Name: modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

기술 지원을 위해 컬럼비아 대학교 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 공유 리소스(유세포 분석, 분자 병리학, 공초점 및 특수 현미경)에 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Alan Diehl 박사, Adam J. Bass, Kwok-Kin Wong 박사(NCI P01 식도 발암 메커니즘)와 Rustgi 및 Nakagawa 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 다음 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: P01CA098101(HN 및 AKR), R01DK114436(HN), R01AA026297(HN), L30CA264714(SF), DE031112-01(FMH), KL2TR001874(FCC), 3R01CA255298-01S1(JG), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (CL), R01DK132251 (CL), R01DE031873 (CL), P30DK132710 (CM 및 HN) 및 P30CA013696 (AKR). HN과 CL은 Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award를 수상했습니다. HN은 Fanconi Anemia Research Fund Award를 수상했습니다. FMH는 Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME)와 American Association for Cancer Research Award를 수상했습니다. J.G.는 미국 위장병 학회 (AGA) 상을 수상했습니다.

쥐 실험은 규정 및 동물 프로토콜 #AABB1502에 따라 계획되고 수행되었으며 Columbia University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 마우스는 마우스의 인도적 치료를 보장하고 마우스에 대한 적절한 수의학적 치료와 실험실 직원을 위한 실험실 안전 교육을 제공하는 적절한 동물 관리 시설에 수용되었습니다.
1. 생쥐를 4NQO로 처리하여 식도 IEN 및 ESCC ?...

<ol>
	<li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+carcinoma.">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li><li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+cancers:+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics.">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li><li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+keratin+15++esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration.">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li><li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population.">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li><li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression.">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li><li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance.">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li><li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma.">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).</li><li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine.">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li><li>Sachdeva, U. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer.">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li><li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene.">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li><li>Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice.">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li><li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing.">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li><li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity.">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li><li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium.">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy.">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).</li><li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoids:+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers.">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells.">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니...

