Name: modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

コロンビア大学のハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共有リソース(Flow Cytometry、Molecular Pathology、Confocal & Specialized Microscopy)の技術サポートに感謝する。Alan Diehl博士、Adam J. Bass博士、Kwok-Kin Wong博士(NCI P01食道発がんのメカニズム)とRustgi研究室とNakakawa研究室のメンバーに有益な議論をしていただき感謝します。この研究は、次のNIH助成金によってサポートされました:P01CA098101(H.N.およびA.K.R.)、R01DK114436(H.N.)、R01AA026297(H.N.)、L30CA264714(F.F.F.)、DE031112-01(F.M.H.)、KL2TR001874(F.M.H.)、3R01CA255298-01S1(J.G.)、2L30DK126621-02
(J.G.)R01CA266978 (C.L.)、R01DK132251 (C.L.)、R01DE031873 (C.L.)、P30DK132710 (C.M. および H.N.)、および P30CA013696 (別名)。H.N.とC.L.は、コロンビア大学ハーバートアーヴィング総合がんセンターMulti-PIパイロット賞を受賞しています。H.N.はファンコニ貧血研究基金賞を受賞しています。F.M.H.は、The Mark Foundation for Cancer Research Award(20-60-51-MOME)およびAmerican Association for Cancer Research Awardを受賞しています。J.G.は、米国消化器病学会(AGA)賞を受賞しています。

マウス実験は、規制に従い、動物プロトコル#AABB1502の下で計画および実施され、コロンビア大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。マウスは、マウスの人道的な治療を保証し、マウスに適切な獣医ケアを提供し、実験室職員に実験室安全トレーニングを提供する適切な動物飼育施設に収容されました。
1.食道IENおよびESCC病変?...

<ol>
	<li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+carcinoma.">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li><li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+cancers:+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics.">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li><li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+keratin+15++esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration.">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li><li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population.">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li><li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression.">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li><li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance.">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li><li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma.">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).</li><li>Whelan, K. A., Muir, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer.">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li><li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene.">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li><li>Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice.">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li><li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing.">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li><li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity.">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li><li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium.">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy.">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).</li><li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoids:+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers.">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells.">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li></ol>

ここで説明するプロトコルでは、MEO の生成と分析に関するいくつかの重要な手順と考慮事項があります。MEO実験の再現性と厳密性を確保するには、生物学的複製と技術的複製の両方が重要です。生物学的複製の場合、ESCCを有する2〜3匹の独立したマウスは、一般に、実験条件ごとに十分である。ただし、生物学的反復の適切な数は、個々の研究でテストするパラメーターによって異なる場合...

