hun morfologie op verschillende tijdstippen.Keratinisatie van de binnenkern van organoïden wordt prominent op dag 10. De proliferatieve basaloïde cellen blijven in de buitenste cellaag, zelfs op dag 14 en dag 21. Een populatieverdubbelingscurve van normale muizentongorganoïden gegenereerd uit 4NQO-onbehandelde muizen toont hun gestage groei over meerdere passages en langetermijncultuur.Organoïden zijn platforms voor high-throughput screening om nieuwe therapeutische doelen te identificeren, CRISPR-gebaseerde bewerking om specifieke genfunctie te ondervragen of co-cultuur om te bepalen welke interacties in de micro-omgeving van de tumor de transformatie beïnvloeden. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om fenomenen zoals gedeeltelijke EMT en HPV-infectie te onderzoeken, samen met hun interactie met het immuunsysteem in de biologie van plaveiselcelkankers in het aerodigestieve kanaal.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...