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K153 및 CD734와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉진 미세 환경을 조성하는 상피하 구획 내의 조직 리모델링을 표시합니다.
ESCC의 발병기전은 유전적 변화와 환경적 위험 요인에 대한 노출을 포함합니다. 주요 유전적 병변에는 종양 억제 유전자 TP53 및 CDKN2A(p16INK4A)의 비활성화와 CCND1(사이클린 D1) 및 EGFR 종양 유전자의 활성화가 포함되며, 이는 세포 주기 체크포인트 기능 장애, 비정상적인 증식 및 환경 발암 물질에 대한 노출과 관련된 유전독성 스트레스 하에서의 생존을 초래합니다. 실제로 유전 적 변화는 행동 및 환경 적 위험 요소, 가장 일반적으로 담배 및 알코올 사용과 밀접하게 상호 작용합니다. 담배 연기에는 알코올의 주요 대사 산물이기도 한 아세트알데히드와 같은 인체 발암 물질이 포함되어 있습니다. 아세트알데히드는 DNA 부가물과 가닥 간 DNA 가교를 유도하여 DNA 손상과 DNA 돌연변이 및 염색체 불안정성의 축적을 유발합니다. 과도한 유사분열 자극과 종양유전자 활성화로 인한 비정상적인 증식이 주어지면 식도 상피 세포의 악성 형질전환은 항산화제, 자가포식 및 상피-중간엽 전이(EMT)의 활성화를 포함하여 유전독성 스트레스에 대처하는 메커니즘에 의해 촉진됩니다. 흥미롭게도, 이러한 세포 보호 기능은 높은 CD44 (CD44H) 발현을 특징으로하고 종양 개시, 침윤, 전이 및 치료 저항성의 능력을 갖는 ESCC 암 줄기 세포 (CSC)에서 종종 활성화된다 5,6,7.
ESCC는 세포 배양 및 설치류 모델 8,9에서 모델링되었습니다. 지난 삼십 년 동안 ESCC의 강력한 유전자 조작 마우스 모델이 개발되었습니다. 이들은 CCND1 및 EGFR 형질전환 마우스 10,11 및 p53 및 p120 Ctn 녹아웃 마우스 12,13을 포함한다. 그러나 단일 유전적 변화는 일반적으로 빠른 발병 ESCC를 초래하지 않습니다. 이 문제는 ESCC14에서 인간 유전적 병변을 잘 요약하는 식도 발암 물질을 사용하여 극복되었습니다. 예를 들어, 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)는 CCND1 형질전환 마우스에서 ESCC 발달을 가속화한다15. 최근 몇 년 동안, 추정되는 식도 상피 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 각각의 운명이 세포 계통 추적 가능한 마우스 모델에서 조사되었습니다 3,4. 또한, 이들 세포계통 추적가능 마우스는 기존의 조직학 및 오믹스 기반 분자 특성 분석을 통해 ESCC의 기원 세포와 이러한 세포가 어떻게 CD44H CSC를 생성하는지 탐색하는 데 활용되어 왔다7.
이러한 마우스 모델과 관련된 새로운 영역 중 하나는 원래 조직의 구조가 생체 외에서 요약되는 3차원(3D) 오가노이드 시스템에서 살아있는 ESCC 및 전구체 세포를 분석하기 위한 세포 배양 기술의 새로운 적용입니다(7,8,9). 이러한 3D 오가노이드는 원발성 및 전이성 종양(예: 림프절, 폐 및 간 병변)을 포함한 쥐 조직에서 분리된 단일 세포 현탁액에서 빠르게 성장합니다. 세포는 기저막 추출물(BME)에 묻혀 잘 정의된 무혈청 세포 배양 배지를 공급합니다. 3D 오가노이드는 7-10일 이내에 성장하며, 생성된 구형 구조는 CSC 마커, EMT, 자가포식, 증식, 분화 및 세포사멸 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 특성 및 기능을 분석하기 위한 계대 배양, 냉동 보존 및 분석에 적합합니다.
이러한 방법은 두경부 점막(구강, 혀, 인두 및 후두) 및 심지어 전위와 같은 모든 층화된 편평 상피 조직에서 확립된 3D 오가노이드 배양에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 두경부 점막은 식도와 인접해 있으며 두 조직은 유사한 조직 조직, 기능 및 질병에 대한 감수성을 공유합니다. 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)과 ESCC는 모두 유전적 병변과 담배 및 알코올 노출과 같은 생활 습관 관련 환경 위험 요소를 공유합니다. 이러한 유사성을 강조하면서, 담배 연기 모방체 4NQO로 처리된 마우스는 HNSCC와 ESCC 모두를 쉽게 발달시킨다. 아래에 설명된 프로토콜이 HNSCC 모델링에 쉽게 적용될 수 있다는 점을 감안할 때 이러한 병변에서 3D 오가노이드 배양을 설정하기 위한 특정 지침이 포함되어 있습니다.
여기에서 우리는 4NQO로 치료된 마우스에서 발생하는 정상, 전종양 및 ESCC 병변을 나타내는 쥐 식도 3D 오가노이드(MEO)를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. C57BL/6과 같은 일반적인 실험실 균주, 세포 계통 추적 가능 및 기타 유전자 조작 유도체를 포함하여 다양한 마우스 균주를 활용할 수 있습니다. 우리는 정상 또는 병에 걸린 쥐 식도 상피의 분리, 단일 세포 현탁액의 준비, 성장하는 3D 오가노이드의 배양 및 모니터링, 계대 배양, 냉동 보존, 형태학 및 기타 응용 분야를 포함한 후속 분석을 위한 처리를 포함한 주요 단계를 강조합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe without needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>212361A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>NO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% ethylene propylene glycol</td>
			<td>SK picglobal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL, final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026406</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td>Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5&#8211;5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Stock concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432002</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G7-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor bead bath (or water bath)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89409-222</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>71142841</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane extract (BME)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Minispin</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1mg</td>
			<td>Stock concentration 500 ng/&#181;L, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval ST 16R centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-285-562 PM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.

이 프로토콜은 음용수로 투여된 16주간의 4NQO와 10주에서 12주간의 관찰 기간으로 구성된 특정 치료 요법에 따라 4NQO 처리된 마우스의 정상 식도 조직 또는 ESCC 종양 조직에서 쥐 식도 오가노이드(MEO)를 생성하는 과정을 설명합니다(그림 1). 그런 다음 마우스는 혀 또는 식도 조직의 해부를 위해 안락사됩니다(그림 2 및 그림 3). 우리?...