食道扁平上皮癌(ESCC)は、診断の遅れ、治療抵抗性、および転移のために、ヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です1,2。ESCCは、食道の管腔表面を覆う層状扁平上皮から生じる。扁平上皮は、増殖性基底細胞と基底上細胞層内の分化細胞で構成されています。生理学的条件下では、基底細胞はp63、Sox2、サイトケラチンK5およびK14などのマーカーを発現し、分化細胞はK4、K13、およびIVLを発現します。基底細胞自体は不均一であり、K153およびCD734などのマーカーによって定義される推定幹細胞を含む。恒常性において、基底細胞は基底上細胞層内で有糸分裂後の終末分化を受けるのに対し、分化した細胞は内腔に移動して落屑し、上皮再生を完了する。ESCCは、それらの起源の細胞を彷彿とさせ、さまざまな程度で扁平上皮細胞の分化を示します。ESCCは、非定型基底細胞を含む上皮内腫瘍(IEN)または異形成として知られる多巣性組織学的前駆病変を伴うことがよくあります。上皮の変化に加えて、ESCCは上皮下コンパートメント内の組織リモデリングを示し、そこでは癌関連線維芽細胞(CAF)の活性化と免疫/炎症細胞の動員が起こり、腫瘍促進微小環境が促進されます。
ESCCの病因には、遺伝的変化と環境危険因子への曝露が含まれます。主な遺伝的病変には、腫瘍抑制遺伝子TP53およびCDKN2A(p16INK4A)の不活性化、およびCCND1(サイクリンD1)およびEGFR癌遺伝子の活性化が含まれ、細胞周期チェックポイント機能の障害、異常な増殖、および環境発がん物質への曝露に関連する遺伝毒性ストレス下での生存につながります。実際、遺伝的変化は、行動的および環境的危険因子、最も一般的にはタバコおよびアルコールの使用と密接に相互作用します。タバコの煙には、アルコールの主要な代謝物でもあるアセトアルデヒドなどの人間の発がん物質が含まれています。アセトアルデヒドはDNA付加体と鎖間DNA架橋を誘導し、DNA損傷とDNA変異の蓄積と染色体不安定性を引き起こします。過剰な分裂促進刺激と癌遺伝子活性化による異常な増殖を考えると、食道上皮細胞の悪性形質転換は、抗酸化剤の活性化、オートファジー、上皮間葉転換(EMT)などの遺伝毒性ストレスに対処するメカニズムによって促進されます。興味深いことに、これらの細胞保護機能は、高いCD44(CD44H)発現を特徴とし、腫瘍の開始、浸潤、転移、および治療抵抗性の能力を有するESCC癌幹細胞(CSC)においてしばしば活性化される5、6、7。
ESCCは、細胞培養およびげっ歯類モデルでモデル化されています8,9。過去30年間で、ESCCの堅牢な遺伝子操作マウスモデルが開発されました。これらには、CCND1およびEGFRトランスジェニックマウス10、11ならびにp53ならびにp120Ctonノックアウトマウス12、13が含まれる。ただし、単一の遺伝的変化は通常、急速に発症するESCCをもたらすことはありません。この課題は、ESCC14のヒトの遺伝的病変をよく再現する食道発がん物質の使用によって克服されました。例えば、4-ニトロキノリン-1-オキシド(4NQO)は、CCND1トランスジェニックマウスにおけるESCC発生を加速する15。近年、推定される食道上皮幹細胞、前駆細胞、およびそれらのそれぞれの運命が、細胞系譜追跡可能なマウスモデルにおいて研究されている3,4。さらに、これらの細胞系譜追跡可能なマウスは、ESCCの起源の細胞を探索し、そのような細胞が従来の組織学およびオミックスベースの分子特性評価を介してCD44H CSCをどのように生成するかを探索するために利用されています7。
これらのマウスモデルに関連する新たな分野の1つは、元の組織の構造がex vivoで再現される3次元(3D)オルガノイドシステムで生きたESCCおよび前駆細胞を分析するための細胞培養技術の新しい応用です7,8,9。これらの3Dオルガノイドは、原発性および転移性腫瘍(リンパ節、肺、肝臓の病変など)を含むマウス組織から単離された単一細胞懸濁液から急速に増殖します。細胞は基底膜抽出物(BME)に包埋され、明確に定義された無血清細胞培養培地が供給されます。3Dオルガノイドは7〜10日以内に成長し、得られた球状構造は、CSCマーカー、EMT、オートファジー、増殖、分化、アポトーシス細胞死など、さまざまな細胞特性と機能を分析するための継代培養、凍結保存、およびアッセイに適しています。
これらの方法は、頭頸部粘膜(口腔、舌、咽頭、喉頭)や前胃などの層状扁平上皮組織から確立された3Dオルガノイド培養に広く適用できます。頭頸部粘膜は食道と隣接しており、2つの組織は同様の組織組織、機能、および病気に対する感受性を共有しています。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)とESCCの両方が、遺伝的病変と、タバコやアルコール曝露などのライフスタイル関連の環境リスク要因を共有しています。この類似性を強調すると、タバコ煙模倣体4NQOで処理されたマウスは、HNSCCとESCCの両方を容易に発症します。以下に説明するプロトコルをHNSCCのモデリングに簡単に適用できることを考慮して、これらの病変から3Dオルガノイド培養を確立するための具体的な手順が含まれています。
ここでは、4NQOで治療されたマウスで発生する正常、腫瘍前、およびESCC病変を表すマウス食道3Dオルガノイド(MEO)を生成するための詳細なプロトコルを提供します。C57BL/6などの一般的な実験株や、細胞系譜追跡可能なその他の遺伝子操作された誘導体など、さまざまなマウス系統を利用することができます。正常または罹患したマウス食道上皮の単離、単一細胞懸濁液の調製、増殖する3Dオルガノイドの培養とモニタリング、継代培養、凍結保存、形態やその他のアプリケーションを含むその後の分析のための処理など、重要なステップを強調しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe without needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>212361A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>NO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% ethylene propylene glycol</td>
			<td>SK picglobal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL, final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026406</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td>Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5&#8211;5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Stock concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432002</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G7-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor bead bath (or water bath)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89409-222</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>71142841</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane extract (BME)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Minispin</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1mg</td>
			<td>Stock concentration 500 ng/&#181;L, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval ST 16R centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-285-562 PM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids

