Name: modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

Nous remercions les ressources partagées (cytométrie en flux, pathologie moléculaire et microscopie confocale et spécialisée) du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia pour leur soutien technique. Nous remercions les Drs Alan Diehl, Adam J. Bass et Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) et les membres des laboratoires Rustgi et Nakagawa pour leurs discussions utiles. Cette étude a été soutenue par les subventions NIH suivantes: P01CA098101 (H.N. et A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. et H.N.) et P30CA013696 (A.K.R.). H.N. et C.L. sont récipiendaires du prix pilote multi-IP du Herbert Irving Comprehensive Cancer Center de l’Université Columbia. H.N. est récipiendaire du prix Fanconi Anemia Research Fund. F.M.H. est récipiendaire du prix de la Fondation Mark pour la recherche sur le cancer (20-60-51-MOME) et d’un prix de l’American Association for Cancer Research. J.G. est le récipiendaire du prix de l’American Gastroenterological Association (AGA).

Les expériences sur les murins ont été planifiées et réalisées conformément à la réglementation et au protocole animal #AABB1502, examinés et approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia. Les souris ont été hébergées dans une installation de soins aux animaux appropriée qui assure le traitement sans cruauté des souris et fournit des soins vétérinaires appropriés aux souris et une formation en sécurité de laboratoire pour le personnel de l...

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	<li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+carcinoma.">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li><li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+cancers:+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics.">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li><li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+keratin+15++esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration.">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li><li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population.">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li><li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression.">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li><li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance.">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li><li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma.">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).</li><li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine.">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li><li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids.">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue,+esophagus+and+forestomach.">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer.">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li><li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene.">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li><li>Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice.">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li><li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis.">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia.">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440 (2021).</li><li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system:+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells.">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224 (2013).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis.">TGF-&#946;1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li><li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing.">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li><li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity.">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li><li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium.">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy.">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).</li><li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoids:+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers.">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells.">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li></ol>

Il existe plusieurs étapes et considérations critiques pour la génération et l’analyse des opérateurs en économie de marché dans les protocoles décrits ici. Pour assurer la reproductibilité et la rigueur des expériences MEO, les réplications biologiques et techniques sont toutes deux importantes. Pour les réplications biologiques, deux à trois souris indépendantes portant de l’ESCC sont généralement suffisantes par condition expérimentale. Cependant, le nombre approprié de répétitions biologiques ...