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Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 치명적이며 전 세계적으로 널리 퍼져 있습니다. 3차원 오가노이드는 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 현장의 진행을 가속화하는 데 활용될 수 있습니다. 4NQO로 처리된 마우스의 단일 세포 유래 3D 오가노이드는 ESCC 개시 및 개발에 수반되는 분자 변화의 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있습니다.이 모델은 돌연변이원 유발 종양의 유전적 이질성을 포착합니다. 따라서 이러한 오가노이드는 새로운 치료 전략을 테스트하거나 종양 형성을 유발하는 두드러진 유전적 변화를 식별하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 동물 해부 및 장기 수집을 시연하는 데 도움을 주는 것은 직원 동료인 Yasuto Tomita가 될 것이며, 파라핀 포매 절차를 위한 오가노이드 준비를 시연하는 것은 제 실험실의 박사후 연구원인 Norihiro Matsuura가 될 것입니다.시작하려면 복부 중간 털을 꼬집고 수술 용 가위를 사용하여 안락사 된 생쥐의 피부를 열고 하복부에서 턱까지 두개골, 복부 정중선을 절개합니다. 정중선 절개에서 시작하여 마우스 양쪽의 팔다리까지 방사형 절단을하고 피부 플랩을 팽창시킵니다. 자궁 경부 기관을 노출시키기 위해 해부 가위를 사용하여 정중선에서 타액선을 나눕니다.흉부 기관을 노출시키려면 흉골을 제거하십시오. 집게로 복막을 부드럽게 꼬집고 들어 올리고 가위를 사용하여 복막을 두개골로 나눕니다. 그리고 흉곽을 따라 측면으로.횡격막의 꼬리 표면에서 간을 부드럽게 수축시키고 가위를 사용하여 흉골 노치, 특히 xiphoid process의 등쪽 표면에서 횡격막에 작은 절개를합니다. 흉곽이 흉부 내용물에서 분리되면 횡격막의 절개 부위에 가위를 삽입하고 흉골의 등쪽 표면에 밀착 된 자궁 경부 거들을 두개골로 해부하여 아래 장기의 손상을 방지합니다. 가위를 사용하여 흉골 양쪽의 갈비뼈를 자르고 흉골을 제거합니다.복부 식도를 노출시키려면 집게로 앞쪽을 잡고 위를 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 위와 식도에서 비장, 췌장 및 장간막을 해부합니다. 흉부 식도를 노출시키려면 즉시 갑상선 연골에 꼬리가 있는 기관을 부드럽게 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 기관 등쪽의 식도를 해부합니다.홍채 가위로 갑상선 연골의 기관을 나눕니다. 식도의 나머지 부분을 꼬리 방향으로 조심스럽게 해부하여 기관을 떼어냅니다. 기관과 함께 폐, 심장 및 흉선을 모두 제거하십시오.가위로 유문에서 위를 나눕니다. 집게로 antrum을 잡고 두개골로 해부하여 식도를 척추에서 분리하십시오. 갑상선 연골 수준에서 식도를 나누고 식도와 위를 모두 수확하십시오.심장에서 식도를 나누어 위와 식도를 분리하고 식도 외부 표면의 근막을 해부합니다. 조직학을 위해 샘플을 예약하려면 가위로 세로로 나눕니다. 남아있는 온전한 식도와 차가운 PBS를 얼음 위에 놓습니다.더 큰 곡률을 따라 위를 열고 PBS로 충분히 씻으십시오. 앞위를 분리하고 차가운 PBS로 씻으십시오. 혀를 수확하려면 코에서 고정 바늘을 제거하고 핀셋으로 혀를 빼냅니다.혀를 가능한 한 길게 자르고 얼음 위의 차가운 PBS에 넣으십시오. 해리 된 조직을 배양 접시에 옮긴 후 집게를 사용하여 상피에서 근육층을 조심스럽게 제거하십시오. 상피를 0.25% 트립신 500마이크로리터가 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 37도 및 800rpm에서 10분 동안 열혼합기에서 배양합니다.간단한 원심 분리 후, 원형 운동을 사용하여 넓은 구멍 팁이있는 50 밀리리터 원추형 튜브에 보관 된 100 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 옮긴 다음 3 밀리리터의 대두 트립신 억제제 또는 STI를 원을 그리며 스트레이너를 통해 세척 한 다음 1 밀리리터 투베르쿨린 주사기 플런저의 바닥으로 스트레이너를 문질러 세포를 밀어 넣습니다. 3 밀리리터의 PBS로 여과기를 3-5 회 세척하고, 세척 사이에 주사기 바닥으로 여과기를 문지릅니다. 