Name: modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

Vi takker de delte ressursene (flowcytometri, molekylær patologi og konfokal og spesialisert mikroskopi) ved Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University for teknisk støtte. Vi takker Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass og Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) og medlemmer av Rustgi og Nakagawa laboratorier for nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av følgende NIH Grants: P01CA098101 (H.N. og A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. og H.N.) og P30CA013696 (A.K.R.). H.N. og C.L. er mottakere av Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. er mottaker av Fanconi Anemia Research Fund Award. FMH er mottaker av The Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) og en American Association for Cancer Research Award. J.G. er mottaker av American Gastroenterological Association (AGA)-prisen.

Murine forsøkene ble planlagt og utført i samsvar med forskrifter og under dyreprotokoll #AABB1502, gjennomgått og godkjent av Columbia University's Institutional Animal Care and Use Committee. Musene ble plassert på et skikkelig dyrepleieanlegg som sikrer human behandling av mus og gir passende veterinærpleie for musene og laboratoriesikkerhetsopplæring for laboratoriepersonellet.
1. Behandling av mus med 4NQO for å indusere esophageal IEN og ESCC lesjoner (tidsvurdering: opptil ...

<ol>
	<li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+carcinoma.">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li><li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squamous+cell+cancers:+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics.">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li><li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+keratin+15++esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration.">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li><li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population.">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li><li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression.">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li><li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance.">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li><li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma.">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).</li><li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine.">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li><li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids.">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue,+esophagus+and+forestomach.">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li><li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation,+migration,+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo.">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li><li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer.">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li><li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene.">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li><li>Tang, X. -. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice.">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li><li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis.">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia.">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440 (2021).</li><li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system:+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells.">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224 (2013).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis.">TGF-&#946;1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li><li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing.">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li><li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity.">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li><li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium.">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy.">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).</li><li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoids:+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers.">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells.">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li></ol>

Det er flere kritiske trinn og hensyn til generering og analyse av MEOer i protokollene beskrevet her. For å sikre reproduserbarhet og strenghet i MEO-eksperimenter er både biologiske og tekniske replikater viktige. For biologiske replikater er to til tre uavhengige mus som bærer ESCC generelt tilstrekkelig per eksperimentell tilstand. Imidlertid kan riktig antall biologiske replikater variere avhengig av parametrene som skal testes i individuelle studier. For eksempel er det foreløpig ukjent hvor tidlig og hvor ofte...