Le carcinome épidermoïde œsophagien (ESCC) est le plus mortel des carcinomes épidermoïdes humains, en raison de son diagnostic tardif, de sa résistance au traitement et de ses métastases 1,2. L’ESCC provient de l’épithélium pavimenteux stratifié, qui tapisse la surface luminale de l’œsophage. L’épithélium pavimenteux est composé de cellules basales prolifératives et de cellules différenciées dans la couche de cellules suprabasales. Dans des conditions physiologiques, les cellules basales expriment des marqueurs tels que p63, Sox2 et la cytokératine K5 et K14, tandis que les cellules différenciées expriment K4, K13 et IVL. Les cellules basales elles-mêmes sont hétérogènes et comprennent des cellules souches putatives définies par des marqueurs tels que K153 et CD734. En homéostasie, les cellules basales subissent une différenciation terminale post-mitotique au sein de la couche cellulaire suprabasale, tandis que les cellules différenciées migrent et se desquamate dans la lumière pour compléter le renouvellement épithélial. Rappelant leurs cellules d’origine, l’ESCC présente une différenciation des cellules squameuses à des degrés divers. L’ESCC s’accompagne souvent de lésions précurseurs histologiques multifocales, appelées néoplasie intraépithéliale (IEN) ou dysplasie, comprenant des cellules basaloïdes atypiques. En plus des changements épithéliaux, ESCC affiche un remodelage tissulaire dans le compartiment sous-épithélial, où l’activation des fibroblastes associés au cancer (CAF) et le recrutement de cellules immunitaires / inflammatoires ont lieu pour favoriser le microenvironnement favorisant la tumeur.
La pathogenèse de l’ESCC implique des changements génétiques et l’exposition à des facteurs de risque environnementaux. Les lésions génétiques clés comprennent l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs TP53 et CDKN2A (p16INK4A) et l’activation des oncogènes CCND1 (cycline D1) et EGFR, qui aboutissent à une altération de la fonction de point de contrôle du cycle cellulaire, à une prolifération aberrante et à la survie sous un stress génotoxique lié à l’exposition à des carcinogènes environnementaux. En effet, les changements génétiques interagissent étroitement avec les facteurs de risque comportementaux et environnementaux, le plus souvent la consommation de tabac et d’alcool. La fumée de tabac contient des cancérogènes pour l’homme tels que l’acétaldéhyde, qui est également le principal métabolite de l’alcool. L’acétaldéhyde induit des adduits à l’ADN et des liaisons croisées interbrins de l’ADN, entraînant des dommages à l’ADN et l’accumulation de mutations de l’ADN et d’instabilité chromosomique. Compte tenu des stimuli mitogènes excessifs et de la prolifération aberrante due à l’activation oncogène, la transformation maligne des cellules épithéliales œsophagiennes est facilitée par des mécanismes permettant de faire face au stress génotoxique, notamment l’activation des antioxydants, l’autophagie et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). Fait intéressant, ces fonctions cytoprotectrices sont souvent activées dans les cellules souches cancéreuses ESCC (CSC) qui sont caractérisées par une expression élevée de CD44 (CD44H) et ont les capacités d’initiation tumorale, d’invasion, de métastases et de résistance au traitement 5,6,7.
L’ESCC a été modélisé en culture cellulaire et dans des modèlesde rongeurs 8,9. Au cours des trois dernières décennies, des modèles robustes de souris génétiquement modifiées d’ESCC ont été développés. Il s’agit notamment des souris transgéniques CCND1 et EGFR 10,11 et p53 et p120Ctn knockout 12,13. Cependant, les changements génétiques uniques n’entraînent généralement pas d’apparition rapide de l’ESCC. Ce défi a été surmonté grâce à l’utilisation de cancérogènes œsophagiens qui récapitulent bien les lésions génétiques humaines dans ESCC14. Par exemple, la 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4NQO) accélère le développement de l’ESCC chez les souris transgéniques CCND1 15. Au cours des dernières années, les cellules souches épithéliales œsophagiennes présumées, les cellules progénitrices et leurs destins respectifs ont été étudiés dans des modèles murins traçables par lignée cellulaire 3,4. De plus, ces souris traçables de lignée cellulaire ont été utilisées pour explorer les cellules d’origine de l’ESCC et comment ces cellules donnent naissance à des CSC CD44H via l’histologie conventionnelle et la caractérisation moléculaire basée sur l’omique7.
Un domaine émergent lié à ces modèles murins est la nouvelle application de techniques de culture cellulaire pour analyser les cellules vivantes de l’ESCC et des précurseurs dans un système organoïde tridimensionnel (3D) dans lequel l’architecture des tissus d’origine est récapitulée ex vivo 7,8,9. Ces organoïdes 3D sont rapidement développés à partir d’une suspension unicellulaire isolée à partir de tissus murins, y compris les tumeurs primaires et métastatiques (par exemple, les ganglions lymphatiques, les poumons et les lésions hépatiques). Les cellules sont incorporées dans un extrait de membrane basale (EMB) et alimentées avec un milieu de culture cellulaire sans sérum bien défini. Les organoïdes 3D se développent en 7 à 10 jours, et les structures sphériques résultantes se prêtent à la sous-culture, à la cryoconservation et aux tests pour analyser une variété de propriétés et de fonctions cellulaires, y compris les marqueurs CSC, l’EMT, l’autophagie, la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire apoptotique.
Ces méthodes peuvent être largement appliquées à des cultures organoïdes 3D établies à partir de n’importe quel tissu épithélial pavimenteux stratifié, tel que la muqueuse de la tête et du cou (cavité buccale, langue, pharynx et larynx) et même le préestomac. La muqueuse de la tête et du cou est contiguë à l’œsophage, et les deux tissus partagent une organisation, une fonction et une susceptibilité tissulaires similaires à la maladie. Le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) et l’ESCC partagent des lésions génétiques et des facteurs de risque environnementaux liés au mode de vie, tels que l’exposition au tabac et à l’alcool. Soulignant cette similitude, les souris traitées avec le 4NQO mimétique de la fumée de tabac développent facilement à la fois HNSCC et ESCC. Compte tenu de la facilité avec laquelle les protocoles décrits ci-dessous peuvent être appliqués à la modélisation HNSCC, nous incluons des instructions spécifiques pour établir des cultures organoïdes 3D à partir de ces lésions.
Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer des organoïdes 3D œsophagiens murins (MEO) représentant des lésions normales, prénéoplasiques et ESCC qui se développent chez les souris traitées avec 4NQO. Diverses souches de souris peuvent être utilisées, y compris des souches de laboratoire courantes telles que C57BL / 6 et des dérivés traçables de lignée cellulaire et d’autres dérivés génétiquement modifiés. Nous mettons l’accent sur les étapes clés, y compris l’isolement de l’épithélium œsophagien murin normal ou malade, la préparation de suspensions unicellulaires, la culture et la surveillance des organoïdes 3D en croissance, la sous-culture, la cryoconservation et le traitement pour les analyses ultérieures, y compris la morphologie et d’autres applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe without needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>212361A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>NO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% ethylene propylene glycol</td>
			<td>SK picglobal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL, final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026406</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td>Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5&#8211;5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Stock concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432002</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G7-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor bead bath (or water bath)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89409-222</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>71142841</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane extract (BME)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Minispin</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1mg</td>
			<td>Stock concentration 500 ng/&#181;L, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval ST 16R centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-285-562 PM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids

Le carcinome épidermoïde de l’œsophage (ESCC) est répandu dans le monde entier, représentant 90% de tous les cas de cancer de l’œsophage chaque année, et est le plus mortel de tous les carcinomes épidermoïdes humains. Malgré les progrès récents dans la définition des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC, le pronostic du patient reste sombre. L’annotation fonctionnelle de ces changements moléculaires est la prochaine étape nécessaire et nécessite des modèles qui capturent les caractéristiques moléculaires de l’ESCC et peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle. Les souris traitées avec la fumée de tabac mimétique 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4NQO) forment de manière prévisible un ESCC et une prénéoplasie œsophagienne. Il convient de noter que les lésions de 4NQO apparaissent également dans la cavité buccale, le plus souvent dans la langue, ainsi que dans le préestomac, qui partagent tous l’épithélium pavimenteux stratifié. Cependant, ces souris ne peuvent pas être simplement manipulées pour tester des hypothèses fonctionnelles, car la génération de modèles murins isogéniques nécessite beaucoup de temps et de ressources. Ici, nous surmontons cette limitation en générant des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules uniques à partir de souris traitées avec 4NQO pour caractériser les ESCC murins ou les cellules prénéoplasiques ex vivo. Ces organoïdes capturent les caractéristiques saillantes de l’ESCC et de la prénéoplasie œsophagienne, peuvent être exploités rapidement et à peu de frais pour former des modèles isogéniques et peuvent être utilisés pour des expériences de transplantation syngénique. Nous démontrons comment générer des organoïdes 3D à partir de tissu œsophagien murin normal, prénéoplasique et SCC et maintenir et cryopréserver ces organoïdes. Les applications de ces organoïdes polyvalents sont vastes et comprennent l’utilisation de souris génétiquement modifiées et une caractérisation plus poussée par cytométrie de flux ou immunohistochimie, la génération de lignées organoïdes isogéniques à l’aide des technologies CRISPR et le criblage de médicaments ou la transplantation syngénique. Nous pensons que l’adoption généralisée des techniques démontrées dans ce protocole accélérera les progrès dans ce domaine pour lutter contre le lourd fardeau de la CSC.

Ce protocole décrit le processus de génération d’organoïdes œsophagiens murins (MEO) à partir de tissu œsophagien normal ou de tissu tumoral ESCC à partir de souris traitées par 4NQO selon un schéma thérapeutique spécifique consistant en 16 semaines de 4NQO administré dans l’eau potable, suivies d’une période d’observation de 10 semaines à 12 semaines (Figure 1). Les souris sont ensuite euthanasiées pour la dissection de la langue ou du tissu œsophagien (Figure <stro...

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Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Ce protocole décrit les étapes clés pour générer et caractériser les organoïdes 3D murins oraux-œsophagiens qui représentent les lésions de carcinome épidermoïde normal, prénéoplasique et épidermoïde induites par cancérogenèse chimique.