원심분리에 의해 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 제거하고 재현탁을 위해 튜브에 1밀리리터의 용액을 남깁니다.펠릿이 다시 현탁되면 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 다시 원심분리한 후 펠릿을 100마이크로리터의 마우스 오가노이드 배지(MOM)에 재현탁하고 자동 세포 계수를 수행합니다. 플레이트 5, 75 % 기저 막 추출물 또는 BME의 000 개의 생존 세포 및 웰 당 50 마이크로 리터의 총 부피를 갖는 MOM.200마이크로리터 광경 팁을 사용하여 팁과 웰의 바닥 또는 측면 사이의 접촉을 피하면서 각 웰의 중앙에 50마이크로리터 물방울을 천천히 추가합니다. BME가 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소 및 95% 상대 습도로 30분 동안 응고되도록 합니다. 배양 후 웰 당 500 마이크로 리터의 MOM을 조심스럽게 첨가하십시오.3 일 또는 4 일에 엄마를 바꾸고, 그 후 2-3 일마다 통과 할 준비가 될 때까지 교체하십시오. 해동된 BME를 얼음 위에 보관하고 MOM, 0.05% 트립신 및 STI를 섭씨 37도까지 예열한 후 사용하십시오. 광구경 마이크로피펫 팁을 사용하여 상층액과 함께 BME 돔의 오가노이드를 수집하고 위아래로 피펫팅하여 BME를 방해합니다.간단한 원심분리로 오가노이드 펠릿을 얻은 후 제거되면 0.05% 트립신 500마이크로리터에 재현탁합니다. 섭씨 37도 및 800rpm의 열 혼합기에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 600 마이크로 리터의 STI로 트립신을 비활성화하십시오.원심분리하고 상층액을 버린 후, 세포 펠릿을 100 마이크로리터의 MOM에 재현탁시킨다. 트리판 블루 배제를 통해 자동 세포 계수를 수행합니다. 오가노이드를 고정하려면 펠릿을 부드럽게 제거하고 섭씨 4도에서 밤새 4%파라포름알데히드 300마이크로리터에 재현탁합니다.다음으로, 미세 원심분리기 튜브 랙을 뒤집고 표면을 천장 필름 시트로 덮어 매립 표면을 준비한 다음 해당 오가노이드 ID로 레이블을 지정합니다. PBS로 세척한 오가노이드 펠릿에서 제거된 파라포름알데히드를 튜브 측면에 50마이크로리터의 한천을 추가하여 조심스럽게 오버레이합니다. 이 단계를 반복합니다.펠릿을 방해하지 않고 한천 겔 방울의 펠릿을 매립 표면의 천장 필름으로 옮겨 섭씨 4도에서 45 분 동안 응고시킵니다. 집게를 사용하여 응고된 오가노이드 펠릿이 들어 있는 액적을 라벨이 붙은 병리학 카세트에 조심스럽게 옮깁니다. 정상 쥐 식도 혀 및 전위 오가노이드를 명시야 이미징 및 조직학적 염색에 의해 형태학적으로 분석하였다.4NQO 처리된 마우스의 식도 편평 세포 암종은 핵 이형성과 갑작스러운 각질화를 나타냈습니다. 계대 배양 시 오가노이드 형성 속도를 결정하여 평가한 오가노이드의 자가 재생 능력은 성숙한 오가노이드에서 감소된 증식성 기저 세포를 반영하여 형성 속도가 시간의 함수로 감소하는 것으로 나타났습니다. 오가노이드의 성장 동역학은 다양한 시점에서 형태에 의해 드러납니다.오가노이드 내핵의 각질화는 10일째에 두드러집니다. 증식성 기저세포는 14일째 및 21일째 시점에서도 가장 바깥쪽 세포층에 남아 있습니다. 4NQO를 처리하지 않은 마우스에서 생성된 정상 마우스 혀 오가노이드의 개체군 배가 곡선은 여러 계대 및 장기 배양에 걸쳐 꾸준한 성장을 보여줍니다.오가노이드는 새로운 치료 표적을 식별하기 위한 고처리량 스크리닝, 특정 유전자 기능을 조사하기 위한 CRISPR 기반 편집 또는 종양 미세 환경에서 어떤 상호 작용이 형질전환에 영향을 미치는지 정의하기 위한 공동 배양을 위한 플랫폼입니다. 이 기술을 통해 우리는 공기 소화관 편평 세포 암의 생물학에서 면역 체계와의 상호 작용과 함께 부분 EMT 및 HPV 감염과 같은 현상을 조사할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

연구

암 연구학

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...