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er den dødeligste av humane plateepitelkarsinomer, på grunn av sin sene diagnose, terapiresistens og metastase 1,2. ESCC oppstår fra det stratifiserte plateepitelet, som strekker den luminale overflaten av spiserøret. Det plateepitelet består av proliferative basale celler og differensierte celler i det suprabasale cellelaget. Under fysiologiske forhold uttrykker basalceller markører som p63, Sox2 og cytokeratin K5 og K14, mens differensierte celler uttrykker K4, K13 og IVL. Basalcellene i seg selv er heterogene og inkluderer antatte stamceller definert av markører som K15,3 og CD734. I homeostase gjennomgår basale celler postmitotisk terminal differensiering innenfor det suprabasale cellelaget, mens differensierte celler migrerer og desquamate inn i lumen for å fullføre epitelfornyelse. ESCC minner om deres opprinnelsesceller, og viser plateepiteldifferensiering i varierende grad. ESCC ledsages ofte av multifokale histologiske forløperlesjoner, kjent som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, som omfatter atypiske basaloidceller. I tillegg til epitelforandringer viser ESCC vevsremodellering i subepitelrommet, hvor aktivering av kreftassosierte fibroblaster (CAF) og rekruttering av immun / inflammatoriske celler finner sted for å fremme det tumorfremmende mikromiljøet.
Patogenesen til ESCC innebærer genetiske endringer og eksponering for miljørisikofaktorer. Viktige genetiske lesjoner inkluderer inaktivering av tumorsuppressorgenene TP53 og CDKN2A (p16INK4A) og aktivering av CCND1 (cyklin D1) og EGFR-onkogener, som kulminerer i nedsatt cellesykluskontrollpunktfunksjon, avvikende proliferasjon og overlevelse under genotoksisk stress relatert til eksponering for miljøkreftfremkallende stoffer. Faktisk samhandler genetiske endringer tett med atferdsmessige og miljømessige risikofaktorer, oftest tobakk og alkoholbruk. Tobakksrøyk inneholder humane kreftfremkallende stoffer som acetaldehyd, som også er hovedmetabolitten av alkohol. Acetaldehyd induserer DNA-addukter og interstrand DNA-kryssbindinger, noe som fører til DNA-skade og akkumulering av DNA-mutasjoner og kromosomal ustabilitet. Gitt overdreven mitogen stimuli og avvikende proliferasjon fra onkogenaktivering, blir den ondartede transformasjonen av esophageal epitelceller lettere av mekanismer for å takle genotoksisk stress, inkludert aktivering av antioksidanter, autofagi og epitel-mesenkymal overgang (EMT). Interessant nok aktiveres disse cytoprotektive funksjonene ofte i ESCC-kreftstamceller (CSC) som er preget av høyt CD44 (CD44H) uttrykk og har evnen til tumorinitiering, invasjon, metastase og terapiresistens 5,6,7.
ESCC har blitt modellert i cellekultur og i gnagermodeller 8,9. I løpet av de siste tre tiårene har robuste genmodifiserte musemodeller av ESCC blitt utviklet. Disse inkluderer CCND1 og EGFR transgene mus 10,11 og p53 og p120Ctn knockout mus 12,13. Imidlertid resulterer enkle genetiske endringer vanligvis ikke i raskt innsettende ESCC. Denne utfordringen har blitt overvunnet med bruk av esophageal carcinogens som rekapitulerer godt de menneskelige genetiske lesjonene i ESCC14. For eksempel akselererer 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) ESCC-utvikling i CCND1 transgene mus15. I de senere år har antatte esophageal epitelial stamceller, stamceller og deres respektive skjebner blitt undersøkt i celleavstamningssporbare musemodeller 3,4. Videre har disse celleavstamningssporbare musene blitt brukt til å utforske opprinnelsescellene til ESCC og hvordan slike celler gir opphav til CD44H CSC via konvensjonell histologi og omics-basert molekylær karakterisering7.
Et fremvoksende område relatert til disse musemodellene er den nye anvendelsen av cellekulturteknikker for å analysere levende ESCC og forløperceller i et tredimensjonalt (3D) organoidsystem der arkitekturen til det opprinnelige vevet rekapituleres ex vivo 7,8,9. Disse 3D-organoider vokser raskt fra en enkeltcellesuspensjon isolert fra murine vev, inkludert primære og metastaserende svulster (f.eks. Lymfeknute, lunge og leverskader). Cellene er innebygd i kjellermembranekstrakt (BME) og matet med et veldefinert serumfritt cellekulturmedium. 3D-organoidene vokser innen 7-10 dager, og de resulterende sfæriske strukturer er egnet for subkultur, kryopreservering og analyser for å analysere en rekke cellulære egenskaper og funksjoner, inkludert CSC-markører, EMT, autofagi, spredning, differensiering og apoptotisk celledød.
Disse metodene kan i stor grad brukes på 3D-organoidkulturer etablert fra ethvert stratifisert plateepitelvev, for eksempel hode- og nakkeslimhinnen (munnhule, tunge, svelg og strupehode) og til og med formagen. Hode- og nakkeslimhinnen er sammenhengende med spiserøret, og de to vevene deler lignende vevsorganisasjon, funksjon og følsomhet for sykdom. Både hode- og nakkeplateepitelkarsinom (HNSCC) og ESCC deler genetiske lesjoner og livsstilsrelaterte miljørisikofaktorer som tobakk og alkoholeksponering. For å understreke denne likheten, utvikler mus behandlet med tobakksrøykmimetikken 4NQO lett både HNSCC og ESCC. Gitt hvor enkelt protokollene beskrevet nedenfor kan brukes til modellering av HNSCC, inkluderer vi spesifikke instruksjoner for å etablere 3D-organoidkulturer fra disse lesjonene.
Her gir vi detaljerte protokoller for generering av murine esophageal 3D organoider (MEOs) som representerer normale, preneoplastiske og ESCC lesjoner som utvikler seg hos mus behandlet med 4NQO. Ulike musestammer kan benyttes, inkludert vanlige laboratoriestammer som C57BL / 6 og cellelinjesporbare og andre genetisk konstruerte derivater. Vi legger vekt på de viktigste trinnene, inkludert isolering av normalt eller sykt murine esophageal epitel, fremstilling av encellede suspensjoner, dyrking og overvåking av voksende 3D-organoider, subkultur, kryopreservering og behandling for påfølgende analyser, inkludert morfologi og andre applikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe without needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore micropipette tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>212361A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>NO250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.9% ethylene propylene glycol</td>
			<td>SK picglobal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL, final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51026406</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DietGel 76A</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-07-5022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td>Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5&#8211;5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Stock concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432002</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G7-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate/stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor bead bath (or water bath)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89409-222</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>71142841</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane extract (BME)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Minispin</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620100</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrap</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S37440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-272416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1mg</td>
			<td>Stock concentration 500 ng/&#181;L, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval ST 16R centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>T9128</td>
			<td>Stock concentration 250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-285-562 PM</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling oral-esophageal squamous cell carcinoma in 3d organoids