Modélisation du carcinome épidermoïde bucco-œsophagien dans les organoïdes 3D

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Le carcinome épidermoïde de l’œsophage, ESCC, est mortel et répandu dans le monde entier. Les organoïdes tridimensionnels peuvent être utilisés pour accélérer les progrès sur le terrain afin de lutter contre le lourd fardeau de l’ESCC. Les organoïdes 3D dérivés de cellules uniques provenant de souris traitées avec 4NQO peuvent être manipulés facilement et à peu de frais pour l’annotation fonctionnelle des changements moléculaires accompagnant l’initiation et le développement de l’ESCC.Ce modèle capture l’hétérogénéité génétique des tumeurs induites par les mutagènes. Par conséquent, ces organoïdes fournissent une plate-forme physiologiquement pertinente pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ou identifier les changements génétiques saillants à l’origine de la tumorigenèse. Yasuto Tomita, un associé du personnel, aidera à démontrer la dissection animale et la collection d’organes, et Norihiro Matsuura, un chercheur postdoctoral de mon laboratoire, aidera à démontrer la préparation de l’organoïde pour la procédure d’incorporation de paraffine.Pour commencer, ouvrez la peau des souris euthanasiées en pinçant la fourrure abdominale médiane et en utilisant des ciseaux chirurgicaux, faites une incision craniocaudale, ventrale médiane du bas-ventre au menton. En commençant par l’incision médiane, faites des coupes radiales s’étendant jusqu’aux membres des deux côtés de la souris, gonflez les lambeaux de peau ouverts. Pour exposer la trachée cervicale, à l’aide de ciseaux à dissection, divisez les glandes salivaires à la ligne médiane.Pour exposer la trachée thoracique, retirez le sternum. Pincez et soulevez doucement le péritoine avec une pince et utilisez des ciseaux pour diviser le péritoine crâniocaudale. et latéralement le long de la cage thoracique.Rétractez doucement le foie de la surface caudale du diaphragme et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le diaphragme à l’encoche sternale, en particulier à la surface dorsale du processus xiphoïde. Une fois que la cage thoracique est séparée du contenu thoracique, insérez des ciseaux dans l’incision du diaphragme et disséquez crânienne la ceinture cervicale adhérant étroitement à la surface dorsale du sternum pour éviter d’endommager les organes inférieurs. Coupez les côtes de chaque côté du sternum à l’aide de ciseaux et retirez le sternum.Pour exposer l’œsophage abdominal, soulevez doucement l’estomac antérieurement en tenant l’antre avec une pince. À l’aide de ciseaux, disséquer la rate, le pancréas et le mésentère de l’estomac et de l’œsophage. Pour exposer l’œsophage thoracique, soulevez doucement la trachée immédiatement caudale vers le cartilage thyroïdien et disséquez l’œsophage de la face dorsale de la trachée à l’aide de ciseaux d’iris.Divisez la trachée au niveau du cartilage thyroïdien avec des ciseaux d’iris. Décollez la trachée du reste de l’œsophage en la disséquant soigneusement dans le sens caudal. Enlevez complètement le poumon, le cœur et le thymus avec la trachée.Divisez l’estomac au niveau du pylore avec des ciseaux. Séparez l’œsophage de la vertèbre en tenant l’antre avec une pince et en disséquant crâniennement. Divisez l’œsophage au niveau du cartilage thyroïdien et récoltez l’œsophage et l’estomac ensemble.Séparez l’estomac et l’œsophage en divisant l’œsophage au niveau du cardia et disséquez tout fascia sur la surface externe de l’œsophage. Pour réserver un échantillon à l’histologie, fendre longitudinalement avec des ciseaux. Placez le reste intact de l’œsophage et du PBS froid sur de la glace.Ouvrez l’estomac le long de la plus grande courbure et lavez suffisamment avec du PBS. Séparer le préestomac et laver avec du PBS froid. Pour récolter la langue, retirez l’aiguille épinglée du nez et retirez la langue avec une pince à épiler.Coupez la langue le plus longtemps possible et placez-la dans du PBS froid sur de la glace. Après avoir transféré le tissu dissocié dans une boîte de culture, retirez soigneusement la couche musculaire de l’épithélium à l’aide d’une pince. Transférer l’épithélium dans un tube microcentrifuge contenant 500 microlitres de trypsine à 0,25% et incuber dans un thermomélangeur pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 800 tr / min.Après une brève centrifugation, transférer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres maintenue sur un tube conique de 50 millilitres avec une pointe de large alésage en utilisant des mouvements circulaires, puis ajouter 3 millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja, ou ITS, à travers la passoire en utilisant des mouvements circulaires pour laver, puis frotter la crépine avec la base d’un piston de seringue à tuberculine de 1 millilitre pour pousser les cellules à travers. Lavez la passoire avec 3 millilitres de PBS 3 à 5 fois, en frottant la crépine avec la base de la seringue entre les lavages. Après avoir enduit les cellules par centrifugation, retirer le surnageant en laissant 1 millilitre de solution dans le tube pour la remise en suspension.Une fois la pastille remise en suspension, transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Après avoir centrifugé à nouveau le tube, remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de milieu organoïde de souris, ou MOM, et effectuez un comptage automatisé des cellules. Plaque 5 000 cellules viables dans 75% d’extrait de membrane basale, ou BME, et MOM avec 50 microlitres de volume total par puits.