食道扁平上皮癌(ESCC)は世界中で蔓延しており、毎年すべての食道癌症例の90%を占め、すべてのヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です。ESCCの開始と発達に伴う分子変化の定義における最近の進歩にもかかわらず、患者の予後は依然として不良です。これらの分子変化の機能アノテーションは必要な次のステップであり、ESCCの分子的特徴を捉え、機能アノテーションのために簡単かつ安価に操作できるモデルが必要です。タバコ煙模倣体4-ニトロキノリン1-オキシド(4NQO)で治療されたマウスは、予想通りESCCおよび食道前腫瘍を形成する。注目すべきことに、4NQO病変は口腔、最も一般的には舌、および前胃にも発生し、これらはすべて層状扁平上皮を共有しています。ただし、これらのマウスは、同質遺伝子マウスモデルの生成に時間とリソースを大量に消費するため、機能仮説検証のために単純に操作することはできません。ここでは、マウスESCCまたは前腫瘍細胞を ex vivoで特徴付けるために、4NQOで処理したマウスから単一細胞由来の3次元(3D)オルガノイドを生成することにより、この制限を克服します。これらのオルガノイドは、ESCCおよび食道前新生物の顕著な特徴を捉え、安価かつ迅速に活用して同質モデルを形成することができ、同系移植実験に利用することができます。正常、腫瘍前、およびSCCマウス食道組織から3Dオルガノイドを生成し、これらのオルガノイドを維持および凍結保存する方法を示します。これらの汎用性の高いオルガノイドの用途は幅広く、遺伝子操作マウスの利用、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によるさらなる特性評価、CRISPR技術を使用した同系オルガノイド株の生成、薬物スクリーニングまたは同系移植が含まれます。このプロトコルで実証された技術の広範な採用は、ESCCの深刻な負担と戦うためのこの分野の進歩を加速すると信じています。

このプロトコルは、飲料水中で16週間の4NQO投与からなる特定の治療レジメンに従って、4NQO処置マウスからの正常な食道組織またはESCC腫瘍組織からマウス食道オルガノイド(MEO)を生成するプロセスを説明し、続いて10週間から12週間の観察期間を投与する(図1)。次に、マウスを安楽死させて舌または食道組織の解剖を行います(図2 および <strong class="x...

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Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