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er utbredt over hele verden, og står for 90% av alle esophageal cancer tilfeller hvert år, og er den dødeligste av alle humane plateepitelkarsinomer. Til tross for nylige fremskritt i å definere de molekylære endringene som følger med ESCC-initiering og utvikling, er pasientprognosen fortsatt dårlig. Den funksjonelle annotasjonen av disse molekylære endringene er det nødvendige neste trinnet og krever modeller som både fanger de molekylære egenskapene til ESCC og lett og billig kan manipuleres for funksjonell merknad. Mus behandlet med tobakksrøykmimetisk 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) danner forutsigbart ESCC og esophageal preneoplasi. Merk at 4NQO-lesjoner også oppstår i munnhulen, oftest i tungen, så vel som formagen, som alle deler det stratifiserte plateepitelet. Imidlertid kan disse musene ikke bare manipuleres for funksjonell hypotesetesting, da generering av isogene musemodeller er tid- og ressurskrevende. Her overvinner vi denne begrensningen ved å generere enkeltcellederiverte tredimensjonale (3D) organoider fra mus behandlet med 4NQO for å karakterisere murine ESCC eller preneoplastiske celler ex vivo. Disse organoidene fanger de fremtredende egenskapene til ESCC og esophageal preneoplasi, kan billig og raskt utnyttes for å danne isogene modeller, og kan brukes til syngene transplantasjonseksperimenter. Vi demonstrerer hvordan man genererer 3D-organoider fra normalt, preneoplastisk og SCC murine esophageal vev og vedlikeholder og kryokonserverer disse organoider. Anvendelsene av disse allsidige organoidene er brede og inkluderer bruk av genetisk konstruerte mus og videre karakterisering ved flowcytometri eller immunhistokjemi, generering av isogene organoidlinjer ved bruk av CRISPR-teknologier og legemiddelscreening eller syngen transplantasjon. Vi tror at den utbredte adopsjonen av teknikkene demonstrert i denne protokollen vil akselerere fremgangen på dette feltet for å bekjempe den alvorlige byrden av ESCC.

Denne protokollen beskriver prosessen med å generere murine esophageal organoids (MEOs) fra normalt esophageal vev eller ESCC-tumorvev fra 4NQO-behandlede mus i henhold til et spesifikt behandlingsregime bestående av 16 uker med 4NQO administrert i drikkevann, etterfulgt av en 10 ukers til 12 ukers observasjonsperiode (figur 1). Musene avlives deretter for disseksjon av tunge eller spiserørsvev (figur 2 og figur 3). Vi beskriver ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids at JoVE.com

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Denne protokollen beskriver de viktigste trinnene for å generere og karakterisere murine oral-esophageal 3D-organoider som representerer normale, preneoplastiske og plateepitelkarsinomlesjoner indusert via kjemisk karsinogenese.