À l’aide d’une pointe de 200 microlitres à large alésage, ajoutez lentement une gouttelette de 50 microlitres au centre de chaque puits en évitant le contact entre la pointe et le fond ou les côtés du puits. Laissez le BME se solidifier pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité relative. Après l’incubation, ajoutez soigneusement 500 microlitres de MOM par puits.Changez le MOM le jour 3 ou 4, puis tous les 2 à 3 jours par la suite jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le passage. Gardez le BME décongelé sur la glace, préchauffez le MOM, 0,05% de trypsine et les IST à 37 degrés Celsius avant utilisation. À l’aide d’une pointe de micropipette de grand calibre, collectez les organoïdes dans le dôme BME avec le surnageant et perturbez le BME en pipetant de haut en bas.Après avoir obtenu la pastille organoïde par une brève centrifugation, une fois délogée, la remettre en suspension dans 500 microlitres de trypsine à 0,05%. Incuber le tube dans un thermomélangeur à 37 degrés Celsius et 800 tr/min pendant 10 minutes. Inactiver la trypsine avec 600 microlitres d’ITS.Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de MOM. Effectuez un comptage automatisé des cellules par exclusion du bleu trypan. Pour fixer les organoïdes, délogez délicatement la pastille et remettez-la en suspension dans 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant une nuit à 4 degrés Celsius.Ensuite, préparez une surface d’encastrement en inversant un support de tubes microcentrifugés et en recouvrant la surface d’une feuille de film de plafond, puis étiquetez avec l’identifiant organoïde correspondant. Recouvrir soigneusement le paraformaldéhyde enlevé dans la pastille organoïde lavée au PBS en ajoutant 50 microlitres de gélose sur le côté du tube. Répétez cette étape.Sans déranger la pastille, transférer la pastille dans la gouttelette de gel gélosé sur le film du plafond sur la surface d’encastrement pour une solidification à 4 degrés Celsius pendant 45 minutes. À l’aide d’une pince, transférer délicatement la gouttelette contenant la pastille organoïde solidifiée dans une cassette de pathologie étiquetée. Les organoïdes murins normaux de la langue œsophagienne et du préestomac ont été analysés morphologiquement par imagerie en fond clair et coloration histologique.Le carcinome épidermoïde de l’œsophage d’une souris traitée au 4NQO présentait une atypie nucléaire et une kératinisation abrupte. La capacité d’auto-renouvellement des organoïdes évaluée en déterminant le taux de formation d’organoïdes lors de la sous-culture a montré que le taux de formation diminue en fonction du temps reflétant la diminution des cellules basaloïdes prolifératives dans les organoïdes matures. La cinétique de croissance des organoïdes est révélée par leur morphologie à différents moments.La kératinisation du noyau interne des organoïdes devient proéminente au jour 10. Les cellules basaloïdes prolifératives restent dans la couche cellulaire la plus externe, même aux jours 14 et 21. Une courbe de doublement de la population d’organoïdes normaux de la langue de souris générés à partir de souris non traitées 4NQO démontre leur croissance régulière sur de multiples passages et une culture à long terme.Les organoïdes sont des plates-formes de criblage à haut débit pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, l’édition basée sur CRISPR pour interroger la fonction spécifique des gènes ou la co-culture pour définir quelles interactions dans le microenvironnement tumoral influencent la transformation. Cette technique nous a permis d’étudier des phénomènes tels que l’EMT partiel et l’infection par le VPH, ainsi que leur interaction avec le système immunitaire dans la biologie des cancers épidermoïdes des voies aérodigestives.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication de langue matrice extracellulaire et Reconstitution de langue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez les souris pour tumeur immunitaire profilage et évaluation de réponse traitement suffit

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Système de coculture multidimensionnel pour modéliser la progression du carcinome pulmonaire

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...