食道扁平上皮癌、ESCCは致命的であり、世界中で蔓延しています。3次元オルガノイドは、ESCCの厳しい負担と戦うための分野の進歩を加速するために利用することができます。4NQOで処理したマウスのシングルセル由来3Dオルガノイドは、ESCCの開始と発生に伴う分子変化の機能的アノテーションのために、容易かつ安価に操作することができます。このモデルは、変異原誘発腫瘍の遺伝的不均一性を捉えています。したがって、これらのオルガノイドは、新しい治療戦略をテストしたり、腫瘍形成を促進する顕著な遺伝的変化を特定したりするための生理学的に関連するプラットフォームを提供します。動物の解剖と臓器採取のデモンストレーションを手伝うのはスタッフアソシエイトの冨田康人であり、パラフィン包埋手順のためのオルガノイドの準備を実演するのは私の研究室のポスドク研究員である松浦典弘です。まず、中腹部の毛皮をつまんで外科用ハサミを使用して安楽死させたマウスの皮膚を開き、下腹部からあごまで頭蓋尾の腹側正中線切開を行います。正中線切開から始めて、マウスの両側の手足まで伸びる放射状の切り込みを入れ、皮膚フラップを膨らませて開きます。解剖ハサミを使用して頸管気管を露出させるには、正中線で唾液腺を分割します。胸部気管を露出させるには、胸骨を取り除きます。鉗子で腹膜をそっとつまんで持ち上げ、ハサミを使って腹膜を頭蓋尾側に分割します。胸郭に沿って横方向に。横隔膜の尾面から肝臓を静かに引っ込め、はさみを使用して、胸骨の切り欠き、特に剣状突起の背側表面で横隔膜を小さく切開します。胸郭が胸部内容物から分離したら、横隔膜の切開部にハサミを挿入し、胸骨の背側に密着している頸帯を頭蓋的に解剖して、下の臓器への損傷を防ぎます。ハサミを使用して胸骨の両側の肋骨を切り、胸骨を取り除きます。腹部食道を露出させるには、鉗子で前庭を持って胃を前方にそっと持ち上げます。ハサミを使用して、胃と食道から脾臓、膵臓、腸間膜を解剖します。胸部食道を露出させるには、気管を甲状腺軟骨まですぐにそっと持ち上げ、虹彩ハサミを使用して気管の背側の食道を解剖します。甲状腺軟骨の気管を虹彩ハサミで分割します。気管を尾方向に慎重に解剖して、食道の残りの部分から引き剥がします。肺、心臓、胸腺を気管と一緒に完全に取り除きます。幽門の胃をハサミで分けます。鉗子で前庭を保持し、頭蓋骨を解剖することによって食道を椎骨から分離します。食道を甲状腺軟骨のレベルで分割し、食道と胃を完全に収穫します。噴門で食道を分割して胃と食道を分離し、食道の外面の筋膜を解剖します。組織学用のサンプルを予約するには、ハサミで縦方向に分割します。残りの無傷の食道と冷たいPBSを氷の上に置きます。より大きな湾曲に沿って胃を開き、PBSで十分に洗います。前胃を分離し、冷たいPBSで洗います。舌を収穫するには、ピン留めされた針を鼻から外し、ピンセットで舌を引き抜きます。舌をできるだけ長く切り、氷の上の冷たいPBSに入れます。解離した組織を培養皿に移した後、鉗子を使用して上皮から筋肉層を慎重に取り除きます。上皮を500マイクロリットルの0.25%トリプシンを含む微小遠心チューブに移し、サーモミキサーで摂氏37度、800rpmで10分間インキュベートします。短時間遠心分離した後、50ミリリットルの円錐管に保持した100マイクロメートルのセルストレーナーに細胞懸濁液を円運動で移し、次に3ミリリットルの大豆トリプシンインヒビター(STI)を円運動でストレーナーに通して洗浄し、1ミリリットルのツベルクリンシリンジプランジャーのベースでストレーナーをこすり、細胞を押し込みます。ストレーナーを3ミリリットルのPBSで3〜5回洗浄し、洗浄の合間にシリンジのベースでストレーナーをこすります。遠心分離によって細胞をペレット化した後、再懸濁のためにチューブに1ミリリットルの溶液を残して上清を除去します。ペレットが再懸濁されたら、細胞懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して新しい50ミリリットルの円錐管に移します。チューブを再度遠心分離した後、ペレットを100マイクロリットルのマウスオルガノイド培地(MOM)に再懸濁し、自動細胞カウントを実行します。プレート5, 000の生細胞を75%基底膜抽出物、またはBME、およびMOMに1ウェルあたり50マイクロリットルの総容量で。200マイクロリットルのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けて、各ウェルの中央に50マイクロリットルの液滴をゆっくりと追加します。BMEを摂氏37度のインキュベーター内で30分間固化させ、二酸化炭素を5%、相対湿度を95%にします。インキュベーション後、ウェルあたり500マイクロリットルのMOMを慎重に加えます。3日目または4日目にMOMを交換し、その後2〜3日ごとに通過の準備ができるまで交換します。解凍したBMEを氷の上に置き、MOMを0.05%トリプシン、およびSTIを摂氏37度に予熱してから使用してください。ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、上清と一緒にBMEドーム内のオルガノイドを収集し、上下にピペッティングしてBMEを破壊します。短時間の遠心分離によってオルガノイドペレットを得た後、それが取り除かれたら、500マイクロリットルの0.05%トリプシンに再懸濁します。チューブをサーモミキサーで摂氏37度、800rpmで10分間インキュベートします。600マイクロリットルのSTIでトリプシンを不活性化します。遠心分離して上清を廃棄した後、細胞ペレットを100マイクロリットルのMOMに再懸濁します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。オルガノイドを固定するには、ペレットを静かに取り除き、摂氏4度で一晩300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドに再懸濁します。次に、マイクロ遠心チューブラックを反転させ、その表面を天井フィルムのシートで覆い、対応するオルガノイドIDでラベル付けすることにより、埋め込み面を準備します。PBS洗浄したオルガノイドペレットで除去したパラホルムアルデヒドを、チューブの側面に50マイクロリットルの寒天を加えて慎重に重ねます。この手順を繰り返します。ペレットを乱すことなく、寒天ゲル液滴中のペレットを包埋面の天井フィルムに移し、摂氏4度で45分間固化させる。鉗子を使用して、固化したオルガノイドペレットを含む液滴を標識された病理カセットに注意深く移します。正常なマウス食道舌および前胃オルガノイドを明視野イメージングおよび組織学的染色により形態学的に解析した。4NQO治療マウスの食道扁平上皮癌は、核異型と突然の角質化を示しました。継代培養時のオルガノイド形成率を測定して評価したオルガノイドの自己複製能は、成熟オルガノイドの増殖性バサロイド細胞の減少を反映して時間関数として形成速度が低下することを示した。オルガノイドの成長速度論は、さまざまな時点での形態によって明らかにされています。オルガノイドの内核の角質化は、10日目までに顕著になります。増殖性基底細胞は、14日目および21日目の時点でも、最も外側の細胞層に留まる。4NQO未処理マウスから作製した正常マウス舌オルガノイドの集団倍増曲線は、複数回の継代および長期培養で着実な成長を示しています。オルガノイドは、新規治療標的を特定するためのハイスループットスクリーニング、特定の遺伝子機能を調べるためのCRISPRベースの編集、または腫瘍微小環境におけるどの相互作用が形質転換に影響を与えるかを定義するための共培養のためのプラットフォームです。この技術により、空気消化管扁平上皮癌の生物学における部分EMTやHPV感染などの現象や免疫系との相互作用を調べることができました。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

舌の細胞外マトリックスと舌扁平上皮癌生体外の再構成の作製

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...