modellering av oral-esophageal plateepitelkarsinom i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC, er dødelig og utbredt over hele verden. Tredimensjonale organoider kan brukes til å akselerere fremgangen i feltet for å bekjempe den alvorlige byrden av ESCC. Enkeltcellederiverte 3D-organoider fra mus behandlet med 4NQO kan lett og billig manipuleres for funksjonell annotering av molekylære endringer som følger med ESCC-initiering og utvikling.Denne modellen fanger den genetiske heterogeniteten til mutagen-induserte svulster. Derfor gir disse organoidene en fysiologisk relevant plattform for å teste nye terapeutiske strategier eller identifisere de fremtredende genetiske endringene som driver tumorigenese. Å bidra til å demonstrere dyredisseksjon og organsamling vil være Yasuto Tomita, en stabsmedarbeider, og demonstrere forberedelsen av organoid for parafin-embedding prosedyre vil være Norihiro Matsuura, en postdoktor fra laboratoriet mitt.For å begynne, åpne huden til de euthaniserte musene ved å klemme midtbukpelsen og bruke kirurgisk saks, lage et kraniokaudalt, ventral midtlinjesnitt fra underlivet til haken. Start ved midtlinjesnittet, gjør radiale kutt som strekker seg til lemmer på begge sider av musen, oppblås hudklaffene åpne. For å eksponere livmorhalsrøret, ved hjelp av dissekere saks, del spyttkjertlene på midtlinjen.For å avsløre thoracic luftrøret, fjern brystbenet. Klem forsiktig og løft bukhinnen med tang og bruk saks til å dele bukhinnen kraniokaudalt. og lateralt langs ribbeholderen.Trekk leveren forsiktig fra membranens kaudale overflate og bruk saks til å lage et lite snitt i membranen ved sternal hakk, spesielt ved dorsaloverflaten av xiphoidprosessen. Når ribbeholderen er skilt fra thoraxinnholdet, sett saks inn i snittet i membranen og dissekere kranialt til livmorhalsbeltet som fester seg tett til brystbenets dorsale overflate for å unngå skade på organene under. Klipp ribbeina på hver side av brystbenet med saks og fjern brystbenet.For å avsløre bukøsofaguset, løft forsiktig magen anteriort ved å holde antrum med tang. Bruk saks, dissekere milten, bukspyttkjertelen og mesenteri fra mage og spiserør. For å eksponere thorax spiserøret, løft forsiktig luftrøret umiddelbart kaudalt til skjoldbruskkjertelen, og dissekere spiserøret i dorsalsiden av luftrøret ved hjelp av irissaks.Del luftrøret på skjoldbrusk brusk med iris saks. Skrell luftrøret av resten av spiserøret ved å dissekere det forsiktig i kaudalretningen. Fjern lungen, hjertet og thymus helt med luftrøret.Del magen på pylorus med saks. Separat spiserøret fra vertebraen ved å holde antrum med tang og dissekere kranialt. Del spiserøret på nivået av skjoldbruskkjertelen, og høst spiserøret og magen helt.Separat mage og spiserør ved å dele spiserøret ved cardia og dissekere noen fascia på den ytre overflaten av spiserøret. For å reservere en prøve for histologi, del i lengderetningen med saks. Legg gjenværende intakt spiserør og kald PBS på is.Åpne magen langs større krumning og vask med PBS tilstrekkelig. Skill formagen og vask med kald PBS. For å høste tungen, fjern den festede nålen fra nesen og trekk ut tungen med pinsett.Skjær tungen så lenge som mulig og legg den i kald PBS på is. Etter å ha overført det dissosierte vevet til en kulturfat, fjern forsiktig muskellaget fra epitelet ved hjelp av tang. Overfør epitelet til et mikrosentrifugerør inneholdende 500 mikroliter 0,25% trypsin og inkuber i en termomixer i 10 minutter ved 37 grader Celsius og 800 o / min.Etter kort sentrifugering, overfør cellesuspensjonen gjennom en 100 mikrometer cellesil holdt på et 50 milliliter konisk rør med en bred borespiss ved hjelp av sirkulære bevegelser, tilsett deretter 3 ml soyabønnetrypsinhemmer, eller STI, gjennom silen ved hjelp av sirkulære bevegelser for å vaske, og skrubb deretter silen med basen av et 1 milliliter tuberkulinsprøytestempel for å skyve cellene gjennom. Vask silen med 3 ml PBS 3 til 5 ganger, skrubb silen med sprøytebunnen mellom vaskene. Etter pelletering ned cellene ved sentrifugering, fjern supernatanten og etterlater 1 milliliter løsning i røret for re-suspensjon.Når pelleten er resuspendert, overfør cellesuspensjonen gjennom en 70 mikrometer cellesil til et nytt 50 milliliter konisk rør. Etter sentrifugering av røret igjen, resuspendere pelleten i 100 mikroliter museorganoid medium, eller MOM, og utfør en automatisert celletelling. Plate 5, 000 levedyktige celler i 75% kjellermembranekstrakt, eller BME, og MOM med 50 mikroliter totalt volum per brønn.Bruk en spiss på 200 mikroliter med bred boring, tilsett sakte en 50 mikroliters dråpe i midten av hver brønn, og unngå kontakt mellom spissen og bunnen eller sidene av brønnen. La BME størkne i 30 minutter i en inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid og 95% relativ fuktighet. Etter inkubering, tilsett forsiktig 500 mikroliter MOM per brønn.Bytt MOM på dag 3 eller 4, og deretter hver 2. til 3. dag etter det til du er klar for passasje. Hold tint BME på is, forvarm MOM, 0,05% trypsin og STI til 37 grader Celsius før bruk. Bruk en mikropipettespiss med bred boring, samle organoidene i BME-kuppelen sammen med supernatanten og forstyrr BME ved å pipettere opp og ned.Etter å ha oppnådd organoidpelleten ved kort sentrifugering, når den er løsnet, resuspenderes den i 500 mikroliter 0,05% trypsin. Inkuber røret i en termomixer ved 37 grader Celsius og 800 rpm i 10 minutter. Inaktiver trypsinet med 600 mikroliter STI.Etter sentrifugering og kassering av supernatanten, resuspenderes cellepelleten i 100 mikroliter MOM. Utfør en automatisk celletelling ved å prøve panblå ekskludering. For å fikse organoider, løsne pelleten forsiktig og resuspenderes i 300 mikroliter 4% paraformaldehyd over natten ved 4 grader Celsius.Forbered deretter en innebyggingsoverflate ved å invertere et mikrosentrifugerørstativ og dekke overflaten med et ark takfilm, og merk deretter med tilsvarende organoid-id. Legg forsiktig paraformaldehydet fjernet i PBS-vasket organoid pellet ved å tilsette 50 mikroliter agar ned på siden av røret. Gjenta dette trinnet.Uten å forstyrre pelleten, overfør pelleten i agargeldråpen til takfilmen på innebyggingsoverflaten for størkning ved 4 grader Celsius i 45 minutter. Bruk tang, overfør forsiktig dråpen som inneholder den størknede organoidpelleten til en merket patologisk kassett. Normal murine øsofageal tunge og mageorganoider ble analysert morfologisk ved brightfield imaging og histologisk farging.Esophageal squamous cell carcinoma fra en 4NQO-behandlet mus viste nukleær atypi og brå keratinisering. Selvfornyelseskapasiteten til organoider vurdert ved å bestemme organoiddannelseshastigheten ved subkultur viste at dannelseshastigheten avtar som en funksjon av tid som reflekterer reduserte proliferative basaloidceller i de modne organoider. Vekstkinetikken til organoidene avsløres av deres morfologi på forskjellige tidspunkter.Keratinisering av den indre kjernen av organoider blir fremtredende ved dag 10. De proliferative basaloidcellene forblir i det ytterste cellelaget, selv på dag 14 og dag 21 tidspunkter. En populasjonsdoblingskurve av normale musetungeorganoider generert fra 4NQO-ubehandlede mus demonstrerer deres jevne vekst over flere passasjer og langsiktig kultur.Organoider er plattformer for høy gjennomstrømningsscreening for å identifisere nye terapeutiske mål, CRISPR-basert redigering for å forhøre spesifikk genfunksjon eller samkultur for å definere hvilke interaksjoner i tumormikromiljøet som påvirker transformasjon. Denne teknikken har gjort det mulig for oss å undersøke fenomener som delvis EMT- og HPV-infeksjon, sammen med deres interaksjon med immunsystemet i biologien til kreft i aerofordøyelseskanalen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

En modell for perinevral invasjon i Head and Neck Plateepitelkarsinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi Testing i en Spheroid-basert 3D celle kultur modell for hodet og nakken Squamous celle Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrikasjon av tungen ekstracellulær Matrix og rekonstituering tungen Squamous celle Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal vaksinasjon av Squamous celle Carcinoma celler i mus for svulst immun profilering og behandling respons vurdering

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Sammenligne metastatisk klar celle nyrecelle karsinom modell etablert i mus nyre og på kylling chorioallantoic membran

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Flerdimensjonal kokultur system for å modellere lungeplatekarsinom progresjon

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...